Ohne Linsen auskommt, On-Chip-Bildgebung von Zellen hat ein neues Instrument für High-Throughput-Zell-Biologie und der medizinischen Diagnostik

In diesem Video wird das Prinzip einer auf einem Chip integrierten Linsen-Array-Bildgebung namens Lucas veranschaulicht. Lucas steht für „Lens List Ultra Wide Field of View Cell Monitoring Array Platform based on Shadow Imaging“. Im Gegensatz zu herkömmlichen Bildgebungssystemen benötigt die Lucas-Plattform keine Mikroskopobjektive oder andere sperrige optische Komponenten.

Für Lucas wird das interessierende Präparat auf eine Objektträgerplatte positioniert und vorsichtig von einer identischen Deckglasplatte überdeckt. Mithilfe eines Vakuumstifts wird die Probe im aktiven Bereich des optoelektronischen Sensorarrays platziert. Die Bildgebungsplattform zeichnet anschließend die Schatten oder linsenfreien digitalen Hologramme jeder interessierenden Zelle innerhalb ihres Sichtfelds auf.

Die automatisierte digitale Verarbeitung dieser Zellschatten kann den Typ, die Anzahl und die relativen Positionen der Zellen in der Lösung bestimmen. Das Sichtfeld kann bis zu 18 Quadratzentimeter groß sein, bei einer Schärfentiefe von etwa fünf Millimetern. Die aufgenommenen Beugungsbilder werden anschließend digital durch einen speziell entwickelten Entscheidungsalgorithmus verarbeitet, um sowohl die Charakterisierung als auch die Identifizierung von Zielzellen oder -partikeln zu ermöglichen.

Lucas bietet eine miniaturisierte Plattform, die die Kosten senkt und den Durchsatz für bildbasierte Experimente erheblich steigert, wodurch Kompatibilität mit fortschrittlichen, modernsten Technologien in der Mikrofluidik und biologischen Forschung gegeben ist. Hallo, ich bin vom ROM Bio- und Nanolabor im Department für Elektrotechnik der University of California, Los Angeles, und ich bin Anthony Erlinger, ebenfalls vom Labor für Nano- und Biophotonik. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die hochdurchsatzfähige, objektivfreie Bildgebung einer heterogenen SA-Lösung, wie beispielsweise einer Vollblutprobe.

Dieses Verfahren in unserem Labor nutzt eine neuartige Bildgebungstechnik, die wir als Plattform zur Überwachung von Zellarrays mit Linse und extrem weitem Sichtfeld basierend auf Schattenabbildung bezeichnen, kurz Lucas. Beginnen wir also. Um den Prozess einzuleiten, beschaffen Sie drei Milliliter Vollblut und Polystyrol-Mikroperlen mit verschiedenen Durchmessern, beispielsweise fünf, 10 und 20 Mikrometer, und bringen Sie diese 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.

Unter Verwendung einer serologischen Pipette zwei Milliliter RPMI 1640 klassisches flüssiges Medium als Verdünnungsmittel in ein steriles Polypropylenröhrchen mit fünf Milliliter Volumen geben. Nach einer 30-minütigen Sedimentationsphase 10 Mikroliter Erythrozytenprobe vom Boden des Vollblutentnahmeröhrchens entnehmen und in die RPMI-Lösung überführen. Insgesamt 20 Mikroliter Polystyrol-Mikroperlen zur Erythrozyten-RPMI-Verdünnung hinzufügen und die Zellsuspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren vermischen. Mithilfe einer Pinzette fünf bis 15 Mikroliter der heterogenen Lösung auf einen Deckgläserträger übertragen.

Platzieren Sie einen zweiten identischen Deckel über die Lösung. Die Probe sollte gleichmäßig zwischen den beiden Deckeln eingeschlossen sein. Laden Sie die Probe anschließend mit einem Vakuumstift auf den aktiven Bereich des Sensorarrays für die Bildgebung.

Dann bereiten Sie das wässrige Färbe-Reagenz vor, indem Sie 0,1 % gepuffertes SNY und verdünnte Neues-Methylenblau- oder NMB-Lösung im Volumenverhältnis zwei zu eins mischen. Weitere Einzelheiten zur Herstellung von SNY- und Pum-Methylenblau-Lösungen finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Anschließend mischen Sie im Polypropylen-Becher das ACOA-Färbe-Reagenz mit der Vollblutprobe im Volumenverhältnis eins zu eins unter Verwendung eines magnetischen Rührers für zwei Minuten. Danach inkubieren Sie die Lösung weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur, nachdem die Lösung in 1,99 Milliliter RPMI 1640 klassischer Flüssiglösung in einem fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Röhrchen vorinkubiert wurde.

Als Nächstes überführen Sie 10 Mikroliter der angefärbten Blutlösung in RPMI, um ein Volumenverhältnis von eins zu 200 zu erreichen. Anschließend wirbeln Sie die Lösung 30 Sekunden lang im Vortex-Mischer, pipettieren 10 bis 100 Mikroliter der angefärbten Zelllösung zwischen Deckgläser oder in ein mikrofluidisches Reservoir. Danach platzieren Sie mit einem Vakuumpen das Präparat auf dem aktiven Bereich des Sensorarrays.

