Name: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von RNA-Transport in Xenopus-Oozyten mittels fluoreszenzmarkierter Transkripte und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von RNA-Lokalisierungsmechanismen in vivo.

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Unsere Arbeiten zur RNA-Lokalisierung wird durch einen Zuschuss von der NIH (R01GM071049) auf KLM unterstützt.

Teil 1: Transkription von fluoreszenzmarkierten mRNA. <ol><li> Linearisieren Plasmid-DNA mit dem RNA-Lokalisierung Element oder anderen relevanten Sequenz-und resuspendieren bei 1 ug / ul mit DEPC-behandeltem H 2 O. Die DNA-Vorlage muss stromaufwärts liegende Promotor Standorte für die Transkription durch T7, SP6 oder T3-RNA-Polymerase. </li><li> Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein steriles 1,5 ml Tube: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx-Puffer (siehe M &amp; M) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> b. 20X Kappe / NTP-Mix (siehe M &amp; M) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> c. 1 mM Alexa Fluor 546 bis 14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> d. UTP, [α-32 P] (1 Ci / ul) (Perkin Elmer) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> e. DEPC-H 2 O </td><td> 11 ul </td></tr><tr><td> f. 0,2 M DTT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> g. RNasin (Promega) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> h. lineare Template-DNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> i. RNA Polymerase (Promega) </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Reagenzien sanft und kurz zentrifugieren (10 sec. In einer Mikrozentrifuge). </li><li> Inkubieren für 2-4 Stunden bei 37 ° C, für das Rohr mit Alu-Folie zu verhindern Ausbleichen des Fluorophors. </li><li> Fügen Sie 1 ul 1 mg / ml RNase-freie DNase (Promega) zur Template-DNA abzubauen. </li><li> Inkubieren 15 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Add 79 ul 20 mM EDTA (pH 8,0), um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Nehmen Sie 1 ul in ein separates Röhrchen, als "Input" und speichern Sie beschriftet. </li><li> Spin Reaktion durch ein 1 ml G50-Säule (siehe Material und Methoden), die ohne eigene Rechtspersönlichkeit, Nukleotide umfassen wird unter Ausschluss voller Länge mRNA. </li><li> Konzentrieren Sie sich die RNA durch Ethanolfällung: <ol class="lalpha"><li> Add 250 ul 100% Ethanol, 10 ul 7M CH 3 COONH 4, 1 ul Träger-RNA (tRNA Hefe, 10 ug / ul) oder 1 ul Glykogen (20 mg / ml). </li><li> Gut mischen und einfrieren, bis Feststoff bei -80 ° C für&gt; 30 Minuten oder auf Trockeneis für 15 Minuten. </li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit in Mikrozentrifuge für 15 Minuten, dekantieren. </li><li> Waschen mit 150 ul 75% Ethanol. </li><li> Spin 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in Mikrozentrifuge, dekantieren. </li><li> Dry das Pellet bei 37 ° C für 3 Minuten, sicherzustellen, dass alle Ethanol verdampft ist. </li></ol></li><li> Resuspendieren in 11 ul DEPC-H 2 O und entfernen 1 ul in ein separates Röhrchen, als "integriert" bezeichnet. </li><li> Bestimmen Sie die prozentuale Aufnahme und verdünnt das RNA zu 50 nM (siehe Materialien und Methoden für die Berechnung). </li><li> Die RNA sollte in 5 ul Aliquots eingefroren werden, für den einmaligen Gebrauch, um Frost / Tau-Zyklen zu vermeiden und kann mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> Teil 2: Vorbereitungen für die Mikroinjektion. <ol><li> RNA Zubereitung: Tauwetter ein Aliquot von RNA (50 nM) und Denaturierung der RNA bei 70 ° C für 3-5 Minuten. Spin für 10 Minuten bei Raumtemperatur Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zu jedem Teilchen zu entfernen, und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Oocyte Zubereitung: <ol class="lalpha"><li> Chirurgisch entfernen Eierstock aus Xenopus laevis Weibchen (Nasco). </li><li> Trim Stücke von Xenopus laevis Ovarien in einen 50 ml konische Röhrchen mit 25 ml Collagenase-Lösung (siehe Materialien und