Name: Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Real-Time-PCR mit Solaris-Assays zur hochspezifischen Genexpressionsanalyse. Diese Methode erkennt alle Spleißvarianten und liefert reproduzierbare Ergebnisse für humane und murine Gene.

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1. Die Thermo Scientific Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus <ol><li> Der Algorithmus in das Design der Solaris qPCR Sonde / Primerpaare verwendet passt die Tm jeder Komponente wodurch universelle Radfahren Bedingungen. Der Einbau der MGB, oder kleine Furche binden, Einheit in der Sonde erhöht die Tm und ermöglicht kürzere Sonden, um eine größere Assay Flexibilität und Leistung ausgelegt sein. Wie ihr Name schon sagt, sind MGBs eine Klasse von Antibiotika, die in die kleine Furche der DNA-Helix passt. MGBs sind die 3 oder 5 Ende einer DNA-Sonde befestigt. In Lösung wird die FAM-Reporter Fluoreszenz der Sonde von Eclipse Dunkle Quencher gequencht. Wenn die Sonde an eine Zielsequenz bindet, kann die daraus resultierende Veränderung in der Sonde s 3-D-Konformation ein starkes Fluoreszenzsignal. Die Bindung der DNA-Sonde zur Zielsequenz wird durch die MGB, die den Einsatz von hochspezifischen, kürzere Sonden ermöglicht und gleichzeitig die entsprechende Schmelztemperatur für PCR stabilisiert. So tritt Signalerkennung beim Glühen Phase der Target-Amplifikation. Während der Erweiterung Schritt distanziert die MGB-Sonde und die Fluoreszenz wieder abgeschreckt. Weil die Sonde distanziert, hat dies keine Auswirkungen PCR-Effizienz. </li><li> Ein weiteres Merkmal der Solaris-Algorithmus ist die Verwendung von Superbases. Superbases sind Grundlagen, die verbindliche Fähigkeiten verbessert haben, um die Stabilität von AT-Anleihen zu verbessern und zu beseitigen GG Selbstassoziation in Guanin reiche Sequenzen modifiziert. Hinzu kommt, dass sie nicht auslöschen benachbarten Fluorophoren an der 5-Terminus angehängt. Diese Basen sind selektiv platziert, nach dem Algorithmus, um die Verfügbarkeit von Zielsequenzen zu erweitern. Dies macht es möglich, Sequenzen, wie GC-reiche Regionen, die sonst in der Gestaltung Primer und Sonden vermieden werden verwenden würde. </li><li> Wann immer möglich, enthält die Solaris-Algorithmus Exon Junction Spanning Regionen in der Ziel-Site. Dies erhöht die Spezifität durch die Vermeidung der Verstärkung der Verunreinigung genomischer DNA. </li><li> Wichtig ist, dass der Algorithmus identifiziert auch eine Konsensus-Sequenz für alle bekannten Splice-Varianten, so dass alle von einer einzigen Sonde / Primer-Set abgedeckt sind. So ist nur ein Test für ein bestimmtes Gen von Interesse erforderlich. </li><li> Schließlich nutzt das Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus sehr strenge Parameter für kritische Überlegungen zum Entwurf einschließlich GC-Gehalt, Länge, Tm, und erstreckt sich von homogenen Nukleotiden. Die resultierenden Sequenzen BLAST für die Spezifität mit 3 verschiedenen Datenbanken analysiert: genomische, Transkript, und Pseudogen. </li></ol> 2. Beziehen Solaris Reagenzien <ol><li> Um die entsprechende Solaris Reagenzien, besuchen <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Sobald Sie auf der Website auf "GENEius Produktsuche" klicken. Um direkt zu den GENEius Produkt zu suchen, gehen <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Klicken Sie in der Suchanfrage ein und wählen Sie den entsprechenden Zielorganismen. </li><li> Die GENEius Produktsuche verarbeiten kann viele verschiedene Gen-IDs. Geben Sie hier eine der vorgeschlagenen Suchbegriffen, um das Gen von Interesse, einschließlich Ref Seq Beitritt, der Gene-ID, die Gene Symbol, ein Gene Beschreibung der Sanger-ID oder Zugangsnummer oder eine Katalog-Nummer zu finden. Dann auf "Suchen" klicken. </li><li> Identifizieren