Die Lucas-Plattform nutzt ein optoelektronisches Sensorenarray, um holografische Aufnahmen von schwebenden Zellen digital zu erfassen. Zu diesem Zweck werden ladungsgekoppelte Bauelemente oder CCDs eingesetzt, um eine abstimmbare Wellenlängenbeleuchtung zu ermöglichen. Ein Monochromator mit einer Xenonlampe zusammen mit einer Standard-Fusionskieselsäurefaser, die aus einem Bündel von Fasern besteht, sowie eine etwa 100 Mikrometer durchmessende Lochblende, die sich etwa fünf bis zehn Zentimeter über der Sensoroberfläche befindet, können für die abstimmbare Wellenlängenbeleuchtung verwendet werden. Die Beleuchtung bietet eine flexible Plattform, bei der die holografischen Signaturmerkmale der Zellen präzise angepasst und hybride digitale Signaturen durch Kombination mehrerer Wellenlängen synthetisiert werden können, um das Signal-Rausch-Verhältnis sowie den Kontrast des Lucas-Bildes zu verbessern.

Zur besseren Charakterisierung werden Proben, die zwischen zwei Deckgläsern eingeschlossen sind, auf den aktiven Bereich des Sensorarrays aufgebracht und gleichmäßig von der Lichtquelle beleuchtet. Die Beugungshologramme jeder Zelle oder mikroskopischen Struktur in einer heterogenen Lösung treffen auf das Sensorarray und erzeugen ein Lucas-Bild. Die aufgenommenen Lucas-Beugungsbilder werden mithilfe eines speziell entwickelten Entscheidungsalgorithmus verarbeitet, der eine statistische Bibliothek von Beugungsbildern nutzt, um Zielzellen oder mikroskopische Objekte automatisiert zu charakterisieren und zu identifizieren.

Diese Abbildung zeigt ein herkömmliches Bild mit 40-facher Objektivvergrößerung einer heterogenen Lösung aus fünf, zehn und zwanzig Mikrometer großen Polystyrol-Mikroperlen sowie roten Blutkörperchen. Die 3D-Morphologie, der Brechungsindex und die interne Komplexität dieser Partikel unterscheiden sich alle voneinander.

Einige dieser Merkmale können unter einem herkömmlichen Mikroskop unterschieden werden, jedoch nur innerhalb eines sehr begrenzten Sichtfelds von weniger als 0,5 Quadratmillimetern auf der Lucas-Plattform. Alle diese Mikropartikel weisen einzigartig verschiedene holographische Muster wie einen Fingerabdruck auf. Daher können sie eindeutig anhand ihrer 2D-Texturen charakterisiert werden.

Lucas kann ein extrem weites Sichtfeld überwachen, das bis zu 10 bis 20 Quadratzentimeter groß sein kann. Das ist um Größenordnungen größer als bei herkömmlichen, linsenbasierten Mikroskopen. Dies ist ein Bild mit 40×-Objektiv eines gefärbten Vollblutproben, aufgenommen mit der Lucas-Plattform.

Die inneren Strukturen gefärbter weißer Blutkörperchen variieren effizient durch Anpassung des Brechungsindex und der Streueigenschaften der Zellkerne. Unterscheidbare Beugungsmuster einzelner Zellen werden durch das Sensorenarray aufgezeichnet. Dies zeigt einen weiteren Vorteil der Lucas-Plattform als leistungsfähiges Werkzeug für die zellanalytische Point-of-Care-Diagnostik auf.

Als vollautomatisierte Plattform zur schnellen Charakterisierung von Zellen von Interesse werden Lucas-Beugungsbilder mithilfe einer speziell entwickelten Entscheidungssoftware digital verarbeitet. In dieser Abbildung wird eine heterogene Mischung aus roten Blutkörperchen und Mikroperlen durch die Schnittstelle verarbeitet. Der Algorithmus ist robust bei der Erkennung von Regionen mit hoher Dichte sowie von Partikeln mit geringem Signal-Rausch-Verhältnis, wie beispielsweise den drei Mikrometer großen Perlen.

Ein verarbeitetes Bild in der Lucas-Benutzeroberfläche wird hier gezeigt. Die Software ermöglicht die Eingabe verschiedener Spezifikationen wie der Sensorpixelgröße oder der Wellenlänge der Beleuchtung. Zusätzlich können Bereiche des Bildes ausgewählt und Zellmuster definiert werden.

Die Probe wird anhand dieser Daten gezählt und das markierte Bild wird dem Benutzer angezeigt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Zellen mit der Hochdurchsatzplattform von Lucas abbildet und charakterisiert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig zu beachten, dass die demonstrierten Experimente auf eine Vielzahl von Zellen und Mikropartikeln angewendet werden können.

Es ermöglicht außerdem die ultraschnelle und hochdurchsatzfähige Charakterisierung von Zellen in einer heterogenen Lösung. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.