Name: Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Lernen Sie die Saug-Elektroden-Technik zur Aufzeichnung von Blitzantworten einzelner Maus-Zapfen-Photorezeptoren. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zapfenzellen.

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Unterstützt von Career Development Award von der Forschung zur Blindheit, NIH EY 019312, und nicht zweckgebundenen Zuschuss von Forschung Prevent Blindness und EY 02687 (Department of Ophthalmology &amp; Visual Sciences an der Washington University) zu verhindern.

Herstellung von Elektroden <ol><li> Machen Sie die Aufnahme Elektroden mit einer Mikropipette Abzieher und polieren Sie die Elektroden mit Heizdraht unter dem Mikroskop. Für Maus Kegel Single-Cell-Saug-Aufnahme wird der innere Durchmesser der Elektrodenspitze ca. 6-7 um. </li><li> Bereiten Referenzelektroden. Wiegen Sie 1% Agar in destilliertem Wasser. Schmelzen Sie die Agar-Lösung in heißen Wasserbad. Füllen Sie das Glas Pipetten (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) mit 1% Agar mit Spritze. Festigen der Agar bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Schneiden Sie die Pipetten in zwei Hälften mit einem Diamant-Messer. </li><li> Weichen Sie die Referenz-Elektroden in Bezug Lösung für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C. </li></ol> Einrichten des Tests <ol start="5"><li> Dunkle anzupassen einer Maus in einem schwarzen Käfig über Nacht. </li><li> Bereiten Sie 100 mL Referenz-Lösung und 1 L Perfusionslösung (siehe unten) und filtrieren. </li><li> Man löst 0,1% BSA und 10 mM Glucose in 20 mL Referenzlösung. </li><li> Kalibrieren Sie die Lichtintensität der optischen Stimulator mit Photometer. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme Kammer auf der Bühne des inversen Mikroskop. </li><li> Blase die Perfusionslösung mit 95% O 2 / 5% CO 2 inkubieren es in 40 ° C Wasserbad, um die Löslichkeit von CO 2 zu erhöhen. Die Lösung fließt aus der Flasche, um die Aufnahme Kammer durch einen keramischen Widerstand Erwärmen auf 36-38 ° C. Die Heizung sollte möglichst nahe an der Aufnahme Kammer wie möglich, idealerweise in der Phase des Mikroskops liegen. </li><li> Passen Sie den Durchflussregler für einen Volumenstrom von ca. 1-1,5 mL / min. </li><li> Füllen Sie die Aufnahme-Elektrode mit Referenz-Lösung. Legen Sie die Elektrode in einen Elektrodenhalter. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Elektrode. Montieren Sie die Halterung auf der headstage des Verstärkers. Schließen Sie die Halterung an eine Absaugvorrichtung, die von Verbindungsschlauch teilweise mit Mineralöl auf die Seite-Port des Elektrodenhalter gefüllt gebaut wird. Das andere Ende des Schlauches ist zu einem kleinen Reservoir von Mineralöl verbunden, an dem Druck durch den Mund eingesetzt werden. </li><li> Schließen Sie die Referenz-Elektrode mit dem anderen Pol der headstage. Binden Sie die Thermoelement (TC) auf die Referenz-Elektrode. Sicherstellen, dass die Elektrode und TC Tipps sind nahe beieinander, so dass die Temperaturanzeige so nah an der Zelle wie möglich getroffen werden. </li><li> Schalten Sie den Infrarot-Beleuchtung, um die Elektrode zu visualisieren. Die Elektrode wird durch Infrarot-Kamera an einen Monitor. Zentrum der Elektrode Bild auf das Gesichtsfeld und der Monitor mit einem Mikro-Manipulator. </li><li> Passen Sie die Position der Referenzelektrode Spitze nahe (2-4 mm), um die Aufnahme Elektrodenspitze. </li><li> Stellen Sie die DC-Spannung für die Heizung, so dass die Temperatur der Lösung beträgt etwa 36-38 ° C. </li><li> Run eine Dichtheitsprüfung, um den Widerstand der Aufnahme Elektrode überprüfen, in der Regel ca. 900 kOhm. </li></ol> Isolieren Sie die Maustaste Netzhaut <ol start="18"><li> Unter dim rotes Licht, euthanize Dunkeln angepasst Maus mit CO 2 und Genickbruch. Markieren Sie die Augäpfel mit der Spitze eines heißen Metalls Fackel durch Ausbrennen der dorsale Punkt der Sklera leicht. Entkernen die Augäpfel mit einer Schere. Alle nachfolgenden Verfahren sind unter Infrarot-Licht durchgeführt. </li><li> Hemisect die Augäpfel unter dem Mikroskop mit Infrarot-Beleuchtung und Bildwandler. </li><li> Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. Entfernen Sie so viel von dem Glaskörper wie möglich. </li><li> Zur Aufnahme M-Kegel Antworten, entfernen Sie die ventralen Teil der Augenmuschel 4 mit einer Rasierklinge die Beurteilung aus dem Kauter zu markieren. </li><li> Peel die Netzhaut vom Pigmentepithel Schicht. </li><li> Flatten der Netzhaut und stelle sie auf den Boden der Petrischale mit 1-2 ml Referenzlösung gefüllt. </li><li> Scheiben der Netzhaut in kleine dünne Stücke mit einer Rasierklinge und inkubieren Sie die Zubereitung in einem lichtdichten Gehäuse mit reinem Sauerstoff gesättigt. </li></ol> Recordings <ol start="25"><li> Schalten Sie die Heizung vorübergehend. Schalten Sie die Perfusion Strömung zu einem Bypass-Schlauch, um die Kammer vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Lassen Sie die meisten der Lösung in die Kammer mit einem Stück Kimwipe Gewebe. Übertragen Sie die Netzhaut Federung, um die Aufnahme Kammer mit einer Glaspipette. </li><li> Warten Sie ca. 2 Minuten, bis die Netzhaut Scheiben nieder. Schalten Sie die Durchblutung wieder an. Schalten Sie die Heizung. </li><li> Schalten Sie Infrarot-Beleuchtung für die Vorbereitung zu visualisieren. Suche nach einem Stück der Netzhaut liegen auf der Kammer mit Photorezeptor äußeren Segmente herausragen (siehe Beispiel Abbildung). Draw inneren Segmente sanft in die Elektrode durch Absaugen. In dieser Konfiguration sollte mehrere Kerne und inneren Segmente in die Elektrode gezogen werden. Notieren Sie sich die Photoreaktion zu einem hellen Blitz zu testen, ob ein Kegel innere Segment in der Elektrode ist und ob die Zelle zu heilendein, die Beurteilung durch die Reaktion Kinetik und Amplitude. </li><li> Senken Sie den Mineral-Reservoir zu leichten Unterdruck an der Spitze der Elektrode zu helfen, halten Sie die innere Segment in der Elektrode gelten. </li><li> Rekord-Test-Flash-Reaktionen zwischen schwach und stark Intensität einmal eine gute Zelle gefunden wird. Testen Blitze aus einer kalibrierten optischen Stimulator 5 vorgesehen. Flash-Intensität und Wellenlänge sind durch eine Reihe von Neutralfilter und Schmalband-Interferenzfilter gesteuert. Testen Sie Blitzdauer (20 ms) wird vom Computer-gesteuerte Jalousien gesteuert. </li></ol> Lösungen <ol><li> Maus Perfusionslösung: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na-Succinat, 0,5 mM Na Glutamat, 0,02 mM EDTA, und 10 mM Glukose. </li><li> Maus Aufzeichnung Elektrode Lösung: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Einzel-Zell-Saug-Aufnahme von Sehzellen war 3 Jahrzehnten entwickelt. Es ermöglicht uns, trans-Membran Stromänderung durch Licht Stimulation ohne die Zellmembran überwinden induzierte aufzunehmen. Wegen der hohen Zell-Zell-Adhäsion, ist es schwierig, gesunde einzelnen Stäbchen und Zapfen von der Maus Netzhaut wie Amphibien Netzhaut zu isolieren und es ist schwer, einzelne Zapfen aufgrund der geringen Prozentsatz (3%) und kleine Größe zu finden. Die Innen-Segment-in (IS-in)-Aufzeichnungsverfahren überwindet diese Schwier...

