Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Hier sehen wir das Verfahren zur Sammlung von Embryonen. Überführen Sie die Fliegen aus den Röhrchen in die Röhren einer Sammelkammer mit fünf Öffnungen. Dann setzen Sie eine Agar-Platte mit Traubenextrakt auf die Kammer und lassen die Fliegen einige Stunden lang Eier legen.

Wenn sich die Embryonen im richtigen Stadium befinden, überführen Sie sie mit einem Pinsel von der Grape Agar-Platte auf doppelseitiges Klebeband. Rollen Sie nun die Embryonen aus ihren Kons und richten Sie sie mit der ventralen Seite nach oben auf einem Agarblock aus. In der Mitte sehen wir einen Objektträger mit einem rechteckigen Wachsstück und einem Stück doppelseitigem Klebeband an einem Ende. Drehen Sie das doppelseitige Klebeband nun um und legen Sie es mit der Klebeseite nach unten auf den Block mit den ausgerichteten Embryonen. Berühren Sie die Embryonen, um sie auf den Objektträger zu übertragen.

Sie liegen nun sofort mit der dorsalen Seite nach oben. Geben Sie PBS auf den Bereich des Objektträgers, der durch das Wachseck eingeschlossen ist, sodass die Embryonen bedeckt sind. Oben ist eine Seitenansicht des Objektträgers dargestellt, unten eine Draufsicht.

Schneiden Sie mit einer gläsernen Präpariernadel einen Schlitz entlang der Eihaut. Stechen Sie die Embryonen im Gehirnbereich an, heben Sie sie an und ordnen Sie sie in Reihen auf dem Glas an. Danach sezieren Sie jeden Embryo, um ein Filet herzustellen.

Am Ende des Verfahrens verfügen Sie über einen Objektträger mit Reihen von Filet-Embryonen. Dieser ist nun bereit zur Fixierung. Hallo, ich bin Peter Lee, Postdoktorand im Kaizens Labor in der Abteilung für Biologie am Caltech.

Hallo, ich bin Ashley Wright, Doktorandin am Caltech im Labor von Kaizen. Ich bin Kaizen, Professor am Caltech, und meine Forschungsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung des Nervensystems von Fruchtfliegen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion lebender Drosophila-Embryonen.

Wir haben diese Methoden verwendet, um nach Liganden für Waisenrezeptoren zu suchen. Dies tun wir, indem wir Sammlungen von Zelllinien, die Zelloberflächenproteine überexprimieren, mittels Lebendfärbung von Embryonen mit Rezeptor-Fusionsproteinen screenen. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor außerdem zur Untersuchung embryonaler Phänotypen und Durchführung genetischer Screens.

Ich habe einen Defizienzscreen für motorische Aktivitäten bezüglich Führungsphänotypen durchgeführt. Beginnen wir also. Peter wird Ihnen zeigen, wie es gemacht wird.

Beginnen Sie damit, mit einem Spatel einen Tropfen Hefepaste auf eine Trauben-Agar-Eiablageplatte zu geben, die jedem der Fässer einer Embryonen-Sammelkammer entspricht. Danach leiten Sie Kohlendioxidgas in die Fliegengefäße ein, um die Fliegen zu betäuben. Überführen Sie einige hundert Fliegen direkt in die Sammelkammer.

Dann bedecken Sie die Kammer mit der Eiersammelplatte und drücken Sie sie herunter. Verbinden Sie die Kammer und die Platte mit einem 20 Zoll langen Streifen Beschriftungsband, wobei Sie in der Mitte der Agarplatte beginnen. Das Band überlappt auf der Eiersammelplatte. Nachdem die Fliegen aufgewacht sind, inkubieren Sie die Probe zwei oder drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln in horizontaler Position. Nach der Inkubation klopfen Sie die Fliegen nach unten und tauschen die Sammelplatte aus.

Wenn weniger als 100 Embryonen auf jedem Sektor der entnommenen Platte vorhanden sind, führen Sie weiterhin zweistündige Sammlungen durch, bis genügend Embryonen gesammelt wurden. Die gesammelten Embryonen können gemäß den Angaben im beigefügten schriftlichen Protokoll zusammengefasst werden.

Um die Embryonen zu altern, legen Sie ein feuchtes 90-Millimeter-Rundfilterpapier in den Deckel einer Petrischale und stellen Sie die Sammelplatte mit den Embryonen umgedreht darauf. Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Dauer und bei der gewünschten Temperatur. Bereiten Sie eine Objektträgerpräparation zur Embryonalstadieneinteilung und -sortierung vor, indem Sie doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger geben. Anschließend platzieren Sie einen rechteckigen Block aus Traubensäure-Agar auf dem S-Objektträger.

Der Eierbehälter sollte groß genug sein, um fünf bis 10 Reihen mit jeweils 10 bis 15 Embryonen aufzunehmen. Sobald die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator. Überführen Sie die gealterten Embryonen von der Sammelplatte auf das doppelseitige Klebeband.

