Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Dieses Video zeigt die Dissektion der Mausretina und anschließende Gewinnung von Einzelzell-Saugaufzeichnungen für Zapfen. Die Augäpfel einer euthanasierten, dunkeladaptierten Maus werden im dorsalen Bereich verätzt und unter schwachem rotem Licht enukleiert. Anschließend werden die Augäpfel halbiert und in Sektoren unterteilt.

Entlang des Äquators werden dann die Hornhaut und die ventralen Teile der Augäpfel entfernt. Die dorsale Netzhaut wird von der Pigmentepithelschicht isoliert und mit einer Rasierklinge in kleine, dünne Stücke geschnitten. Die Netzhautschnitte werden anschließend in die Ableitungskammer gegeben, die auf einen Mikroskopständer passt.

Mehrere Photorezeptorzellkörper werden in die Ableitelektrode hineingezogen. Wenn ein Zapfenphotorezeptor in die Elektrode gezogen wird, induziert ein heller Testblitz eine photoelektrische Antwort mit einer Amplitude von mehr als vier Pikoa mpere. Hallo. Hallo. Ich bin Jin aus dem Labor von Dr. Mir Kops in der Abteilung für Augenheilkunde und dem visuellen Zensus an der Washington University in St. Louis.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufzeichnung von Lichtantworten einzelner Moscon-Photorezeptoren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Anpassungseigenschaften von Säugetier-Kegeln zu untersuchen, den Photorezeptoren, die unsere Tagessicht vermitteln. Beginnen wir also.

Am Tag vor der Aufnahme das Experiment im Dunkeln vorbereiten. Eine Maus anpassen, indem sie über Nacht in einen lichtdichten Käfig gestellt wird. Mit einem Mikropipettenzug eine Aufnahmeelektrode aus Borosilikatglasröhrchen unter einem zusammengesetzten Mikroskop herstellen.

Verwenden Sie einen Heizfaden zum Beschleunigen. Polieren Sie die Spitze jeder Elektrode, um sie zu glätten und ihre Öffnung auf den gewünschten Durchmesser zu verkleinern. Für die Einzelzellabsaugung eines Mauszapfens sollte der Innendurchmesser an der Elektrodenspitze etwa sechs bis sieben Mikrometer betragen.

Stellen Sie eine 1 %ige Agar-Lösung in destilliertem Wasser her. Erhitzen Sie die Lösung im siedenden Wasser, um den Agar zu schmelzen. Sobald der Agar geschmolzen ist, füllen Sie die Lösung in eine Spritze und damit die Glaspipetten.

Um Referenzelektroden herzustellen, lassen Sie diese 10 Minuten bei Raumtemperatur erstarren. Nachdem das Agar erstarrt ist, schneiden Sie jede Pipette mit einem Diamantmesser in zwei Hälften, um zwei Referenzelektroden zu erhalten. Stellen Sie die Referenzelektroden in ein Szintillationsfläschchen, das mit Referenzlösung gefüllt ist, und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius einweichen, damit die Lösung in das Agar-Gel eindringen kann.

Bezugselektroden können ab dem Zeitpunkt der Herstellung bis zu drei Monate lang verwendet werden. Nach Gebrauch werden die Elektroden nach dem Experiment entsorgt. Das Aufnahmesystem besteht aus einem umgekehrten Mikroskop, das auf einem luftgefederten Tisch montiert ist, um Vibrationsgeräusche zu minimieren, und das durch einen Abschirmkäfig geschützt ist, um elektromagnetische Störungen zu reduzieren.

Ein motorisierter Mikromanipulator wird zur Positionierung der Ableitelektrode verwendet. Der optische Stimulator besteht aus einer Wolframfadenlampe, computergesteuerten Blenden und optischen Filtern zur Steuerung von Wellenlänge und Lichtintensität. Ein Patch-Clamp-Verstärker dient zum Nachweis von Membranströmen einzelner Photorezeptorzellen.

Während der gesamten Aufzeichnungen wird das Gewebe perfundiert. Stellen Sie einen Liter des zubereiteten Perfusionspuffers in ein 40 Grad Celsius warmes Wasserbad in der Nähe des Aufzeichnungssystems. Verbinden Sie dann mithilfe von Schläuchen den Perfusionspuffer mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, sodass er kontinuierlich durchblubbert wird.