einzel-zell-saug-recordings aus maus zapfen-photorezeptoren

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod und Zapfen-Photorezeptoren in der Netzhaut sind verantwortlich für light detection. In der Dunkelheit sind zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanäle in das äußere Segment offen und ermöglichen Kationen stetig nach innen fließen durch die Membran, depolarisierende der Zelle. Belichtung löst die Schließung des CNG-Kanäle, die Blöcke der inneren Kationen Stromfluss und damit Ergebnisse in Zelle Hyperpolarisation. Basierend auf der Polarität von Photorezeptoren, wurde eine Saug-Aufnahme-Methode in den 1970er Jahren, dass, im Gegensatz zu den klassischen Patch-Clamp-Technik, nicht erforderlich ist Eindringen in die Plasmamembran entwickelt<sup&gt; 1</sup&gt;. Drawing das äußere Segment in ein eng anliegendes Glaspipette mit extrazellulären Lösung gefüllt ermöglicht die Aufzeichnung des aktuellen Veränderungen in einzelnen Zellen auf Test-Blitzbelichtung. Doch diese gut etablierte &quot;outer-Segment-in (OS-in)&quot; Saug-Aufnahme ist nicht geeignet für Maus Konus-Aufnahmen, da der geringe Anteil der Zapfen in der Netzhaut der Maus (3%) und die Schwierigkeiten bei der Identifizierung des Kegels äußeren Segmente. Kürzlich wurde eine innere-Segment-in (IS-in) Aufnahme-Konfiguration entwickelt, um das innere Segment / Kernregion des Photorezeptors in die Aufnahme Pipette ziehen<sup&gt; 2,3</sup&gt;. In diesem Video zeigen wir, wie man aus einzelnen Maus Kegel Photomorphosen mit Single-Cell-Saugelektrode aufzunehmen.

Wir werden zeigen, wie man Flash-Antworten von einfachen Mausklick Kegel mit einem Saug-Elektrode aufnehmen.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren in der Retina sind für die Lichtdetektion verantwortlich. In Dunkelheit sind zyklische Nukleotid-gesteuerte (CNG) Kanäle im Außensegment ...