des Gens von Interesse und klicken Sie auf "Auswählen" auf der linken Seite. Es öffnet sich ein Fenster, das die verschiedenen Thermo Scientific Produkte für das Gen von Interesse zeigt. Unter "Produkte" die Option "qPCR Detection" Tab. </li><li> Unter dem "Solaris Gene Expression Assay" Überschrift, sehen Sie eine optimal Solaris Sonde / der Primer-Assay entwickelt. Dieser Test deckt alle bekannten Spleißvarianten des Gens Ziel. Wählen Sie die gewünschte Menge. Sie sind in 100, 200, 400 zur Verfügung, und 1000 X 25 ul Reaktionen (wenn der Test als made-to-order identifiziert wird, die 100 Packungsgröße nicht verfügbar). Klicken Sie auf "In den Warenkorb". </li><li> Als nächstes wählen Sie den entsprechenden Master-Mix für den Thermocycler, die verwendet werden. Um festzustellen, welche Master-Mix funktioniert am besten mit der Maschine zur Verfügung, klicken Sie auf "Finden Sie heraus, welche Master Mix am besten mit Ihrem PCR Cycler!" </li><li> Finden Sie die qPCR-Cycler, dass auf der Speisekarte verwendet werden, um festzustellen, welcher Mix zu verwenden. </li><li> Zurück zur GENEius Produktsuche Fenster, und wählen Sie den entsprechenden Master-Mix. Der Master-Mix kommt in 100, 200, 400 und 1000 Reaktion Größen. Klicken Sie auf "In den Warenkorb". </li><li> Zitiervorschlag Gene und verso cDNA-Synthese-Kits können auch für eine vollständige qRT-PCR-Analyse bestellt werden. </li><li> Wenn das Solaris-qPCR-Reagenzien kommen, bewahren Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Die folgenden Reagenzien empfangen werden soll: Ein 20fach-Lösung mit zwei Primern bei 800 nm und je einem Gen spezifischen Sonde bei 200 nm, sequ vorgesehenENCE Informationen sowohl für die Sonde und die Primer-und Solaris-qPCR Gene Expression Master Mix in einer 2X-Konzentration. Solaris qPCR Gene Expression Assays sind für mindestens 12 Monate stabil. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 3. qPCR-Setup <ol><li> Beginnen Sie mit der qPCR-Protokoll mit cDNA. Gesamt-RNA extrahiert sollte mit einem Spin-Säule Methode. Die Thermo Scientific Verso cDNA-Synthese-Kit ist für die reverse Transkription in cDNA zu erzeugen empfohlen. </li><li> Bereiten Sie sich für qPCR durch Auftauen der Primer, Sonden und Master-Mix auf Eis. Auch zur Hand haben PCR-Wasser und Deckweiß qPCR-Platten, die die Sensitivität der Real-time PCR zu verbessern. </li><li> Der Master-Mix enthält alle Komponenten für die Echtzeit-PCR einschließlich: 1) Thermo-Start-DNA-Polymerase, ein Hot-Start-Version von Thermoprime DNA-Polymerase. Diese Art der Polymerase wird verwendet, um unspezifische Amplifikation während der Reaktion-Einrichtung zu vermeiden und erfordert die Aktivierung bei 95 ° C 15 min. 2) dNTPs in der Solaris-Master-Mix, ersetzt dTTP dUTP zu Amplifikationseffizienz 3) Proprietary Reaktionspuffer, optimiert, um mit Solaris Primer / Sonden-Assays zu maximieren. Diese Reaktion Puffer enthält blauen Farbstoff, um den Kontrast zwischen Reagenz und Kunststoff zu erhöhen. 4) ROX, wenn Ihr qPCR Gerät benötigt ROX. </li><li> Nachdem die Lösungen aufgetaut haben, Dazu den Schlauch (nicht vortexen) mischen. Spin sie nieder, um den Verlust von Reagenz zu verhindern. </li><li> Als nächstes bereiten ein 15 mL sterile Falcon-Röhrchen zum Einrichten der Reaktion Mix für das Gen von Interesse, plus einer für den Gen, Scaling-up in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben. Bereiten Sie genug, so dass drei Wiederholungen kann für jede Probe vorbereitet werden, einschließlich einer Nicht-Template (NTC) und Standard-Kurve Proben, wenn die Standard-Kurve zur Analyse verwendet werden. </li><li> Für jede Probe auf einer 96-Well-Platte laufen, mischen Sie die folgenden: 5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen einmal die