Methoden). </li><li> Vorsichtig schütteln bei 18 ° C für 15 Minuten, oder bis Eizellen sind sichtbar von Eierstock getrennt. Aufgrund Chargenstreuung kann Kollagenasebehandlung Zeit variieren und müssen sorgfältig durch Sichtprüfung überwacht werden, um defoliculation zu gewährleisten. </li><li> Lassen Eizellen in Rohr zu regeln, zu entfernen Lösung und Waschen der Eizellen mit MBSH Puffer (siehe Material und Methoden). </li><li> Wiederholen Sie waschen zweimal für insgesamt drei Wäschen. Diese Eizelle Isolation Protokoll ist ähnlich dem detaillierten in Cohen et al., 2009. </li><li> Manuell sortieren im Stadium III / IV Oozyten (Dumont, 1972) in MBSH Puffer unter einem Standard-Binokular. Stadium III Oozyten sind völlig undurchsichtig, aber weiß, während im Stadium IV Oozyten etwas größer und gesprenkelt mit Pigment. Eizellen, die leicht transparent sind zu jung und Eizellen, die vollständig pigmentiert oder weisen polarisierte Verteilung der Pigmente zu alt sind. </li></ol></li><li> Needle Zubereitung: Pull-und Kegel-Nadeln mit einem äußeren Durchmesser von ~ 0,05 mm. (Wir verwenden Drummond Scientific 3,5-Zoll-Kapillaren (Bestellung Nr. 3-000-203-G / X), eine Sutter Instrument Co. Mikropipette Abzieher und ein WPI Inc. Schweißkantenformer.) </li></ol> Teil 3: Mikroinjektion <ol><li> Kalibrieren Nadel mit DEPC-H 2 O zu 2 nl pro Injektion zu liefern. Wir Frontlader unsere Nadel mit einem gasbetriebenen Mikroinjektor (siehe Materialien und Methoden), und kalibrieren Tropfengröße mit einem Mikrometer. </li><li> Laden RNA in Nadel. </li><li> Ort sortiert Eizellen in ein Spritzgießwerkzeug Schale mit MBSH Puffer. Wir konzentrieren uns auf einen Teller microinject mit einer Schicht aus schwarzem Moosgummi. Der blasse Eizellen zeichnen sich auch auf einem weißen backgrouND. </li><li> Sorgfältig spritzen jede Eizelle mit 2 nl der RNA bei 50 nM. </li><li> Expel RNA, spülen Nadel mit DEPC-H 2 O, und laden neben RNA zur Injektion. </li></ol> Teil 4: Oocyte Kultur <ol><li> Legen Eizellen in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte (Sigma Aldrich). Wir Kultur bis zu tausend Eizellen pro Vertiefung. </li><li> Remove-Puffer und ersetzen mit 400 ul O ocyte C ulture M edium (OCM, siehe Material und Methoden) pro Vertiefung. Legen Kultur Platte innerhalb einer luftdichten Kunststoffbehälter mit nassen Papiertuch zu feuchte Umgebung während der Kultur aufrecht zu erhalten. </li><li> Inkubieren Oozyten bei 18 ° C für Zeitpunkten zwischen 8 und 48 Stunden. </li></ol> Teil 5: Fixierung, Entwässerung und Lagerung von Eizellen <ol><li> Sortieren jedes tote Eizellen und Ort überlebenden Oozyten in Glasflaschen. Wir routinemäßig beobachten&gt; 90% Überleben. </li><li> Legen Eizellen in MEMFA Fixativ (siehe Materialien und Methoden) und Rock für 20 Minuten. Schützen Sie die Oozyten von Licht durch Abdecken mit Alufolie abdecken. </li><li> Wash-Oozyten durch Entfernen Fixiermittel und ersetzen mit gleichem Volumen MBSH Puffer. Wiederholen Sie diesen waschen noch einmal für insgesamt zwei Wäschen. </li><li> Wash Eizellen in wasserfreiem Methanol: <ol class="lalpha"><li> Entfernen Sie die Hälfte des Volumens, mit Methanol zu ersetzen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt "a" zweimal. </li><li> Entfernen Sie die gesamte Lösung, mit Methanol zu ersetzen. </li><li> Wiederholen Methanol waschen. </li></ol></li><li> Eizellen können bei -20 ° C gelagert werden, bis bereit zum Bild. </li></ol> Teil 6: Imaging RNA Localization durch konfokale Mikroskopie <ol><li> Vor Bildgebung, fügen Murray s Clearing Medium (2:1 Benzylbenzoat-Benzylalkohol) zu einem Glasboden FluoroDish (WPI Inc.) auf die Bildfläche zu decken. </li><li> Sorgfältig Transfer der Oozyten von Methanol zu FluoroDish, Minimierung des Volumens von Methanol übertragen. </li><li> Bild auf einer invertierten konfokalen Mikroskop (Wir haben erfolgreich ein Zeiss LSM510 und ein Leica TCS SP2 verwendet). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1:.. Visualisierung von subzelluläre RNA Localization durch Mikroinjektion von fluoreszierend markierten Transkripte A. Nach Mikroinjektion, RNA mit Alexa Fluor 546 gekennzeichnet ist zunächst auf den Kern beschränkt B. Nach acht Stunden der Kultur, kann eine fluoreszenzmarkierte Kontroll-RNA einheitlich gesehen werden verteilt in das Zytoplasma der Eizelle. C. Allerdings fluoreszenzmarkierte RNA Sequenzen enthält, die Rekrutierung der Transportmaschinen in den Prozess der subzellulären Lokalisation der vegetativen Pol der Eizelle (nach unten) zu sehen. Balken = 50 um.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