Dieses Video zeigt die Dissektion der Mausretina und anschließende Gewinnung von Einzelzell-Saugaufzeichnungen für Zapfen. Die Augäpfel einer euthanasierten, dunkeladaptierten Maus werden im dorsalen Bereich verätzt und unter schwachem rotem Licht enukleiert. Anschließend werden die Augäpfel halbiert und in Sektoren unterteilt.Entlang des Äquators werden dann die Hornhaut und die ventralen Teile der Augäpfel entfernt. Die dorsale Netzhaut wird von der Pigmentepithelschicht isoliert und mit einer Rasierklinge in kleine, dünne Stücke geschnitten. Die Netzhautschnitte werden anschließend in die Ableitungskammer gegeben, die auf einen Mikroskopständer passt.Mehrere Photorezeptorzellkörper werden in die Ableitelektrode hineingezogen. Wenn ein Zapfenphotorezeptor in die Elektrode gezogen wird, induziert ein heller Testblitz eine photoelektrische Antwort mit einer Amplitude von mehr als vier Pikoa mpere. Hallo. Hallo. Ich bin Jin aus dem Labor von Dr. Mir Kops in der Abteilung für Augenheilkunde und dem visuellen Zensus an der Washington University in St. Louis.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufzeichnung von Lichtantworten einzelner Moscon-Photorezeptoren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Anpassungseigenschaften von Säugetier-Kegeln zu untersuchen, den Photorezeptoren, die unsere Tagessicht vermitteln. Beginnen wir also.Am Tag vor der Aufnahme das Experiment im Dunkeln vorbereiten. Eine Maus anpassen, indem sie über Nacht in einen lichtdichten Käfig gestellt wird. Mit einem Mikropipettenzug eine Aufnahmeelektrode aus Borosilikatglasröhrchen unter einem zusammengesetzten Mikroskop herstellen.Verwenden Sie einen Heizfaden zum Beschleunigen. Polieren Sie die Spitze jeder Elektrode, um sie zu glätten und ihre Öffnung auf den gewünschten Durchmesser zu verkleinern. Für die Einzelzellabsaugung eines Mauszapfens sollte der Innendurchmesser an der Elektrodenspitze etwa sechs bis sieben Mikrometer betragen.Stellen Sie eine 1 %ige Agar-Lösung in destilliertem Wasser her. Erhitzen Sie die Lösung im siedenden Wasser, um den Agar zu schmelzen. Sobald der Agar geschmolzen ist, füllen Sie die Lösung in eine Spritze und damit die Glaspipetten.Um Referenzelektroden herzustellen, lassen Sie diese 10 Minuten bei Raumtemperatur erstarren. Nachdem das Agar erstarrt ist, schneiden Sie jede Pipette mit einem Diamantmesser in zwei Hälften, um zwei Referenzelektroden zu erhalten. Stellen Sie die Referenzelektroden in ein Szintillationsfläschchen, das mit Referenzlösung gefüllt ist, und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden bei vier Grad Celsius einweichen, damit die Lösung in das Agar-Gel eindringen kann.Bezugselektroden können ab dem Zeitpunkt der Herstellung bis zu drei Monate lang verwendet werden. Nach Gebrauch werden die Elektroden nach dem Experiment entsorgt. Das Aufnahmesystem besteht aus einem umgekehrten Mikroskop, das auf einem luftgefederten Tisch montiert ist, um Vibrationsgeräusche zu minimieren, und das durch einen Abschirmkäfig geschützt ist, um elektromagnetische Störungen zu reduzieren.Ein motorisierter Mikromanipulator wird zur Positionierung der Ableitelektrode verwendet. Der optische Stimulator besteht aus einer Wolframfadenlampe, computergesteuerten Blenden und optischen Filtern zur Steuerung von Wellenlänge und Lichtintensität. Ein Patch-Clamp-Verstärker dient zum Nachweis von Membranströmen einzelner Photorezeptorzellen.Während der gesamten Aufzeichnungen wird das Gewebe perfundiert. Stellen Sie einen Liter des zubereiteten Perfusionspuffers in ein 40 Grad Celsius warmes Wasserbad in der Nähe des Aufzeichnungssystems. Verbinden Sie dann mithilfe von Schläuchen den Perfusionspuffer mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, sodass er kontinuierlich durchblubbert wird.Messen Sie mit einem Photometer die ungedämpfte Lichtleistung des ungedämpften Lichts vom optischen Stimulator, wobei der Detektor des Photometers in der Ebene auf dem Mikroskoptisch