cDNA angefügt werden mit 25 ul werden. Für jede Probe auf einer 384-Well-Platte laufen Mix folgende: 12,5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen, sobald die cDNA hinzugefügt werden 10 ul werden. </li><li> Mit einer Multi-Kanal-Pipette, übertragen Sie die Master-Mix in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Der blaue Farbstoff in der Master-Mix enthalten wird bei der Verfolgung Pipettieren Fortschritte auf dem weißen Teller Hilfe. Dann fügen Sie von 1-5 ul cDNA-Template (für eine 96-Well-Platte) oder 1-2 ul der cDNA-Template (für eine 384-Well-Platte). Pipette auf und ab zu mischen. Die Platte wird in eine Zentrifuge und Spin-Down, um Luftblasen zu entfernen, da diese mit der Fluoreszenz-Messungen stören. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler: Das Enzym muss aktiviert werden, eine 95 ° C 15 min (1 Zyklus). Dann wurden 40 Zyklen von 95 ° C, Denaturierung für 15 Sekunden und Annealing und Extension bei 60 ° C für 60 Sekunden. </li><li> Die Platte wird in der qPCR Instrument. Starten Sie das Programm. </li></ol> Vertreter qPCR Ergebnisse mit Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Solaris-Assays geben zuverlässige Erkennung selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen Eingang, wie die PCR-Effizienz und r2-Werte beurteilt. Zehn 10-fache Verdünnungen der cDNA aus synthetischen RNA-Amplikon DNA-Sequenz oder Amplikon-Sequenz synthetisiert wurde auf einem ABI 7900HT Instrument mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für F2RL1 oder Cdc20 bzw. verstärkt. Die log-Skala Amplifikationskurven und Standard-Kurven sind zusammen mit der Leistung der einzelnen Tests einschließlich Effizienz, r2 Wert, Dynamikbereich von 10 log10 Verdünnungen und die untere Nachweisgrenze dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Solaris Assays geben konsistente Ergebnisse auch zwischen verschiedenen Forscher und Laboratorien. siRNAs ALDOA und PPIB, sowie eine Non-Targeting-Control (NTC), wurden in HeLa-Zellen bei 100, 10, 1 und 0,1 nM Endkonzentration transfiziert. Die Zellen wurden geerntet und Gesamt-RNA isoliert 48 Stunden nach der Behandlung. cDNA wurde unter Verwendung von Thermo Scientific Verso cDNA Synthesis Kit. Ein Aliquot der cDNA wurde in zwei räumlich getrennten Labors verstärkt mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für den Nachweis von ALDOA, PPIB und GAPDH auf einem Roche LightCycler 480 (384er)-Plattform. Knockdown wurde anhand der ΔΔCq Methode (normiert auf GAPDH Referenz-Gens und NTC-behandelten Zellen). Das gleiche Maß an Knockdown wurden für beide Gen-Targets zwischen beiden Forscher an beiden Standorten unter Beweis gestellt.

Die Autoren dieses Artikels sind die Mitarbeiter von Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris qPCR-Assays bieten eine einfache, verbesserte Verfahren zur Durchführung von qPCR-Analyse. Mit einer hohen Stringenz Algorithmus unter Einbeziehung MGB-Technologie und Superbases maximieren diese Primer und Sonde setzt die Treue und die Robustheit der qPCR-Experimente. Ein Primer und Sonde gesetzt erkennt alle bekannten Spleißvarianten eines bestimmten Gens. Die Ziel-Website, wo immer möglich, umfasst Exon Spanning Regionen, um sicherzustellen, dass genomische DNA nicht verstärkt wird. Diese Eigenschaften machen es möglich, zahlreiche Proben gleichzeitig ausgeführt werden, sehr zur Verringerung der Menge an Zeit benötigt, um komplexe Experimente durchzuführen. Da die Master-Mix ist blau, ist es möglich, weiß-opake Platten, die die Empfindlichkeit der qPCR zu verbessern, ohne den Überblick zu verlieren Pipettieren verwenden. Zusammengenommen machen die Design-Merkmale der Solaris qPCR Assay diesem Roman qPCR Assay eine einfache, aber leistungsfähige Test, dass sowohl spezifische als auch robust ist.

