Mess-Diffusionskoeffizienten über Zwei-Photonen-Fluorescence Recovery After Photobleaching

Die Multiphotonen-Fluoreszenz. Die Wiederherstellung nach dem Photobleichverfahren lässt sich leicht mit einer frei diffundierenden Probe von Fluoreszenzfarbstoffmolekülen nachweisen. Zunächst wird ein Laserstrahl niedriger Intensität in die Probe geschickt, um ein Referenzniveau an Fluoreszenz aus den D-Molekülen innerhalb des Fokusvolumens des Lasers zu erzeugen.

Als nächstes wird ein kurzer hochintensiver Laserblitz gesendet, der einen Teil der Farbstoffmoleküle innerhalb des Fokusvolumens photobleachiert. Schließlich wird der Laserstrahl auf das vorherige niedrige Intensitätsniveau abgeschwächt und die Fluoreszenz überwacht, während photogebleichte Moleküle nach außen diffundieren und durch noch fluoreszierende Moleküle von außerhalb des Fokusvolumens ersetzt werden. Die resultierende Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Zeitkurve wird analysiert, um den Diffusionskoeffizienten zu erhalten.

Hallo, ich bin Kelly Sullivan vom Labor von Edward Brown am Department of Biomedical Engineering an der University of Rochester. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie eine Multiphotonen-Fluoreszenzwiederherstellung nach dem Photobleaching durchführen können. Wir verwenden diese Technik in unserem Labor, um die Diffusion sowohl in vitro als auch in vivo biologischen Systemen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Stellen Sie zunächst die gewünschte Laserwellenlänge ein und setzen Sie den entsprechenden Filter vor der Photomultiplier-Röhre oder dem PMT ein. Um eine Beschädigung der PCAL-Zelle zu vermeiden, stellen Sie die Laserleistung auf 200 Milliwatt oder weniger ein.

Es gibt zwei Spiegel, die in einer Figur vier stromaufwärts der PCAL-Zelle ausgerichtet sind. Diese Spiegel sind notwendig und ausreichend, um den Laserstrahl durch die PCAL-Zelle auszurichten. Stellen Sie den Spannungsversatz am PCAL-Zellen-Bias-Controller auf Null ein und stellen Sie den Laserweg durch die PCAL-Zelle so ein, dass der Laser in den vorderen und hinteren Fenstern zentriert ist.

Verwenden Sie den Spiegel stromaufwärts in der vierten Abbildung, um den Balken in der vorderen Scheibe zu zentrieren, und den Spiegel stromabwärts in der vierten Abbildung, um den Balken in der hinteren Scheibe zu zentrieren. Stellen Sie nun die Spannung über dem PCAL-Zellkristall auf den Maximalwert ein. Der entsprechende Wert ist wellenlängenabhängig und kann in der Bedienungsanleitung der PCAL-Zelle gefunden werden.

Stellen Sie die Spiegel in Abbildung vier vor der PCAL-Zelle ein, bis die Ausgangsleistung der PCAL-Zelle maximiert ist. Schalten Sie nun die Spannung über den Quarz auf Null und stellen Sie den Spannungsoffset am Bias-Regler ein, um die Ausgangsleistung der PCAL-Zelle zu minimieren. Setzen Sie die auf die PCAL-Zelle einfallende Laserleistung auf den für das Experiment erforderlichen Wert zurück.

Kommen wir nun zum Mikroskop: Verschaffen Sie sich einen guten visuellen Fokus auf eine standardisierte fluoreszierende Probe. Hier verwenden wir fixierte fluoreszierende Pollenkörner. Versiegeln Sie nach dem Fokussieren das Mikroskop und stellen Sie die Laserleistung auf ein geeignetes Niveau für die Abbildung der Probe ein, indem Sie die Spannung über dem PCAL-Zellkristall ändern.

Schalten Sie abschließend das Licht aus und schalten Sie das PMT ein. Starten Sie einen wiederholten Bildscan der standardisierten Probe und stellen Sie die Spiegel hinter der PCAL-Zelle ein, bis ein scharfes Bild der Probe erhalten wird. Schauen wir uns nun die Bestimmung des sicheren Monitors an, der den Fokus der Menschen innerhalb der Stichprobe stärkt.

Für die Zwecke dieses Videos verwenden wir eine Probe eines wässrigen Farbstoffs, die in einer Vertiefung in einem Objektträger gehalten und mit einem Deckglas verschlossen wird. Dämpfen Sie den Laser auf eine geringe, aber vernünftige Leistung, um Fluoreszenz in der Probe zu erzeugen. Versiegeln Sie das Mikroskop und leiten Sie den Ausgang vom PMT auf den Photonenzähler um.

Schalten Sie das Licht aus, schalten Sie das PMT ein und starten Sie einen Punktscan in der Mikroskopsoftware. Stellen Sie den Photonenzähler so ein, dass er über einen Zeitraum integriert, der viel länger ist als die erwartete Fluoreszenzwiederherstellungszeit, und zeichnen Sie eine angemessene Anzahl von Datenpunkten auf. Erhöhen Sie die Leistung und nehmen Sie eine weitere Reihe von Photonenzähldaten.

