Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

Um zirkulierende kernhaltige Zellen aus dem Blut anzureichern. Die mikrofluidische Vorrichtung wird zunächst mit einem XPBS ansatzweise befeuchtet, um Blasen, deionisiertes Wasser und 2 % Paraldehyd in zwei Portionen XPBS durch die Vorrichtung mittels Spritzenpumpen zu leiten, bevor die Blutprobe beladen wird. Anschließend wird das Blut durch die mikrofluidische Vorrichtung verarbeitet, und die Aufarbeitung der Probe umfasst Zentrifugation und Entfernung des Überstandes.

Schließlich wird die Probe mittels Durchflusszytometrie analysiert, um FACS-Diagramme zu erzeugen. Hallo, ich bin William White aus dem Labor für Mikroskalen-Biotechnologie am Fachbereich Bioingenieurwesen der University of Wool. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Anreicherung zirkulierender Zellkerne durch Lyse von Vollblut mittels Mikrofluidik.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Entzündungen bei verschiedenen Krankheitsprozessen zu untersuchen, um eine Anreicherung von Leukozyten und anderen zirkulierenden kernhaltigen Zellen sicherzustellen, ohne Verlust oder Aktivierung. Beginnen wir also. Zum Starten dieses Verfahrens stecken Sie Zuleitungen mit einem leicht größeren Durchmesser als die Kanalanschlussbohrungen in die Einlass- und Auslassöffnungen.

Danach, um die Makro-Mikro-Schnittstelle bereitzustellen, eine 30-Gauge-Spritzennadel an das Schlauchstück jedes Zulaufs anschließen. Anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit einem XPBS füllen und sicherstellen, dass keine Blasen enthalten sind. Die Spritze mit Zulauf eins verbinden und die Spritze vorsichtig von Hand betätigen, bis ein XPBS aus Zulauf zwei austritt.

Dann sofort den Inlet zwei mit einer Büroklammer verschließen. Weiterhin den Kolben betätigen, bis die X-PBS-Lösung den Auslassanschluss des mikrofluidischen Geräts erreicht. Sobald die Lösung aus dem Auslass austritt, das Auslassrohr mit einer weiteren Büroklammer verschließen.

Drücken Sie weiterhin den Ein-Milliliter-Spritzenkolben, bis XPBS aus Einlass drei austritt, und verschließen Sie den Einlass-drei-Anschluss mit einer dritten Büroklammer. Die mikrofluidische Vorrichtung ist nun vollständig entlüftet. Beginnen Sie mit der Kalibrierung der Spritzenpumpen mithilfe der großen Harvard-Spritzenpumpe, indem Sie den Durchmesser auf 22,5 Millimeter und die Flussrate auf 600 Mikroliter pro Minute einstellen.

Für die kleine Harvard-Spritzenpumpe. Stellen Sie den Durchmesser auf 4,61 Millimeter und die Flussrate auf 20 Mikroliter pro Minute ein. Füllen Sie anschließend eine 30-Milliliter-Spritze mit entionisiertem Wasser, indem Sie die Lösung direkt aus dem 50-Milliliter-Konischkolben aufziehen.

Denken Sie daran, die Spritze zu beschriften, und füllen Sie eine weitere 30-Milliliter-Spritze mit zwei XPBS 2 % Paraformaldehyd-Lösung. Ziehen Sie die Lösung erneut direkt aus einem kegelförmigen Reagenzglas auf und beschriften Sie die Spritze. Schließen Sie nun die mit Wasser gefüllte Spritze an Einlass zwei und die mit 2 % Paraformaldehyd in zwei XPBS gefüllte Spritze an Einlass drei an, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen in der Schlauchleitung oder in der mikrofluidischen Vorrichtung befinden.

Entfernen Sie dann die Klemmen von der Zuleitung zwei, der Zuleitung drei und der Ablaufschlauchleitung, wobei alle drei Spritzen angeschlossen bleiben. Verbinden Sie anschließend die beiden großen Spritzen am großen Harvard-Spritzenpumpen und setzen Sie die Ein-Milliliter-Spritze auf die kleine Harvard-Spritzenpumpe. Legen Sie die Ablaufschlauchleitung in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Abfallsammelröhrchen.

Schalten Sie nun die große Harvard-Spritzenpumpe, die die 30-Milliliter-Spritzen hält, ein und lassen Sie sie eine Minute lang laufen. Überprüfen Sie, ob keine Blasen und keine Leckagen im Gerät oder in den Schläuchen vorhanden sind. Schalten Sie dann die kleine Harvard-Spritzenpumpe ein und lassen Sie sie hier ebenfalls eine zusätzliche Minute lang laufen.