platziert wird, in der die Probe angeordnet wird. Konvertieren Sie anschließend die Angabe in Mikrowatt in Photonen pro Quadratmikrometer pro Sekunde, um die Anzahl der Photonen pro Testimpuls abzuschätzen, unter Berücksichtigung der Lichtdämpfung durch Neutraldichtefilter.Nachdem die nicht abgeschwächte Lichtleistung gemessen wurde, entfernen Sie das Photometer vom Objekttisch und befestigen die für die Experimente verwendete Aufnahmekammer auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops. Verbinden Sie mittels Schläuchen die Perfusionslösungflasche über ein Regulierungsventil mit der Aufnahmekammer. Führen Sie den Schlauch durch einen Heizwiderstand.Stellen Sie sicher, dass der Heizwiderstand unmittelbar vor der Ableitungskammer platziert ist. Anschließend verbinden Sie den Umgehungsschlauch vom Regulierventil mit der Ableitungskammer. Starten Sie die Perfusion, indem Sie das Durchflussregulierventil öffnen und den Durchfluss auf eine Rate von ein bis 1,5 Milliliter pro Minute einstellen.Die Perfusionslösung fließt durch Schwerkraft aus der Ableitungskammer in einen Sammelflasche. Füllen Sie mit einer Spritze und einer stumpfen Nadel die Elektrodenhalter mit Referenzlösung. Füllen und spülen Sie die Ableitelektrode mit einer Mikrofüllspritze und deren Nadel mit Referenzlösung, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen in der Elektrode befinden.Setzen Sie die Referenzelektrode in einen Elektrodenhalter ein und verbinden Sie sie mit dem Referenzpol der Verstärkerkopfstufe. Befestigen Sie das Thermoelement mit einem Gummiring an der Referenzelektrode. Achten Sie darauf, dass die Spitzen der Elektrode und des Thermoelements nahe beieinander liegen, um sicherzustellen, dass die Temperaturmessung so nah wie möglich an der Zelle erfolgt.Danach die Ableitelektrode in einen Elektrodenhalter einsetzen und den Halter an der Kopfstufe des Verstärkers befestigen. Mithilfe von Schläuchen einen kleinen Vorratsbehälter mit Mineralöl mit dem Seitenanschluss des Elektrodenhalters verbinden. Durch sanftes Ansaugen mit dem Mund über den mit dem Behälter verbundenen Schlauch wird die Zelle in die Elektrode gezogen.Öffnen Sie mithilfe der Computersoftware einen der Verschlüsse des optischen Stimulators. Um den Strahlbereich des Testblitzes auf dem Mikroskopständer sichtbar zu machen, fokussieren Sie das Mikroskop auf den Boden der Ableitungskammer. Bewegen Sie mit Hilfe des Mikromanipulators die Elektrode in die Mitte des Strahlbereichs des Testblitzes.Platzieren Sie die Referenzelektrode nahe der Spitze der Ableitelektrode. Stellen Sie die Spannung für die Heizung so ein, dass die Temperatur der Lösung in der Ableitkammer etwa 36 bis 38 Grad Celsius beträgt. Führen Sie einen Dichtetest durch, bei dem die Spannung zur voreingestellten Stromamplitude gemessen wird, um den Widerstand zu berechnen und den Widerstand der Ableitelektrode zu überprüfen, der normalerweise etwa 900 Kiloohm beträgt.Der Dichttest ermöglicht den Nachweis von Bläschen in der Ableitelektrode oder Referenzelektrode oder einer ungeeigneten Spitzengröße der Ableitelektrode. Der Dichttest wird softwaregesteuert über das Aufnahmeprogramm Clamp X kontrolliert. Der Widerstandswert wird auf dem Computerscreen angezeigt. Wenn der Widerstand zu niedrig ist, weniger als 500 Kiloohm, ist die Spitze der Elektrode vermutlich zu groß und es muss eine neue Elektrode eingesetzt werden.Wenn der Widerstand höher als ein Milliohm ist, könnte eine Blase in der Elektrode vorhanden sein oder deren Spitze ist zu eng, und die Elektrode muss gespült oder ersetzt werden. Sobald die Aufzeichnungsapparatur betriebsbereit ist, bereiten Sie die Netzhautschnitte für das Experiment unter rotem Dämmerlicht vor; verwenden Sie die Spitze der heißen Präpariernadel, um die Sklera am dorsalsten Punkt jedes Augapfels einer euthanasierten, dunkeladaptierten Maus zu koagulieren. Anschließend enukleieren Sie die Augäpfel mit einer Schere.Verwenden Sie stumpfe Pinzette, um die Augäpfel unter ein Zerlege-Mikroskop mit Infrarot-Beleuchtung und Infrarot-Bildwandlern zu übertragen. Alle weiteren Zerlegevorgänge werden unter Infrarotlicht durchgeführt. Anschließend öffnen Sie den Augapfel mit einer Mikroschere entlang des Äquators, mit Ausnahme der Kauterisierungsstelle.Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um die Linse zu entfernen. Entfernen Sie anschließend so viel wie möglich von der Glaskörpersubstanz unter Verwendung der Koagulationsspitze als Referenz. Benutzen Sie eine Rasierklinge, um den ventralen Teil der Augenschale zu entfernen.Entfernen Sie dann die Hornhaut. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die dorsale Netzhaut von der Pigmentepithelschicht abzulösen. Danach legen Sie die Netzhaut mit der Rezeptorseite nach oben auf den Boden einer neuen Petrischale, die mit ein bis zwei Milliliter einer 10-Millimolar-Glucose-Referenzlösung mit 0,1 % BSA gefüllt ist, und drücken Sie sie vorsichtig mit einer Rasierklinge flach. Schneiden Sie die Retina in kleine, dünne Stücke. Inkubieren Sie danach das Präparat in einer durchgehend mit reinem Sauerstoff gesättigten Lichtbox, bevor Sie die Retinaschnitte in die Ableitungskammer geben. Schalten Sie die Heizung vorübergehend aus.Schalten Sie den Perfusionsfluss auf das Bypass-Rohr um. Entfernen Sie dann mithilfe eines Kim-Tuchs den größten Teil der Lösung aus der Kammer. Schalten Sie die Infrarotbeleuchtung ein.Entfernen Sie die Netzhautsuspension aus dem Inkubator und überführen Sie die Schnitte in die Ableitungskammer. Lassen Sie die Schnitte mithilfe einer Pipette mit großer Öffnung zwei Minuten lang absetzen. Sobald die Netzhautschnitte abgesetzt haben, schalten Sie die direkte Perfusionszufuhr und die Heizung wieder ein.Identifizieren Sie ein Stück Retina, bei dem die äußeren Segmente der Photorezeptoren hervorstehen. Positionieren Sie die Spitze der Aufnahmeelektrode über der äußeren nukleären Schicht der Retina, indem Sie mit Mundsaugung arbeiten. Ziehen Sie vorsichtig mehrere Photorezeptorzellkörper in die Elektrode hinein, wobei die Zellen in die Elektrode hineingezogen werden.Geben Sie einen 20 Millisekunden langen Testblitz mit 500 Nanometern ab. Die lichtinduzierte Änderung des Stroms, der durch den Photorezeptor fließt, stellt die Antwort auf den Testblitz dar. Eine gesunde Zapfenzelle erzeugt eine maximale Antwortamplitude von vier bis sieben Pikoa, MPIs oder pA.Wenn mit einem nicht abgeschwächten Testblitz stimuliert wird. Sobald eine geeignete Zelle gefunden ist, senken Sie vorsichtig per Hand das Mineralölniveau, um einen leichten negativen Druck an der Elektrodenspitze aufzubauen und so das innere Segment der Zelle in der Elektrode zu fixieren. Falls die Zelle anspricht, nehmen Sie eine Serie von Antworten auf Testblitze mit Intensitäten von der Schwellenintensität bis zur Sättigungsintensität auf.Mithilfe dieser Technik können wir Konus-Fotoantworten aus Maus-Retinaschnitten mit Hilfe einer Saugelektrode erhalten. Hier ist eine Überlagerung mehrerer Aufzeichnungen derselben Zelle dargestellt. Die Fotoantworten eines einzelnen Konus wurden durch Testblitze mit zunehmender Intensität hervorgerufen, beginnend bei schwacher Intensität, die eine Schwellenantwort von etwa einem Pikoampere erzeugt, bis hin zu heller Intensität, die eine gesättigte Antwort von etwa 5,5 Pikoampere erzeugt.Wenn die Blitzintensität erhöht wird, steigt die Amplitude der Lichtantwort, bis sie eine Sättigung erreicht. Die Blitze werden zum Zeitpunkt null gegeben. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie man Lichtantworten von einzelnen Moskito-Photorezeptoren mittels einer Saugelektrode aufzeichnet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, den do-do-Teil der Netzhaut zu entnehmen, die Netzhaut in dünne Schnitte zu zerteilen, die Elektrode sauber von Blasen zu halten und sowohl mechanische als auch elektromagnetische Störgeräusche zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit...

Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Quelle: Kulkarni, M. et al. Bildgebung von Ca2+ Dynamik in den Axon-Terminals der Zapfen-Photorezeptoren der Netzhaut der Maus. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in Zapfen-Photorezeptoren einer transgenen Mausnetzhaut. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung von Netzhautschnitten, zur Bildgebung von FRET-basierten Kalzium-Biosensoren und zur Analyse von Fluoreszenzänderungen zur Quantifizierung des...

Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in retinalen Zapfen-Photorezeptoren von Mäusen

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Neuronale Netzhaut einer Maus im Alter von 8 Tagen auf einem 4% igen Gelatineblock. Nach Isolierung der Photorezeptorschicht (200 um) durch Vibratom werden die Photorezeptoren nach der mechanischen und enzymatischen Spaltung der Kultur beimpft. Die Photorezeptorschicht kann für die molekulare, biochemische Analysen oder Transplantation verwendet werden.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von Primärkulturen von Zapfenphotorezeptoren aus der Netzhaut von Hühnerembryonen und deren Verwendung für ein High-Content-Screening.

Mit Zapfen angereicherte Kulturen von der Netzhaut von Hühnerembryonen zur Untersuchung zellulärer Interaktionen von Stäbchen zu Zapfen

Lernen Sie die Saug-Elektroden-Technik zur Aufzeichnung von Blitzantworten einzelner Maus-Zapfen-Photorezeptoren. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zapfenzellen.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

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