quantitative real-time pcr unter verwendung der thermo scientific solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Die Solaris qPCR Gene Expression Assay ist eine neue Art von Primer / Sonden gesetzt, entwickelt, um die qPCR-Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays. Diese Primer / Sonden-Sets sind zu&gt; 98% der humanen und Maus-Genom und verfügen über signifikante Verbesserungen von bereits verfügbaren Technologien pre-designed. Diese Verbesserungen waren möglich durch ein neuartiges Design-Algorithmus von Thermo Scientific Bioinformatik-Experten entwickelt. Mehrere praktische Funktionen wurden in die Solaris qPCR Assay um den Prozess der Durchführung quantitativer real-time PCR rationalisieren eingeflossen. Zuerst wird das Protokoll ähnlich üblicherweise eingesetzten Alternativen, so dass die Methoden bei der qPCR verwendet werden wahrscheinlich vertraut sein. Zweitens ist die Master-Mix Blau, das macht die Einstellung der qPCR Reaktionen leichter zu verfolgen. Drittens sind die Temperaturwechsel die gleichen Bedingungen für alle Assays (Gene), die es ermöglichen, viele Proben gleichzeitig ausgeführt und reduzieren das Potenzial für Fehler. Schließlich werden die Sonde und Primer-Sequenz zur Verfügung gestellten Informationen und vereinfacht den Publikationsprozess. Hier zeigen wir, wie Sie die entsprechenden Solaris Reagenzien mit dem GENEius Produkt Suchfunktion auf der Website zum Bestellen (www.thermo.com / Solaris) und wie die Solaris-Reagenzien für die Durchführung von qPCR mittels Standardkurve Methode gefunden zu erhalten.

Die Solaris qPCR Gene Expression Assays sind neuartige pre-designed qPCR Primer / Sonden-Kombinationen entwickelt, um die qPCR-Prozess, ohne die Spezifität und Robustheit des Tests zu vereinfachen.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Das Solaris qPCR Gene Expression Assay ist eine neuartige Art von Primer/Sonden-Set, das entwickelt wurde, um den qPCR-Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig die Sensitivität und ...

In diesem Videoartikel wird die Echtzeit-PCR anhand von Solaris QPCR-Assays demonstriert. Solaris QPCR-Assays sind gen-spezifische Sonden- und Primer-Reagenzien, die zur Detektion aller bekannten Spleißvarianten eines bestimmten Gens entwickelt wurden. Unter universellen Thermocycling-Bedingungen trägt die Solaris-Sonde am Fünf-Prime-Ende einen Minor-Groove-Binder, eine funktionelle Gruppe und einen FA-Reporter sowie am Drei-Prime-Ende einen abgeschirmten Dunkelquencher.Während des Denaturierungsschritts der Echtzeit-PCR bleibt die Sonde in Lösung, und die Fluoreszenz des FAM-Reporters wird unterdrückt. Während der Annealing- und Verlängerungsphasen binden die Primer in der Sonde an die Zielsequenz, und der Quencher wird von FAM getrennt. FAM gibt dann ein starkes fluoreszierendes Signal ab; wenn die Sonde dissoziiert, wird die Fluoreszenz erneut unterdrückt.Es werden Echtzeit-PCR-Ergebnisse erzielt, die die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit dieses effizienten Assays belegen. Hallo, ich bin James Covino vom Forschungs- und Entwicklungsteam von Thermo Fisher Scientific in Lafayette, Colorado. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung einer Standard-QPCR-Reaktion unter Verwendung der Lars-QPCR-Reagenzien für die Genexpression.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herabregulation gezielt ausgewählter Gene mithilfe der RNA-Interferenz-Technologie zu untersuchen. Beginnen wir also. Der Solaris QPCR-Assay STEM zeichnet sich durch einen einzigartigen Algorithmus aus, der MGB- und Superbase-Technologien nutzt, um einen einzigen, praktischen Assay für 98 % der annotierten Gene von Mensch und Maus bereitzustellen.Normalerweise ist die Gestaltung von DNA-Sonden und Primern durch die Schmelztemperatur der Sonde begrenzt, die sich aus der Anzahl und Art der Basen ergibt. Längere Sequenzen und GC-reiche Sequenzen weisen höhere Schmelztemperaturen auf. Die in Solaris-Sonden verwendete Minor-Groove-Binding-Gruppe lagert sich in die Minor-Groove