Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Hier sehen wir das Verfahren zur Entnahme von Embryonen. Fliegen aus den Fläschchen in die Röhrchen einer Auffangkammer mit fünf Fässern umfüllen. Stellen Sie dann eine Traubenplatte auf die Kammer und lassen Sie die Fliegen einige Stunden lang Eier legen.

Wenn sich die Embryonen im richtigen Stadium befinden, übertragen Sie sie mit einem Pinsel aus der Traube auf doppeltes Klebeband. Rollen Sie nun die Embryonen aus ihren Kons und richten Sie sie mit ihren Bauchseiten auf einem Agarblock aus. Oben in der Mitte sehen wir einen Objektträger mit einem Rechteck aus Wachs und einem Stück Doppelklebeband. An einem Ende drehen Sie das Doppelklebeband über den Block mit den aufgereihten Embryonen und berühren Sie es mit den Embryonen, um sie auf den Objektträger zu übertragen.

Sie werden jetzt sofort mit der Rückenseite nach oben zeigen. Geben Sie PBS in den Bereich des Objektträgers, der von dem Wachsrechteck umschlossen ist, um die Embryonen zu bedecken. Die obere Seite zeigt eine Seitenansicht der Folie und die untere eine Draufsicht.

Schneiden Sie mit einer Glasdispariernadel einen Schlitz entlang der viel Membran. Stechen Sie die Embryonen in die Hirnregion, heben Sie sie an und schieben Sie sie in Reihen auf das Glas. Sezieren Sie dann jeden Embryo, um ein Filet herzustellen.

Am Ende des Eingriffs haben Sie einen Objektträger mit Reihen von Filetembryonen. Es ist jetzt bereit, es zu reparieren. Hallo, ich bin Peter Lee, ein Poster im Kaizens-Labor in der Abteilung für Biologie am Caltech.

Hallo, ich bin Ashley Wright, eine Caltech-Doktorandin im Kaizens Lab. Ich bin Kaizen, Professor am Caltech und meine Forschungsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung des Nervensystems bei Fruchtfliegen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Präparieren von lebenden Opalembryonen.

Wir haben diese Methoden verwendet, um nach Orphan-Rezeptor-Liganden zu suchen. Wir tun dies, indem wir Ansammlungen von Linien über exprimierenden Zelloberflächenproteinen durch Lebendfärbung von Embryonen mit Rezeptorfusionsproteinen screenen. Wir verwenden dieses Verfahren auch im Labor, um embryonale Phänotypen zu untersuchen und genetische Screenings durchzuführen.

Ich habe ein Defizit-Screening auf motorische Handlungen auf Führungsphänotypen durchgeführt. Also lasst uns loslegen. Peter wird dir zeigen, wie es geht.

Zu Beginn geben Sie mit einem Spatel einen Fleck Hefepaste auf eine Trauben-Agri-Eier-Auffangplatte, die jedem der Fässer einer Embryo-Entnahmekammer entspricht. Injizieren Sie anschließend Kohlendioxidgas in die Fliegenfläschchen, um die Fliegen in den Schlaf zu versetzen. Setzen Sie ein paar hundert Fliegen direkt in die Auffangkammer um.

Decken Sie dann die Kammer mit der Eiauffangplatte ab und drücken Sie sie mit einem 20 Zoll langen Streifen Beschriftungsband zusammen, während Sie die Kammer und die Platte von der Mitte der Agarplatte aus zusammenbinden. Das Klebeband überlappt sich auf der Eierauffangplatte. Nachdem die Fliegen aufgewacht sind, brüten Sie nach der Inkubation zwei oder drei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in horizontaler Position, klopfen Sie die Fliegen nach unten und setzen Sie die Auffangplatte wieder auf.

Wenn weniger als 100 Embryonen in jedem Sektor der entnommenen Platte vorhanden sind. Fahren Sie mit der zweistündigen Entnahme fort, bis genügend Embryonen entnommen wurden. Entnommene Embryonen können gemäß den Angaben im begleitenden schriftlichen Protokoll gepoolt werden.

Um die Embryonen altern zu lassen, legen Sie ein feuchtes Stück Filterpapier mit einem 90-Millimeter-Kreis in den Deckel einer Petrischale und stellen Sie die Auffangplatte mit den Embryonen auf den Kopf. Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Dauer und bei der gewünschten Temperatur, bereiten Sie einen Objektträger für das Embryo-Staging und die Sortierung vor, indem Sie doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger legen. Lege dann eine rechteckige Platte Trauben-Agar auf die S-Folie.

Die Eizelle sollte groß genug sein, um fünf bis 10 Reihen mit 10 bis 15 Embryonen aufzunehmen. Sobald die Embryonen das gewünschte Stadium erreicht haben, nehmen Sie die Embryonen aus dem Inkubator. Übertragen Sie die gealterten Embryonen von der Entnahmeplatte auf das doppelseitige Klebeband.