Experimente mit Labortieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Brown University gesetzt durchgeführt.

Hier haben wir ein Protokoll für die Visualisierung von mRNA-Lokalisierung in Xenopus Oozyten vorgestellt. Diese Methode, mit fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte hat höheres Signal-Rausch-Verhältnis als bisher mit Digoxigenin-markierten Transkripte erhalten und ist einfacher und schneller als in-situ Ansätze (Mowry und Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Mit dieser Methode können wir Ingenieur-RNA-Sequenz Mutationen und schnell für die in vivo Funktion zu testen. Ferner kann durch die Verwendung zu...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx Puffer <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM Spermidin-HCl </li></ul> 20x Kappe / NTP-Mix <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs) </li></ul> G-50-Säule <ul><li class="none"> Hydrate 5 g Sephadex G-50-Perlen (Sigma Aldrich) in 100 ml deionisiertem H 2 O. Für 30 min DEPC-Behandlung. und Autoklaven. Shop unvollständige Lager bei Raumtemperatur. Vor dem Einsatz, fügen Sie die folgenden RNase-freie Lösungen: </li><li class="none"> 0,5 ml 0,2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml 20% SDS </li><li class="none"> Speichern Sie alle G-50-Lösung bei 4 ° C. </li><li class="none"> Entfernen und entsorgen Sie den Kolben aus einer 3 ml-Spritze (BD Biosciences) und platzieren Sie den Zylinder der Spritze in eine 15 ml konischen Rohr (Corning). Stecken Sie die Spritze mit einer kleinen Menge von Glaswolle (a plug etwa die Hälfte der Größe eines Cent). </li><li class="none"> Swirl komplette G-50-Lösung, um Perlen zu resuspendieren. </li><li class="none"> 2 ml G-50-Lösung in den leeren Spalte. </li><li class="none"> Spin für 1 Minute bei 1.000 x g in Tischzentrifuge. </li><li class="none"> Geben Sie 200 ul DEPC-behandeltem deionisiertem H 2 O in jeder Spalte. Spin. </li><li class="none"> Wiederholen Sie waschen zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li class="none"> Entfernen Sie Spritze in ein frisches 15 ml konischen Rohr. </li></ul> Collagenase-Lösung <ul><li class="none"> 75 mg Kollagenase aus Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH Puffer <ul><li class="none"> 88 mm NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mm MgSO 4 X 7 H 2 O </li><li class="none"> 0,33 mm Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mm CaCl 2 X 6 H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Oocyte Culture Medium <ul><li class="none"> 50% L15 Medium </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml Insulin </li><li class="none"> 100 mg / ml Gentamicin </li><li class="none"> 50 U / ml Nystatin </li><li class="none"> 50 U / ml Penicillin </li><li class="none"> 50 mg / ml Streptomycin </li></ul> MEMFA Lösung <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% Formaldehyd </li></ul> Computing RNA-Ausbeute <ul><li class="none"> Bestimmen Sie CPM in &quot;Input&quot; und &quot;integriert&quot; Proben mit einem Standard-Szintillationszähler. </li><li class="none"> Einbau = (&quot;eingebaut&quot;) / (10 x &quot;input&quot;) </li><li class="none"> Typische Einbindung Werte zwischen ~ 0,03 und 0,10. </li><li class="none"> Maximale theoretische Ausbeute für verschiedene Polymerasen: T7, T3, SP6 - 2,64 pg </li><li class="none"> Reaktionsausbeute in pg = (maximale Ausbeute von Polymerase) X (Einbau) </li><li class="none"> Verdünnte RNA zu 50 nM = (ug RNA) / 320 / (Länge der RNA in Basen) / (5X10 -8) </li><li class="none"> Die Reaktion ergibt in der Regel ~ 50-100 ul der RNA bei 50 nM. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oozyten

