Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

In diesem Videoartikel wird die Echtzeit-PCR anhand von Solaris QPCR-Assays demonstriert. Solaris QPCR-Assays sind gen-spezifische Sonden- und Primer-Reagenzien, die zur Detektion aller bekannten Spleißvarianten eines bestimmten Gens entwickelt wurden. Unter universellen Thermocycling-Bedingungen trägt die Solaris-Sonde am Fünf-Prime-Ende einen Minor-Groove-Binder, eine funktionelle Gruppe und einen FA-Reporter sowie am Drei-Prime-Ende einen abgeschirmten Dunkelquencher.

Während des Denaturierungsschritts der Echtzeit-PCR bleibt die Sonde in Lösung, und die Fluoreszenz des FAM-Reporters wird unterdrückt. Während der Annealing- und Verlängerungsphasen binden die Primer in der Sonde an die Zielsequenz, und der Quencher wird von FAM getrennt. FAM gibt dann ein starkes fluoreszierendes Signal ab; wenn die Sonde dissoziiert, wird die Fluoreszenz erneut unterdrückt.

Es werden Echtzeit-PCR-Ergebnisse erzielt, die die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit dieses effizienten Assays belegen. Hallo, ich bin James Covino vom Forschungs- und Entwicklungsteam von Thermo Fisher Scientific in Lafayette, Colorado. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung einer Standard-QPCR-Reaktion unter Verwendung der Lars-QPCR-Reagenzien für die Genexpression.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herabregulation gezielt ausgewählter Gene mithilfe der RNA-Interferenz-Technologie zu untersuchen. Beginnen wir also. Der Solaris QPCR-Assay STEM zeichnet sich durch einen einzigartigen Algorithmus aus, der MGB- und Superbase-Technologien nutzt, um einen einzigen, praktischen Assay für 98 % der annotierten Gene von Mensch und Maus bereitzustellen.

Normalerweise ist die Gestaltung von DNA-Sonden und Primern durch die Schmelztemperatur der Sonde begrenzt, die sich aus der Anzahl und Art der Basen ergibt. Längere Sequenzen und GC-reiche Sequenzen weisen höhere Schmelztemperaturen auf. Die in Solaris-Sonden verwendete Minor-Groove-Binding-Gruppe lagert sich in die Minor-Groove der DNA-Doppelhelix ein und stabilisiert die Wechselwirkung zwischen Sonde und Zielsequenz.

Dies erhöht die Schmelztemperatur und ermöglicht die Verwendung kürzerer Sonden. Der Solaris-Algorithmus integriert außerdem selektiv modifizierte Nukleotide, sogenannte Superbasen, um die Stabilität von AT-Bindungen zu verbessern und die Selbstassoziation von GG in guaninreichen Sequenzen zu vermeiden. Dadurch können Targetsequenzen verwendet werden, die ansonsten vermieden würden.

Die durch die Verwendung dieser Technologien ermöglichte erhöhte Sequenzflexibilität erlaubt die Konzeption von Primer-Sonden-Sets, die alle bekannten Spleißvarianten eines einzelnen Gens erkennen. Beachten Sie, dass nach Möglichkeit Bereiche, die Exon-Übergänge überspannen, in die Zielregion eingebaut wurden, um die Spezifität zu erhöhen und die Amplifikation kontaminierender genomischer DNA zu vermeiden. Die resultierenden Primer-Sonden-Sets werden mittels Blast-Analyse mit drei verschiedenen Datenbanken – genomische Transkripte und Pseudogene – überprüft, um die Spezifität sicherzustellen. Darüber hinaus wurden die Solaris-Primer-Sonden-Sets vollständig optimiert, sodass die Zyklenbedingungen für alle QPCR-Assays identisch sind, was es ermöglicht, die Expression verschiedener Transkripte in einzelnen PCR-Durchläufen zu bestimmen.

Um mit der Planung des qPCR R-Experiments zu beginnen, identifizieren Sie die benötigten Reagenzien, um die qPCR für das Gen von Interesse mithilfe der Genius-Produktsuche durchzuführen, die unter thermo.com/solaris verfügbar ist. Klicken Sie in das Sucheingabefeld und wählen Sie den geeigneten Zielorganismus aus. Die Genius-Produktsuche kann verschiedene Genbezeichner verarbeiten. Hier.

Geben Sie einen der vorgeschlagenen Suchbegriffe für das Gen Ihrer Wahl ein, klicken Sie dann auf „Suchen“, identifizieren Sie das Gen Ihrer Wahl und klicken Sie links auf „Auswählen“. Daraufhin öffnet sich ein Fenster, das die verschiedenen verfügbaren Reagenzien für das Gen Ihrer Wahl anzeigt. Klicken Sie auf den Tab „QPCR-Detektion“ unter dem Solaris-Genexpressionsassay.

Ein optimal gestalteter Solaris-Sonden-Primer-Assay mit Überschrift eins wird angezeigt. Dieser eine Assay weist alle bekannten Spleißvarianten des betreffenden Gens nach. Sobald der geeignete Primer-Wirkstoff identifiziert wurde, suchen Sie im Menü den QPCR-Cycler, der verwendet werden soll, und bestimmen Sie die kompatible Master-Mix-Lösung, entweder die Master-Mix-Lösung mit separatem ROKS-Passivreferenzfarbstofffläschchen, den ROKS-Mix oder den Low-ROKS-Mix.