der DNA-Doppelhelix ein und stabilisiert die Wechselwirkung zwischen Sonde und Zielsequenz.Dies erhöht die Schmelztemperatur und ermöglicht die Verwendung kürzerer Sonden. Der Solaris-Algorithmus integriert außerdem selektiv modifizierte Nukleotide, sogenannte Superbasen, um die Stabilität von AT-Bindungen zu verbessern und die Selbstassoziation von GG in guaninreichen Sequenzen zu vermeiden. Dadurch können Targetsequenzen verwendet werden, die ansonsten vermieden würden.Die durch die Verwendung dieser Technologien ermöglichte erhöhte Sequenzflexibilität erlaubt die Konzeption von Primer-Sonden-Sets, die alle bekannten Spleißvarianten eines einzelnen Gens erkennen. Beachten Sie, dass nach Möglichkeit Bereiche, die Exon-Übergänge überspannen, in die Zielregion eingebaut wurden, um die Spezifität zu erhöhen und die Amplifikation kontaminierender genomischer DNA zu vermeiden. Die resultierenden Primer-Sonden-Sets werden mittels Blast-Analyse mit drei verschiedenen Datenbanken – genomische Transkripte und Pseudogene – überprüft, um die Spezifität sicherzustellen. Darüber hinaus wurden die Solaris-Primer-Sonden-Sets vollständig optimiert, sodass die Zyklenbedingungen für alle QPCR-Assays identisch sind, was es ermöglicht, die Expression verschiedener Transkripte in einzelnen PCR-Durchläufen zu bestimmen.Um mit der Planung des qPCR R-Experiments zu beginnen, identifizieren Sie die benötigten Reagenzien, um die qPCR für das Gen von Interesse mithilfe der Genius-Produktsuche durchzuführen, die unter thermo.com/solaris verfügbar ist. Klicken Sie in das Sucheingabefeld und wählen Sie den geeigneten Zielorganismus aus. Die Genius-Produktsuche kann verschiedene Genbezeichner verarbeiten. Hier.Geben Sie einen der vorgeschlagenen Suchbegriffe für das Gen Ihrer Wahl ein, klicken Sie dann auf „Suchen“, identifizieren Sie das Gen Ihrer Wahl und klicken Sie links auf „Auswählen“. Daraufhin öffnet sich ein Fenster, das die verschiedenen verfügbaren Reagenzien für das Gen Ihrer Wahl anzeigt. Klicken Sie auf den Tab „QPCR-Detektion“ unter dem Solaris-Genexpressionsassay.Ein optimal gestalteter Solaris-Sonden-Primer-Assay mit Überschrift eins wird angezeigt. Dieser eine Assay weist alle bekannten Spleißvarianten des betreffenden Gens nach. Sobald der geeignete Primer-Wirkstoff identifiziert wurde, suchen Sie im Menü den QPCR-Cycler, der verwendet werden soll, und bestimmen Sie die kompatible Master-Mix-Lösung, entweder die Master-Mix-Lösung mit separatem ROKS-Passivreferenzfarbstofffläschchen, den ROKS-Mix oder den Low-ROKS-Mix. Hier verwenden wir den Roche Light Cycler 480, daher wird das Master-Mix-plus-Rock-Gefäß verwendet. Es ist außerdem wichtig sicherzustellen, dass ein geeignetes Referenzgen in die vorliegende Studie einbezogen wird. B2M wird verwendet, sobald alle Solaris QP CR-Reagenzien eingetroffen sind.Sie sollten bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Die Reagenzien sind mindestens 12 Monate lang stabil. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.Bereiten Sie cDNA für die qPCR vor, indem Sie Reaktionen der reversen Transkription mit der Proben-RNA durchführen. Nachdem die cDNA vorbereitet wurde, tauen Sie den Solaris-Assay und den Master-Mix auf Eis auf. Der Master-Mix enthält alle Komponenten für die quantitative PCR mit Ausnahme des genspezifischen Assays und der Vorlage; dazu gehören Thermostat, DNA-Polymerase dn, TPS rocks.Wenn das QPCR-Gerät Rocks und einen proprietären Reaktionspuffer, der einen inneren blauen Farbstoff enthält, benötigt, bereiten Sie zusätzlich PCR-gradiges Wasser und QPCR-Platten vor. Nachdem die Lösungen durch Vorsichtiges Antippen aufgetaut wurden, zentrifugieren Sie die Lösungen kurz, um Reagenzverlust zu vermeiden. Bereiten Sie anschließend in einem 15-Milliliter-Röhrchen eine 1x Solaris QPCR-Assay- und Master-Mix-Lösung vor.Durch Kombinieren der gewünschten Anzahl an Proben, die auf einer 384-Well-Platte analysiert werden sollen, mit jeweils fünf Mikrolitern 2x Mastermix, 0,5 Mikroliter 20x Solaris-Assay und PCR-Grad-Wasser, sodass