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA-Lokalisierung ist eine konservierte Mechanismus der Gründung Zellpolarität. Vg1 mRNA lokalisiert den vegetativen Pol des Xenopus laevis Oozyten und wirkt räumlich beschränken Genexpression Vg1 Protein. Eine strenge Kontrolle der Vg1 Verteilung auf diese Weise ist für die ordnungsgemäße Keim-Layer-Spezifikation in den sich entwickelnden Embryo erforderlich. RNA-Sequenz-Elemente in der 3 &#39;UTR der mRNA, die Vg1 Lokalisierungselement (VLE) erforderlich und ausreichend, um auf direktem Wege. Zur Untersuchung der Anerkennung und der Transport von Vg1 mRNA in vivo, haben wir ein bildgebendes Verfahren, die umfassende Analyse der trans-Faktor gerichteten Transport-Mechanismen ermöglicht über eine einfache visuelle Ablesung entwickelt. Zur Visualisierung RNA-Lokalisierung, synthetisieren wir fluoreszenzmarkierten VLE RNA und microinject dieses Transkript in einzelne Eizellen. Nach Eizelle Kultur, um den Transport der injizierten RNA zu ermöglichen, sind Eizellen fixiert und dehydriert vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Visualisierung der mRNA-Lokalisierung Muster bietet eine Anzeige für die Überwachung der kompletten Pfad der RNA-Transport und für die Ermittlung Rollen in Regie RNA-Transport für cis-wirkende Elemente innerhalb der Transkript-und trans-wirkende Faktoren, die zur VLE (Lewis et al., 2008 zu binden, Messitt et al., 2008). Wir haben diese Technik durch Co-Lokalisation erweitert mit zusätzlichen RNAs und Proteinen (Gagnon und Mowry 2009, Messitt et al., 2008) und in Kombination mit Störungen der motorischen und des Zytoskeletts (Messitt et al., 2008) zur Sonde Mechanismen, die mRNA-Lokalisierung.

Visualisierung von<em&gt; In vivo</em&gt; RNA-Transport ist durch Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte erreicht in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten, gefolgt von der konfokalen Mikroskopie.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Die RNA-Lokalisierung ist ein konservierter Mechanismus zur Etablierung der Zellpolarität. Vg1-mRNA lokalisiert am vegetativen Pol von Xenopus laevis-Oozyten und dient dazu, die Genexpression des Vg1-Proteins räumlich zu begrenzen. Eine präzise Steuerung der Vg1-Verteilung auf diese Weise ist für die korrekte Spezifizierung der Keimblätter im sich entwickelnden Embryo erforderlich. RNA-Sequenzelemente in der 3'-UTR der mRNA, das sogenannte Vg1-Lokalisierungselement (VLE), sind notwendig und ausreichend, um den Transport zu steuern. Um die Erkennung und den Transport der Vg1-mRNA in vivo zu untersuchen, haben wir eine bildgebende Technik entwickelt, die eine umfassende Analyse von trans-faktorgesteuerten Transportmechanismen über einen einfachen visuellen Readout ermöglicht. Zur Visualisierung der RNA-Lokalisierung synthetisieren wir fluoreszenzmarkierte VLE-RNA und mikroinjizieren dieses Transkript in einzelne Oozyten. Nach der Oozytenkultur, um den Transport der injizierten RNA zu ermöglichen, werden die Oozyten fixiert und dehydriert, bevor sie mittels Konfokalmikroskopie abgebildet werden. Die Visualisierung der mRNA-Lokalisierungsmuster liefert einen Readout zur Überwachung des vollständigen RNA-Transportwegs sowie zur Identifizierung der Rollen von cis-agierenden Elementen innerhalb des Transkripts und trans-agierenden Faktoren, die an das VLE binden, bei der Steuerung des RNA-Transports (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Wir haben diese Technik durch Kolokalisierung mit zusätzlichen RNAs und Proteinen (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008) sowie in Kombination mit der Störung von Motorproteinen und dem Zytoskelett (Messitt et al., 2008) erweitert, um die der mRNA-Lokalisierung zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen.