Verteilen Sie die Embryonen mit einem feuchten Pinsel gleichmäßig auf dem Klebeband. Suchen Sie unter einem GFP-Zerlege-Mikroskop nach SOAR-Embryonen mit geeigneter GFP-Expression, die den Genotyp anzeigt. In diesem Experiment erfolgt die Genotypisierung durch Auswahl von Embryonen, die keinen Ausdruck des balancierenden curly arm-GFP aufweisen.

Da die Embryonentypisierung je nach verwendetem Balancer variieren wird, ziehen Sie bitte das beiliegende schriftliche Protokoll heran, um weitere Informationen über die Durchführung dieses Schritts zu erhalten. Als Nächstes beschichten Sie die Embryonen, indem Sie diese vorsichtig mit einer abgestumpften Präpariernadel über das doppelseitige Klebeband rollen. Im Stadium 16 hat sich der Darm in drei Bänder aufgeteilt.

Danach beginnt der Darm, diagonale Bänder in der Nähe des Schwanzes zu bilden, windet sich und das Embryo wird deutlicher sichtbar. Verwenden Sie anschließend die Präpariernadel, um jedes Embryo auf der Oberseite des Chorions oder anderer Embryonen zu rollen. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Klebeband, heben Sie das Embryo an und übertragen Sie es auf den Agar-Block aus Weintrauben.

Richten Sie die beschichteten Embryonen auf dieser Unterlage so aus, dass ihre dorsalen Seiten an der Agar-Unterlage anliegen und die posterioren Enden nach unten weisen. Anschließend stellen Sie den Objektträger in eine Petrischale mit nassem Filterpapier und inkubieren die Embryonen bei Raumtemperatur, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Für die Dissektion bereiten Sie einen Objektträger für die lebende Dissektion vor, indem Sie ein kleines rechteckiges Stück doppelseitig klebendes Klebeband zuschneiden. Befestigen Sie das Klebeband mit einem Wachsstift nahe einem Ende eines Super-Frost-Plus-Objektträgers.

Zeichnen Sie ein Rechteck mit der Breite des Objektträgers und einer Länge von 30 bis 40 Millimetern um das Band herum. Zwischen Wachs und Band sollten etwa drei Millimeter Abstand bleiben. Übertragen Sie dann die Embryonen von der großen Platte auf das Band, indem Sie den Objektträger umdrehen und vorsichtig auf die ausgerichteten Embryonen senken, sodass das Band mit ihnen in Kontakt kommt.

Die Embryonen sollten mit den hinteren Enden nach unten ausgerichtet sein. Nach der Übertragung werden die Embryonen dorsal nach oben liegend auf dem Objektträger positioniert; sofort einen Tropfen XPBS über die Embryonen geben, um das Wachseck mit einer Glas-Präpariernadel aufzufüllen, die wie eine Injektionsnadel mit einem Nadelextrahierer hergestellt wurde. Schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie beginnend am hinteren Ende des Embryos.

Nun stossen Sie das vordere Ende des Embryos an und heben Sie es leicht an. Übertragen Sie den Embryo ausgehend von der Unterseite nach rechts neben den Klebestreifen, wobei Sie ihn in der Pufferlösung belassen. Setzen Sie die Präparation und den Transfer der Embryos fort, und ordnen Sie die Embryos auf dem Objektträger in einer sauberen Reihe an, die den Reihen auf der Agarplatte entspricht.

Drücken Sie mit der Präpariernadel vorsichtig die Lappen der Körperwand auf den Objektträger herunter, wobei Sie vermeiden sollten, das Material zu dehnen oder von der Oberfläche zu entfernen. Die Nadel sollte nur die vorderen und hinteren Ecken an den dorsalen Rändern der Körperwand berühren.

Da motorische Axone nicht so weit dorsal reichen, vermeiden Sie es, die Nadeln des Objektträgers zu berühren, da diese nach dem Übertragen und Fixieren aller Embryonen brechen können. Entfernen Sie den Darm jedes Embryos, indem Sie die vier Darmanteile vom Gehirnbereich durchtrennen und den gesamten Darm vom Embryo wegziehen.

Verschieben Sie den Hinterdarm auf dem Objektträger nach außen. Sobald alle Präparationen abgeschlossen sind, geben Sie mit zwei Pasteurpipetten gleichzeitig 5 % Formaldehyd bei Raumtemperatur in eine Ecke des Wachseinsatzes in Form eines Rechtecks und entfernen Sie die Lösung aus der gegenüberliegenden Ecke. Wechseln Sie das Fixierungsmittel dreimal unter Verwendung eines Gesamtvolumens von etwa sechs Millilitern.