Verteilen Sie die Embryonen mit einem feuchten Pinsel gleichmäßig auf dem Klebeband. Unter einem GFP-Präpariermikroskop SOAR-Embryonen für eine geeignete GFP-Expression, die auf den Genotyp hinweist. In diesem Experiment wird die Genotypisierung durchgeführt, indem Embryonen ausgewählt werden, bei denen die Expression des Balancer Curly Arm, GFP, fehlt.

Da die Genotypisierung des Embryos je nach verwendetem Balancer unterschiedlich ist, lesen Sie bitte das beigefügte schriftliche Protokoll, um weitere Informationen zur Durchführung zu erhalten. Schritt. Als nächstes beschichten Sie die Embryonen mit einer abgestumpften Präpariernadel, indem Sie sie vorsichtig über das doppelseitige Klebeband rollen. Im Stadium 16 hat sich der Darm in drei Bänder geteilt.

Danach beginnt der Darm, diagonale Bänder in der Nähe des Schwanzes zu entwickeln und sich dann zu winden, und der Embryo wird klarer. Verwenden Sie dann die Präpariernadel, um jeden Embryo auf die Kornzelle oder andere Embryonen zu rollen. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Klebeband, heben Sie den Embryo an und übertragen Sie ihn auf die Platte mit Traubenagar.

Richten Sie die beschichteten Embryonen auf dieser Platte so aus, dass ihre dorsalen Seiten gegen die Agarplatte und die hinteren Enden nach unten zeigen. Legen Sie dann den Objektträger in eine Petrischale mit nassem Filterpapier und inkubieren Sie die Embryonen bei Raumtemperatur, bis sie das gewünschte Alter erreicht haben. Bereiten Sie für die Sektion einen Objektträger für die Lebenddissektion vor, indem Sie ein kleines rechteckiges Stück doppelseitiges Klebeband abschneiden. Platzieren Sie das Klebeband mit einem Wachsstift in der Nähe eines Endes eines Super Frost Plus Dias.

Zeichnen Sie ein Rechteck in der Breite der Folie und 30 bis 40 Millimeter lang um das Klebeband. Zwischen dem Wachs und dem Klebeband sollten etwa drei Millimeter Platz sein. Übertragen Sie dann die Embryonen von der großen Plattenplatte auf das Band, indem Sie den Objektträger umdrehen und ihn vorsichtig auf die aufgereihten Embryonen absenken, so dass das Band mit ihnen in Kontakt kommt.

Die Embryonen sollten mit den hinteren Enden nach unten ausgerichtet sein. Nach dem Transfer werden die Embryonen mit der dorsalen Seite nach oben auf dem Objektträger positioniert und sofort ein XPBS über die Embryonen gelegt, um das Wachsrechteck mit einer Glasdissektionsnadel zu füllen, die wie eine Injektionsnadel auf einem Nadelabzieher angebracht ist. Entlang der dorsalen Mittellinie ab dem hinteren Ende des Embryos schneiden.

Stechen Sie nun in das vordere Ende des Embryos und heben Sie ihn an. Von unten beginnend, übertragen Sie den Embryo auf die rechte Seite des Klebestreifens und halten Sie ihn im Puffer. Fahren Sie mit dem Präparieren und Übertragen der Embryonen fort und erstellen Sie eine geordnete Reihe von Embryonen auf dem Objektträger, die zu jeder Reihe auf der landwirtschaftlichen Platte passt.

Drücken Sie mit der Präpariernadel die Laschen der Körperwand vorsichtig auf die Folie. Vermeiden Sie das Dehnen oder Entfernen von Material von ihrer Oberfläche. Die Nadel sollte nur die vorderen und hinteren Ecken an den dorsalen Rändern der Körperwand berühren.

Da motorische Axone nicht so weit reichen. Vermeiden Sie es, die Nadeln des Objektträgers dorsal zu berühren, da diese brechen, nachdem alle Embryonen übertragen und auf dem Objektträger befestigt wurden. Entfernen Sie den Darm von jedem Embryo, indem Sie den vierten Darm vom Gehirnbereich abtrennen und den gesamten Darm vom Embryo wegziehen.

Verschiebe den hinteren Darm auf die Rutsche. Sobald alle Dissektionen abgeschlossen sind, verwenden Sie zwei frühere Pipetten, um gleichzeitig Raumtemperatur und 5 % Formaldehyd in eine Ecke des Wachses und des Rechtecks zu geben und die Lösung aus der gegenüberliegenden Ecke zu entfernen. Tauschen Sie die Fixierlösung dreimal mit einem Gesamtvolumen von etwa sechs Millilitern aus.