Bei diesem Verfahren werden fluoreszenzmarkierte RNA-Transkripte in XUS-Zellen injiziert und ihre Lokalisation wird überwacht. Zunächst wird die RNA mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert.Bei einer In-vitro-Transkriptionsreaktion wird die RNA anschließend in eine Mikroinjektionsvorrichtung aufgenommen. Die Oozyten werden auf eine Injektionsschale gegeben und vorsichtig mikroinjiziert. Abschließend werden die Oozyten kultiviert, um die RNA-Lokalisation vor der Bildgebung am konfokalen Mikroskop stattfinden zu lassen.Hallo, ich bin James Gagnan aus dem Labor von Dr. Kimberly Mallory am Department für Molekularbiologie, Zellbiologie und Biochemie der Brown University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung der subzellulären RNA-Lokalisation in Xap-Oozyten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die RNA-Architektur und die Proteinfaktoren zu untersuchen, die für die RNA-Lokalisation während der frühen Wirbeltierentwicklung erforderlich sind.Beginnen wir nun. Transkribieren Sie zu Beginn dieses Verfahrens mRNA, die wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben sowohl radioaktiv als auch fluoreszenzmarkiert ist. Geben Sie DS hinzu, um die Matrizen-DNA abzubauen, und stoppen Sie anschließend die Reaktion durch Zugabe von EDTA.Entfernen Sie nicht eingebaute Nukleotide und andere kleine Moleküle, indem Sie die Probe durch eine G-50-Säule zentrifugieren. Die RNA wird anschließend durch Ethanolpräzipitation konzentriert, gewaschen und resuspendiert. Nach Bestimmung der Konzentration mittels Szintillationszählung verdünnen Sie die RNA auf 50 Nanomolar und lagern sie in Aliquots zu je fünf Mikroliter bei minus 80 Grad Celsius.Wenn Sie bereit sind, die Mikroinjektion durchzuführen, tauen Sie ein Eloqua der markierten RNA auf und denaturieren sie bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie zehn Minuten bei maximaler Drehzahl in einem Mikrozentrifugengerät bei Raumtemperatur, um Partikel zu entfernen, und stellen Sie es auf Eis. Danach isolieren Sie die Cytes, indem Sie Stücke des Xap-Post-Lavu-Ovars in einen 50-Milliliter-Kegelkolben mit 25 Millilitern einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung geben.Kollagenase in einem 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,4. Vorsichtig bei 18 Grad Celsius schütteln, da Unterschiede zwischen Chargen auftreten können. Die Behandlungszeit mit Kollagenase kann variieren und sollte sorgfältig durch visuelle Kontrolle überwacht werden.Um eine vollständige Entlaubung sicherzustellen, weiterhin 15 Minuten schütteln oder bis die Oozyten sichtbar von der Eierstöcke getrennt sind; anschließend die Oozyten auf den Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes absinken lassen. Die Lösung entfernen und durch MBSH-Puffer ersetzen. Diesen Schritt wiederholen, insgesamt dreimal waschen, wobei zwei weitere Wäschen erfolgen.Als Nächstes sortieren Sie Stufe-drei-bis-vier-Zygoten manuell unter einem Standard-Lichtmikroskop in MBSH-Puffer. Zygoten der Stufe drei sind vollständig opak, jedoch weiß. Zygoten der Stufe vier hingegen sind etwas größer und mit Pigment gezeichnet.Zellen, die leicht transparent sind, sind zu jung, und Zellen, die vollständig pigmentiert sind oder eine