Messen Sie mit einem Photometer die ungedämpfte Lichtleistung des ungedämpften Lichts vom optischen Stimulator, wobei der Detektor des Photometers in der Ebene auf dem Mikroskoptisch platziert wird, in der die Probe angeordnet wird. Konvertieren Sie anschließend die Angabe in Mikrowatt in Photonen pro Quadratmikrometer pro Sekunde, um die Anzahl der Photonen pro Testimpuls abzuschätzen, unter Berücksichtigung der Lichtdämpfung durch Neutraldichtefilter.

Nachdem die nicht abgeschwächte Lichtleistung gemessen wurde, entfernen Sie das Photometer vom Objekttisch und befestigen die für die Experimente verwendete Aufnahmekammer auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops. Verbinden Sie mittels Schläuchen die Perfusionslösungflasche über ein Regulierungsventil mit der Aufnahmekammer. Führen Sie den Schlauch durch einen Heizwiderstand.

Stellen Sie sicher, dass der Heizwiderstand unmittelbar vor der Ableitungskammer platziert ist. Anschließend verbinden Sie den Umgehungsschlauch vom Regulierventil mit der Ableitungskammer. Starten Sie die Perfusion, indem Sie das Durchflussregulierventil öffnen und den Durchfluss auf eine Rate von ein bis 1,5 Milliliter pro Minute einstellen.

Die Perfusionslösung fließt durch Schwerkraft aus der Ableitungskammer in einen Sammelflasche. Füllen Sie mit einer Spritze und einer stumpfen Nadel die Elektrodenhalter mit Referenzlösung. Füllen und spülen Sie die Ableitelektrode mit einer Mikrofüllspritze und deren Nadel mit Referenzlösung, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen in der Elektrode befinden.

Setzen Sie die Referenzelektrode in einen Elektrodenhalter ein und verbinden Sie sie mit dem Referenzpol der Verstärkerkopfstufe. Befestigen Sie das Thermoelement mit einem Gummiring an der Referenzelektrode. Achten Sie darauf, dass die Spitzen der Elektrode und des Thermoelements nahe beieinander liegen, um sicherzustellen, dass die Temperaturmessung so nah wie möglich an der Zelle erfolgt.

Danach die Ableitelektrode in einen Elektrodenhalter einsetzen und den Halter an der Kopfstufe des Verstärkers befestigen. Mithilfe von Schläuchen einen kleinen Vorratsbehälter mit Mineralöl mit dem Seitenanschluss des Elektrodenhalters verbinden. Durch sanftes Ansaugen mit dem Mund über den mit dem Behälter verbundenen Schlauch wird die Zelle in die Elektrode gezogen.

Öffnen Sie mithilfe der Computersoftware einen der Verschlüsse des optischen Stimulators. Um den Strahlbereich des Testblitzes auf dem Mikroskopständer sichtbar zu machen, fokussieren Sie das Mikroskop auf den Boden der Ableitungskammer. Bewegen Sie mit Hilfe des Mikromanipulators die Elektrode in die Mitte des Strahlbereichs des Testblitzes.

Platzieren Sie die Referenzelektrode nahe der Spitze der Ableitelektrode. Stellen Sie die Spannung für die Heizung so ein, dass die Temperatur der Lösung in der Ableitkammer etwa 36 bis 38 Grad Celsius beträgt. Führen Sie einen Dichtetest durch, bei dem die Spannung zur voreingestellten Stromamplitude gemessen wird, um den Widerstand zu berechnen und den Widerstand der Ableitelektrode zu überprüfen, der normalerweise etwa 900 Kiloohm beträgt.

Der Dichttest ermöglicht den Nachweis von Bläschen in der Ableitelektrode oder Referenzelektrode oder einer ungeeigneten Spitzengröße der Ableitelektrode. Der Dichttest wird softwaregesteuert über das Aufnahmeprogramm Clamp X kontrolliert. Der Widerstandswert wird auf dem Computerscreen angezeigt. Wenn der Widerstand zu niedrig ist, weniger als 500 Kiloohm, ist die Spitze der Elektrode vermutlich zu groß und es muss eine neue Elektrode eingesetzt werden.

Wenn der Widerstand höher als ein Milliohm ist, könnte eine Blase in der Elektrode vorhanden sein oder deren Spitze ist zu eng, und die Elektrode muss gespült oder ersetzt werden. Sobald die Aufzeichnungsapparatur betriebsbereit ist, bereiten Sie die Netzhautschnitte für das Experiment unter rotem Dämmerlicht vor; verwenden Sie die Spitze der heißen Präpariernadel, um die Sklera am dorsalsten Punkt jedes Augapfels einer euthanasierten, dunkeladaptierten Maus zu koagulieren. Anschließend enukleieren Sie die Augäpfel mit einer Schere.