Hier verwenden wir den Roche Light Cycler 480, daher wird das Master-Mix-plus-Rock-Gefäß verwendet. Es ist außerdem wichtig sicherzustellen, dass ein geeignetes Referenzgen in die vorliegende Studie einbezogen wird. B2M wird verwendet, sobald alle Solaris QP CR-Reagenzien eingetroffen sind.

Sie sollten bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Die Reagenzien sind mindestens 12 Monate lang stabil. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.

Bereiten Sie cDNA für die qPCR vor, indem Sie Reaktionen der reversen Transkription mit der Proben-RNA durchführen. Nachdem die cDNA vorbereitet wurde, tauen Sie den Solaris-Assay und den Master-Mix auf Eis auf. Der Master-Mix enthält alle Komponenten für die quantitative PCR mit Ausnahme des genspezifischen Assays und der Vorlage; dazu gehören Thermostat, DNA-Polymerase dn, TPS rocks.

Wenn das QPCR-Gerät Rocks und einen proprietären Reaktionspuffer, der einen inneren blauen Farbstoff enthält, benötigt, bereiten Sie zusätzlich PCR-gradiges Wasser und QPCR-Platten vor. Nachdem die Lösungen durch Vorsichtiges Antippen aufgetaut wurden, zentrifugieren Sie die Lösungen kurz, um Reagenzverlust zu vermeiden. Bereiten Sie anschließend in einem 15-Milliliter-Röhrchen eine 1x Solaris QPCR-Assay- und Master-Mix-Lösung vor.

Durch Kombinieren der gewünschten Anzahl an Proben, die auf einer 384-Well-Platte analysiert werden sollen, mit jeweils fünf Mikrolitern 2x Mastermix, 0,5 Mikroliter 20x Solaris-Assay und PCR-Grad-Wasser, sodass das Endvolumen in jedem Well 10 Mikroliter beträgt. Nachdem die cDNA hinzugefügt wurde, stellen Sie sicher, dass ausreichend Menge für drei Wiederholungen jeder Probe vorliegt, einschließlich einer No-Template-Kontrolle (NTC) und einer No-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (kein RT), um kontaminierte Reagenzien beziehungsweise genomische DNA zu überprüfen. Danach das Gemisch in ein steriles Reservoir überführen.

Verwenden Sie dann einen Mehrkanalpipettierer, um das entsprechende Volumen der 1x-Master-Mix-Lösung in die geeigneten Vertiefungen der PCR-Platte zu überführen. Bei Verwendung von weißen Platten erleichtert der im Master-Mix enthaltene innere blaue Farbstoff die Überwachung des Pipettierfortschritts. Mehrere cDNA-Bibliotheken und Referenzgene können auf derselben Platte analysiert werden, da alle Zyklenbedingungen identisch sind.

Nachdem der 1x-Mastermix den entsprechenden Vertiefungen zugegeben wurde, fügen Sie die verdünnte cDNA-Vorlage zu jeder Vertiefung hinzu, sodass das Endvolumen 10 Mikroliter beträgt, und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um zu mischen. Versiegeln Sie die Platte entweder mit einer Klebeversiegelung oder einer Wärmeversiegelung, wie hier gezeigt.

Platzieren Sie die Platte in einer Zentrifuge und zentrifugieren Sie sie, um die Reagenzien an den Boden der Vertiefung zu bringen und eventuelle Blasen zu entfernen, die die Fluoreszenzmessungen stören würden. Der Thermocycler muss mit einer Aktivierung der Hot-Start-Polymerase in der Solaris QPCR-Master-Mix bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten, ein Zyklus, beginnen, gefolgt von 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und einer Annealing- und Elongation bei 60 Grad Celsius für 60 Sekunden. Dieses Protokoll ist für alle Soliris QPCR-Assays identisch, unabhängig vom zu amplifizierenden Gen.

Schließlich die Platte in das QPCR-Gerät geben und das Programm starten. Diese Abbildung zeigt die hohe Leistungsfähigkeit der Solaris-Assays: 10 zehnfache Verdünnungen synthetischer DNA oder cDNA wurden mit den Solaris QPCR-Gene-Expression-Assays für CDC 20 und F two RL one amplifiziert. Die Verstärkungskurven und Standardkurven in logarithmischer Skalierung für 10 Log10-Verdünnungen demonstrieren die hohe Leistung des Assays selbst bei niedrigen Eingabekonzentrationen.

Die Leistungsfähigkeit jedes Assays wird anhand des Wirkungsgrads, des quadrierten Wertes, der dynamischen Reichweite von 10, log10-Verdünnungen und der Nachweisgrenze gemessen. Die hier gezeigten Daten belegen die Reproduzierbarkeit der Solaris-Assays. Dabei wurden Aliquots von CD NA in zwei geografisch getrennten Laboratorien mittels Solaris QPCR-Genexpressionsassays und Mastermix amplifiziert.

Die gleichen Expressionsniveaus wurden für zwei Genziele in beiden Laboren berechnet. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Standard-QPCR-Reaktion mit Solaris-QPCR-Genexpressionsreagenzien einrichtet. Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, Master-Mixes mit der korrekten Endkonzentration der Reagenzien anzusetzen und geeignete biologische und/oder technische Replikate einzuschließen.

Außerdem ist es unerlässlich, das QPCR-Gerät mit den korrekten Thermocycling-Bedingungen für Solaris einzurichten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.