das Endvolumen in jedem Well 10 Mikroliter beträgt. Nachdem die cDNA hinzugefügt wurde, stellen Sie sicher, dass ausreichend Menge für drei Wiederholungen jeder Probe vorliegt, einschließlich einer No-Template-Kontrolle (NTC) und einer No-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (kein RT), um kontaminierte Reagenzien beziehungsweise genomische DNA zu überprüfen. Danach das Gemisch in ein steriles Reservoir überführen.Verwenden Sie dann einen Mehrkanalpipettierer, um das entsprechende Volumen der 1x-Master-Mix-Lösung in die geeigneten Vertiefungen der PCR-Platte zu überführen. Bei Verwendung von weißen Platten erleichtert der im Master-Mix enthaltene innere blaue Farbstoff die Überwachung des Pipettierfortschritts. Mehrere cDNA-Bibliotheken und Referenzgene können auf derselben Platte analysiert werden, da alle Zyklenbedingungen identisch sind.Nachdem der 1x-Mastermix den entsprechenden Vertiefungen zugegeben wurde, fügen Sie die verdünnte cDNA-Vorlage zu jeder Vertiefung hinzu, sodass das Endvolumen 10 Mikroliter beträgt, und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um zu mischen. Versiegeln Sie die Platte entweder mit einer Klebeversiegelung oder einer Wärmeversiegelung, wie hier gezeigt.Platzieren Sie die Platte in einer Zentrifuge und zentrifugieren Sie sie, um die Reagenzien an den Boden der Vertiefung zu bringen und eventuelle Blasen zu entfernen, die die Fluoreszenzmessungen stören würden. Der Thermocycler muss mit einer Aktivierung der Hot-Start-Polymerase in der Solaris QPCR-Master-Mix bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten, ein Zyklus, beginnen, gefolgt von 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und einer Annealing- und Elongation bei 60 Grad Celsius für 60 Sekunden. Dieses Protokoll ist für alle Soliris QPCR-Assays identisch, unabhängig vom zu amplifizierenden Gen.Schließlich die Platte in das QPCR-Gerät geben und das Programm starten. Diese Abbildung zeigt die hohe Leistungsfähigkeit der Solaris-Assays: 10 zehnfache Verdünnungen synthetischer DNA oder cDNA wurden mit den Solaris QPCR-Gene-Expression-Assays für CDC 20 und F two RL one amplifiziert. Die Verstärkungskurven und Standardkurven in logarithmischer Skalierung für 10 Log10-Verdünnungen demonstrieren die hohe Leistung des Assays selbst bei niedrigen Eingabekonzentrationen.Die Leistungsfähigkeit jedes Assays wird anhand des Wirkungsgrads, des quadrierten Wertes, der dynamischen Reichweite von 10, log10-Verdünnungen und der Nachweisgrenze gemessen. Die hier gezeigten Daten belegen die Reproduzierbarkeit der Solaris-Assays. Dabei wurden Aliquots von CD NA in zwei geografisch getrennten Laboratorien mittels Solaris QPCR-Genexpressionsassays und Mastermix amplifiziert.Die gleichen Expressionsniveaus wurden für zwei Genziele in beiden Laboren berechnet. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Standard-QPCR-Reaktion mit Solaris-QPCR-Genexpressionsreagenzien einrichtet. Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, Master-Mixes mit der korrekten Endkonzentration der Reagenzien anzusetzen und geeignete biologische und/oder technische Replikate einzuschließen.Außerdem ist es unerlässlich, das QPCR-Gerät mit den korrekten Thermocycling-Bedingungen für Solaris einzurichten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

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Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-qRT-PCR-Assay für die Analyse von Typ I und III IFN-Expressionssignaturen. Der Assay unterscheidet Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen den sehr ähnlichen Transkripten dieser Gene. Durch die Chargenmontage und das robotergestützte Pipettieren sind die Assays konsistent und reproduzierbar.

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Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

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Vor-Ort-molekulare Erkennung von bodenbürtige Phytopathogene mit einem tragbaren Echtzeit-PCR-System

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