Überprüfung auf Blasen und Leckagen. Stoppen Sie die Pumpen nach zwei Minuten. Da das mikrofluidische Gerät nun bereit zur Verwendung mit Blutproben ist, wurden die zu analysierenden Blutproben wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben gesammelt und innerhalb einer Stunde nach der Entnahme verwendet.

Das erste Röhrchen des gesammelten Bluts wird verworfen, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. Entfernen Sie die Ein-Milliliter-Spritze von der kleinen Harvard-Spritzenpumpe und injizieren Sie dann ein XPBS aus der Ein-Milliliter-Spritze, um die Spritzennadel zu füllen. Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 50 Mikrolitern eines XPBS, ohne Blasen einzuschließen.

Füllen Sie dann die Spritze mit 0,5 Milliliter Blut. Halten Sie die Spritze während des Befüllens senkrecht, um eine Vermischung des PBS mit dem Blut zu vermeiden. Schließen Sie anschließend die Spritze mit dem Blut wieder an Einlass eins an.

Wischen Sie jegliche überschüssige Flüssigkeit ab und befestigen Sie die Spritze senkrecht an der kleinen Harvard-Spritzenpumpe. Achten Sie darauf, das Blut nicht durch die Schläuche in das Gerät zu drücken. Entfernen Sie das Auslassrohr vom Abfallrohr und platzieren Sie es in einem sauberen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das in einem Eisbehälter steht.

Schalten Sie nun zuerst den Laufschalter der großen Harvard-Spritzenpumpe ein und lassen Sie sie eine Minute lang laufen. Danach schalten Sie die kleine Harvard-Spritzenpumpe ein. Die Probe beginnt, sich am Auslassschlauch in dem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.

Lassen Sie die Blutprobe in der Ein-Milliliter-Spritze vollständig durch das Gerät fließen, was etwa 20 Minuten dauert. Stoppen Sie dann beide Pumpen. Da der Durchlauf abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die gesammelte Probe fünf Minuten lang bei 350 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse.

Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Pipettenspitze auf der gegenüberliegenden Seite des weißen Pellets platzieren. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, insbesondere rote Zelltrümmer, ohne das weiße Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Probe durch Pipettieren in einem Milliliter Flusspuffer, der 1 % BSA und 2 % Paraformaldehyd in 1 × PBS enthält.

Hoch und runter überführen Sie die Probe in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren die gesammelte Probe fünf Minuten lang bei vierfacher Erdbeschleunigung. Entfernen Sie bei Raumtemperatur das Überstandsvolumen so vorsichtig wie im vorherigen Zentrifugationsschritt. Geben Sie abschließend ein Milliliter Flusspuffer zu, wirbeln Sie die Probe gründlich um und fahren Sie mit der Analyse der Probe mittels Durchflusszytometrie fort.

Nun zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse in Form von Fax-Diagrammen aus einer Blutprobe, die mittels des mikrofluidischen Geräts angereichert und mit Durchflusszytometrie analysiert wurde. Die Bedeutung der Anreicherung durch Lyse wird anhand eines Fax-Diagramms deutlich, bei dem rote Blutkörperchen überlagern. Das Streudiagramm, das durch das mikrofluidische Anreicherungsprotokoll erzeugt wird, ist ein klares Streudiagramm mit gut definierten Populationen kernhaltiger Zellen, die in der Zirkulation vorkommen.

Der rote Bereich repräsentiert Lymphozyten, grün repräsentiert Monozyten, blau repräsentiert Granulozyten, und der violette Bereich ist noch nicht charakterisiert. Wenn rote Zelltrümmer im Protokoll nicht entfernt werden, entsteht ein Cluster von Ereignissen im Fax-Plot, der im cyanfarbenen Bereich sichtbar ist. Zellpopulationen können in separaten Fax-Plots visualisiert werden.

Lymphozyten, die mit CD3 und CD4 markiert sind. Monozyten, die mit CD14 markiert sind, und Granulozyten, die mit CD66b markiert sind. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Blutprobe mit dem mikrofluidischen Blutlysegerät aufbaut und durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Blutprobe unverzüglich durchzuführen, um zu verhindern, dass PBS mit dem Blut vermischt wird, bevor es das Gerät erreicht, und um die Bildung von Blasen in den Kanälen des Geräts zu vermeiden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.