Verwenden Sie stumpfe Pinzette, um die Augäpfel unter ein Zerlege-Mikroskop mit Infrarot-Beleuchtung und Infrarot-Bildwandlern zu übertragen. Alle weiteren Zerlegevorgänge werden unter Infrarotlicht durchgeführt. Anschließend öffnen Sie den Augapfel mit einer Mikroschere entlang des Äquators, mit Ausnahme der Kauterisierungsstelle.

Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um die Linse zu entfernen. Entfernen Sie anschließend so viel wie möglich von der Glaskörpersubstanz unter Verwendung der Koagulationsspitze als Referenz. Benutzen Sie eine Rasierklinge, um den ventralen Teil der Augenschale zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Hornhaut. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die dorsale Netzhaut von der Pigmentepithelschicht abzulösen. Danach legen Sie die Netzhaut mit der Rezeptorseite nach oben auf den Boden einer neuen Petrischale, die mit ein bis zwei Milliliter einer 10-Millimolar-Glucose-Referenzlösung mit 0,1 % BSA gefüllt ist, und drücken Sie sie vorsichtig mit einer Rasierklinge flach.

Schneiden Sie die Retina in kleine, dünne Stücke. Inkubieren Sie danach das Präparat in einer durchgehend mit reinem Sauerstoff gesättigten Lichtbox, bevor Sie die Retinaschnitte in die Ableitungskammer geben. Schalten Sie die Heizung vorübergehend aus.

Schalten Sie den Perfusionsfluss auf das Bypass-Rohr um. Entfernen Sie dann mithilfe eines Kim-Tuchs den größten Teil der Lösung aus der Kammer. Schalten Sie die Infrarotbeleuchtung ein.

Entfernen Sie die Netzhautsuspension aus dem Inkubator und überführen Sie die Schnitte in die Ableitungskammer. Lassen Sie die Schnitte mithilfe einer Pipette mit großer Öffnung zwei Minuten lang absetzen. Sobald die Netzhautschnitte abgesetzt haben, schalten Sie die direkte Perfusionszufuhr und die Heizung wieder ein.

Identifizieren Sie ein Stück Retina, bei dem die äußeren Segmente der Photorezeptoren hervorstehen. Positionieren Sie die Spitze der Aufnahmeelektrode über der äußeren nukleären Schicht der Retina, indem Sie mit Mundsaugung arbeiten. Ziehen Sie vorsichtig mehrere Photorezeptorzellkörper in die Elektrode hinein, wobei die Zellen in die Elektrode hineingezogen werden.

Geben Sie einen 20 Millisekunden langen Testblitz mit 500 Nanometern ab. Die lichtinduzierte Änderung des Stroms, der durch den Photorezeptor fließt, stellt die Antwort auf den Testblitz dar. Eine gesunde Zapfenzelle erzeugt eine maximale Antwortamplitude von vier bis sieben Pikoa, MPIs oder pA.

Wenn mit einem nicht abgeschwächten Testblitz stimuliert wird. Sobald eine geeignete Zelle gefunden ist, senken Sie vorsichtig per Hand das Mineralölniveau, um einen leichten negativen Druck an der Elektrodenspitze aufzubauen und so das innere Segment der Zelle in der Elektrode zu fixieren. Falls die Zelle anspricht, nehmen Sie eine Serie von Antworten auf Testblitze mit Intensitäten von der Schwellenintensität bis zur Sättigungsintensität auf.

Mithilfe dieser Technik können wir Konus-Fotoantworten aus Maus-Retinaschnitten mit Hilfe einer Saugelektrode erhalten. Hier ist eine Überlagerung mehrerer Aufzeichnungen derselben Zelle dargestellt. Die Fotoantworten eines einzelnen Konus wurden durch Testblitze mit zunehmender Intensität hervorgerufen, beginnend bei schwacher Intensität, die eine Schwellenantwort von etwa einem Pikoampere erzeugt, bis hin zu heller Intensität, die eine gesättigte Antwort von etwa 5,5 Pikoampere erzeugt.

Wenn die Blitzintensität erhöht wird, steigt die Amplitude der Lichtantwort, bis sie eine Sättigung erreicht. Die Blitze werden zum Zeitpunkt null gegeben. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie man Lichtantworten von einzelnen Moskito-Photorezeptoren mittels einer Saugelektrode aufzeichnet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, den do-do-Teil der Netzhaut zu entnehmen, die Netzhaut in dünne Schnitte zu zerteilen, die Elektrode sauber von Blasen zu halten und sowohl mechanische als auch elektromagnetische Störgeräusche zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.