Die Embryonen 45 Minuten lang in der Fixierungslösung inkubieren. Es ist sehr wichtig, dass der Meniskus die Embryonen nicht berührt, da dies zu deren Zerstörung führen würde. Mit einer Pasteurpipette den größten Teil der Fixierungslösung entfernen.

3-mal mit PBS waschen, wobei die Methode der beiden Pasteur-Pipetten verwendet wird. Anschließend 3-mal mit PBT waschen, um die Embryonen zu permeabilisieren. Dieser Schritt macht die Embryonen außerdem weniger empfindlich gegenüber dem Meniskus.

Nach dem letzten Waschschritt das PBT vorsichtig entfernen, indem man die Folie kippt und kurz mit einem Kim-Tuch an die Ecke des durch das Wachs begrenzten Bereichs tippt, um überschüssige Lösung zu entfernen. Unmittelbar danach mit einer vorgefüllten Pipettierhilfe 200 Mikroliter Blockierungslösung hinzufügen und 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Blockierungslösung anschließend mit einem Kim-Tuch entfernen.

Anschießend sofort 200 Mikroliter des in Blockierungslösung verdünnten primären Antikörpers hinzufügen. Die Probe in einer befeuchteten Platte platzieren und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. In diesem Experiment wird der monoklonale Antikörper 1D vier verwendet, um motorische Axone zu markieren.

Am nächsten Tag die Schalen von vier Grad Celsius nehmen und die Embryonen dreimal auf einer schwingenden Plattform mit PBT für jeweils mindestens 15 Minuten waschen. Stellen Sie bei allen Waschschritten sicher, dass ausreichend PBT vorhanden ist, um den Objektträger während des Schwingens vollständig zu bedecken. Nach dem Waschen der Embryonen den Objektträger wie zuvor blockieren.

Nach der Blockierung sofort 200 Mikroliter sekundären Antikörper in Blockierungslösung hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren; hier wird ein Alexa 488 gekoppelter Ziegen-anti-US-Sekundärantikörper in Verbindung mit Rodamin Phalloidin zur Markierung der Muskelfasern verwendet. Anschließend erneut dreimal mit PBT auf der Schüttelplattform waschen, wobei jede Waschung mindestens 15 Minuten dauert.

Überführen Sie die Objektträger in eine andere Schale, um restlichen Reinigungsmittel zu entfernen. Anschließend zweimal fünf Minuten mit PBS waschen. Entfernen Sie den Objektträger aus dem PBS, tupfen Sie den größten Teil des verbleibenden PBS aus der Vertiefung mit einem Chemiewisch ab und geben Sie unverzüglich 500 Mikroliter 70 %igen Glycerin hinzu.

Da Glycerin den gleichen Brechungsindex wie der Embryo hat, wird durch diesen Schritt die Färbung deutlicher sichtbar. Klären Sie die Embryonen für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend entfernen Sie das Glycerin mit einem Kim-Tuch. Wenn nahezu das gesamte Glycerin entfernt wird, werden die Embryonen abgeflacht; bei geringerer Entfernung des Glycerins ergibt sich eine dreidimensionalere Struktur.

Nachdem das Glycerin entfernt wurde, einen Deckglaser der Größe 1 aufsetzen. Die Embryonen sind bereit zur Bildgebung; dissezierte und gefärbte Embryonen können mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Hier wurde ein dissezierter Embryo mit dem Antikörper 1D4 zur Markierung motorischer Axone gefärbt.

Dieses Bild ähnelt optisch den häufiger anzutreffenden Aufnahmen, bei denen die HRP-Immunhistochemie zur Visualisierung mittels Immunfluoreszenz verwendet wurde. Es ist möglich, Bilder von höherer Qualität zu erhalten, bei denen die Details der motorischen Axonverzweigungen deutlicher sichtbar sind. Eine Doppelfärbung mit rho-domänengekoppeltem Phalloidin, das an Aktin bindet, ermöglicht die gleichzeitige Darstellung der Muskulatur.

Dies liefert ein deutlicheres Bild der Muskelschichtung und -organisation, als es mit HRP-Färbung möglich ist. Hier sind 1D-vier oder motorische Axone in Grün dargestellt, Fein- oder Muskelgewebe in Rot. Wir haben soeben demonstriert, wie man lebende Drosophila-Embryonen aus Sammlungen von Mutantenlinien präpariert. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, mit einfachen Linien wie lio, armadillo, GFP, balancierten Stämmen zu beginnen und jeweils nur wenige Linien gleichzeitig zu bearbeiten.

Wenn Sie mit den Dissektionen immer erfahrener und schneller werden, können Sie bis zu 10 Linien pro Tag bearbeiten, wodurch Sie eine Sammlung von etwa 200 mutierten Linien innerhalb von etwa 20 Tagen untersuchen können. Sobald Sie also alle Schritte sicher beherrschen, handelt es sich hierbei tatsächlich um ein sehr effizientes Verfahren. Das war's – vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.