Inkubieren Sie die Embryonen 45 Minuten lang in der Fixierlösung. Es ist sehr wichtig, dass der Meniskus nicht mit den Embryonen in Berührung kommt, da diese sonst zerstört werden. Entferne mit deiner Pipette den größten Teil der Fixierlösung.

Waschen Sie mit PB S3 mehrmals mit der Methode der Zweiweidepipetten. Dann dreimal mit PBT waschen, um die Embryonen zu permatieren. Dieser Schritt macht die Embryonen auch weniger empfindlich gegenüber dem Meniskus.

Entfernen Sie nach der letzten Wäsche vorsichtig das PBT, indem Sie den Objektträger kippen und ein Kim-Tuch kurz an die Ecke des vom Wachs umschlossenen Bereichs halten, um überschüssige Lösung zu entfernen. Mit einer vorgeladenen Pipette sofort 200 Mikroliter Blockierungslösungsblock für 10 bis 30 Minuten hinzufügen. Entfernen Sie die blockierende Lösung bei Raumtemperatur mit einem Kim-Wischtuch.

Dann sofort 200 Mikroliter des gewünschten Primärantikörpers in Blockierungslösung verdünnt hinzufügen. Legen Sie den Objektträger in eine befeuchtete Platte und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius. In diesem Experiment wird der monoklonale Antikörper 1D four zur Markierung von motorischen Axonen verwendet.

Am nächsten Tag nehmen Sie das Geschirr bei vier Grad Celsius und waschen die Embryonen dreimal auf einer Schaukelplattform mit PBT für mindestens 15 Minuten pro Waschgang. Achten Sie bei allen Waschschritten darauf, dass genügend PBT vorhanden ist, um die Rutsche während des Schaukelns vollständig einzutauchen. Nachdem die Embryonen gewaschen wurden, blockieren Sie den Objektträger wie zuvor.

Nach der Blockierung sofort 200 Mikroliter Sekundärantikörper und Blockierungslösung hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, hier eine Alexa 4 88 go anti-US. Sekundär wird in Verbindung mit Rodine Phin verwendet, um Muskelfasern zu markieren. Auch hier dreimal pro Waschgang mindestens 15 Minuten lang mit PBT auf der Wippplattform waschen.

Schieben Sie die Objektträger in ein anderes Tablett, um Waschmittelreste zu entfernen. Dann zweimal fünf Minuten lang mit PBS waschen. Entfernen Sie den Objektträger aus dem PBS-Diagramm, nehmen Sie den größten Teil des restlichen PBS mit einem chemischen Tuch aus der Vertiefung und fügen Sie sofort 500 Mikroliter 70%iges Glycerin hinzu.

Da Glycerin den gleichen Brechungsindex wie der Embryo hat, wird die Färbung durch diesen Schritt sichtbarer, reinigen Sie die Embryonen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann das Glycerin mit einem Kim-Tuch. Die Entfernung von fast allem Glycerin wird die Embryonen abflachen, während die Entfernung von weniger Glycerin zu einer dreidimensionaleren Struktur führt.

Sobald das Glycerin entfernt wurde, legen Sie ein Abdecktuch Nummer eins auf. Die Embryonen sind bereit für die Bildgebung, präparierte und gefärbte Embryonen können mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Hier wurde ein präparierter Embryo mit dem motorischen Axonmarkierungsantikörper 1D four gefärbt.

Dieses Bild ähnelt in seinem Aussehen den häufiger zu sehenden Bildern, in denen die HRP-Immunhistochemie zur Visualisierung mittels Immunfluoreszenz verwendet wurde. Es ist möglich, qualitativ hochwertigere Bilder zu erhalten, auf denen die Details der motorischen Axonäste deutlicher zu sehen sind. Die Färbung mit Rho-Domine-markiertem Phin, das Aktin bindet, ermöglicht eine gleichzeitige Visualisierung der Muskeln.

Dies gibt ein klareres Bild der Muskelschichtung und -organisation, als dies mit einer HRP-Färbung möglich ist. Hier sind 1D-Vier- oder Motoraxone in grünem Fein oder Muskel in rot dargestellt. Wir haben gerade gezeigt, wie man lebende Drosophila-Embryonen aus Ansammlungen von Mutantenlinien sezieren kann. Wenn Sie diese Verfahren durchführen, ist es wichtig, mit einfachen Linien wie Lio, Armadillo, GFP und ausgewogenen Aktien zu beginnen und nur ein paar Linien auf einmal zu machen.

Wenn Sie mit den Dissektionen erfahrener und schneller werden, können Sie bis zu 10 Linien pro Tag machen, was Ihnen ermöglicht, eine Sammlung von etwa 200 mutierten Linien in einem Zeitraum von etwa 20 Tagen zu screenen. Dies ist also wirklich ein sehr effizientes Verfahren, sobald Sie ein Experte für die Ausführung aller Schritte geworden sind. Das war's also, und danke fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.