Erhöhen Sie die Leistung weiter, bis die Zunahme der Photonenzahl deutlich abnimmt. In Bezug auf das Diagramm der Leistungssteigerung zählt der Logarithmus des Photons als Funktion des Logarithmus der Leistung. Jede Abweichung von einer Steigung von zwei deutet auf eine Bleiche hin.

Wählen Sie während des Monitors eine angemessene Monitorleistung, die unter diesem Grenzwert liegt. Bestimmen wir nun die Eingabeparameter für den Mehrkanal-Scaler und den Impulsgenerator. Am Impulsgeber.

Legen Sie die Zeit vor dem Teachen auf ein bis zwei Mal größer als die erwartete halbe Erholungszeit und die Bleichzeit auf ein Zehntel der erwarteten halben Erholungszeit auf dem Scaler fest. Legen Sie die Behälterbreite auf etwa die Hälfte der Bleichdauer fest und legen Sie die Anzahl der Behälter pro Datensatz so fest, dass das Produkt aus der ausgewählten Behälterbreite und den Behältern pro Datensatz größer ist als die erwartete volle Wiederherstellungszeit. Außerdem kehren die Vor- und Bleichzeiten zum Impulsgenerator zurück und setzen die Frequenz der Vor- und Bleichsequenz auf einen Wert, der kleiner ist als der Kehrwert des Produkts aus der Bin-Breite multipliziert mit der Anzahl der Bins pro Datensatz.

Stellen Sie abschließend die Anzahl der Datensätze pro Scan auf dem Skalierer ein, die auf der Signalintensität bei der von Ihnen gewählten Monitorleistung basieren. Stellen Sie nun die Monitorleistung auf ein sicheres Niveau ein und stellen Sie die Bleichleistung auf etwa 200 Milliwatt über dem Bleaching-Cutoff ein, der während des Monitor-Bleaching-Tests festgelegt wurde. Diese Leistungen werden beide als unterschiedliche Spannungen über die Kristalldichtung der Al-Zelle eingestellt, das Mikroskop schaltet das Licht aus.

Schalten Sie das PMT ein. Starten Sie einen Punktscan mit der Imaging-Software. Starten Sie dann den Impulsgenerator und den Scaler.

Um die resultierende Erholungskurve zu analysieren, markieren Sie drei wichtige Punkte. Die Vorfluoreszenz, die Fluoreszenz unmittelbar nach dem Bleichen und die Fluoreszenz am Ende des Datensatzes. Verwenden Sie die Fluoreszenzwerte vor und unmittelbar nach dem Bleichen, um die halbe Erholungszeit besser abschätzen zu können.

Verwenden Sie nun die in den vorherigen Schritten beschriebenen Regeln, um die Werte für die Vorbleiche zu aktualisieren und die Breitendauer zu beginnen. Nehmen Sie eine neue Kurve und fahren Sie mit der Optimierung der Parameter fort, bis die resultierende Kurve ein starkes Ausbleichen und eine sanfte Erholung aufweist. Überprüfen Sie die Anregungssättigung, indem Sie den Logarithmus des Bleichtiefenparameters als Funktion des Logarithmus der Leistung darstellen.

Jede Abweichung von einer Steigung von zwei deutet auf eine Anregungssättigung hin. Wählen Sie eine Bleichstärke, die ein starkes Bleichen ergibt, aber keine Sättigung verursacht. Nachdem die entsprechenden Parameter bestimmt sind, fahren Sie schließlich mit der Multiphotonen-Fluoreszenzwiederherstellung nach dem Photobleaching oder MP FP-Kurven Ihrer interessierenden Probe fort.

Jetzt zeigen wir repräsentative Ergebnisse sowohl der MP-Frap-Rohdaten bei einer normalisierten MP F-Wrapp-Kurve, die an den Teel angepasst wurde, dem Diffusionskoeffizienten, den Rohdaten von MP F Frap, einer starken Bleiche und einer reibungslosen Rückgewinnung. Die vollständige Wiederherstellung wird für die zweite Hälfte der Daten gemeldet, um sie an die Daten anzupassen. Wir normalisieren zunächst die Wiederherstellung auf die durchschnittliche Vorfluoreszenz und führen dann eine nichtlineare Anpassung der gemieteten Quadrate durch.

In Bezug auf das passende Modell. Beide Datensätze wurden in wässrigem Fluorescein und Diffusionskoeffizienten aufgenommen. In Übereinstimmung mit der Literatur haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Multiphotonen-Fluoreszenz-Rückgewinnungsexperiment nach Photobleichung durchführen können.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie Ihre experimentellen Parameter, insbesondere die Bleichdauer und die Bleich- und Überwachungsleistung, sorgfältig auf die im Protokoll definierten sicheren Grenzen einstellen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.