polarisierte Pigmentverteilung aufweisen, sind zu alt. Bereiten Sie abschließend die Nadeln für die Mikroinjektion vor, indem Sie dreieinhalb Zoll lange Kapillaren ziehen und abschrägen, um Nadeln mit einem Außendurchmesser von etwa 0,05 Millimetern herzustellen. Da nun die mRNA, Oozyten und Nadeln bereit sind, fahren Sie mit der Mikroinjektion fort.Kalibrieren Sie zunächst die Nadel mit entionisiertem Wasser, um zwei Nanoliter pro Injektion abzugeben. Beladen Sie die Nadel mit einem gasgesteuerten Mikroinjektor und kalibrieren Sie die Tropfengröße mithilfe eines Mikrometers. Nach der Kalibrierung beladen Sie die Nadel erneut mit der zu injizierenden RNA. Platzieren Sie danach die sortierten Oozyten in einer Injektionsschale mit MBSH-Puffer; die Schale enthält eine Schicht aus schwarzem Schaumgummi.Die weißen Zellen heben sich deutlich vor einem schwarzen Hintergrund ab. Injizieren Sie dann vorsichtig jede Oozyte mit zwei Litern RNA bei 50 Nanomolar. Achten Sie darauf, dass jede Oozyte nur einmal injiziert wird, und überprüfen Sie die Nadel nach der Injektion regelmäßig auf Verstopfungen.Drücken Sie die restliche RNA aus, spülen Sie die Nadel mit entionisiertem Wasser aus und laden Sie die nächste RNA für die Injektion auf. Nach der Injektion überführen Sie die injizierten Zellen in eine Vertiefung einer sterilen 24-Loch-Platte, bis zu tausend pro Vertiefung. ZELLEN können pro Vertiefung kultiviert werden.Entfernen Sie den Puffer und ersetzen Sie ihn durch 400 µL Zellkulturmedium pro Vertiefung. Anschließend stellen Sie die Kulturplatte in einen Plastikbehälter mit einem nassen Papiertuch, um während der Kultivierung eine feuchte Umgebung aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Oozyten bei 18 °C für Zeiträume zwischen acht und 48 Stunden nach der gewünschten Inkubationszeit. Die Oozyten können nach der Inkubation der injizierten Oozyten für die Mikroskopie vorbereitet werden.Sortieren Sie tote Oozyten aus und geben Sie die überlebenden Oozyten in Glasfläschchen. Es wird routinemäßig eine Überlebensrate von mehr als 90 % der Oozyten beobachtet. Ersetzen Sie den Puffer durch M-E-M-F-A-Fixansatz und schütteln Sie die Zellen 20 Minuten lang. Schützen Sie die Oozyten nach Beendigung der Fixierungszeit vor Sonnenlicht während der Fixierung. Waschen Sie die Oozyten, indem Sie das Fixiermittel entfernen und durch ein gleiches Volumen MBSH-Puffer ersetzen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, insgesamt zwei Waschungen.Als Nächstes waschen Sie die Oozyten in wasserfreies Methanol. Entfernen Sie zunächst die Hälfte des Volumens und ersetzen Sie es durch Methanol. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.Nach diesen Waschungen entfernen Sie die gesamte Lösung und ersetzen sie durch Methanol. Wiederholen Sie diesen Methanolwaschschritt noch einmal. Die fixierten und dehydrierten Oozyten können bis zur Bildaufnahme bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Vor der Bildgebung fügen Sie Marie's Klärmedium einem Glasboden-WPI-Fluorodisch hinzu, um die Bildgebungsoberfläche zu bedecken. Überführen Sie die Oozyten vorsichtig aus Methanol in den Fluorodisch, wobei das übertragene Methanolvolumen minimiert werden sollte. Bilden Sie die Oozyten auf einem invertierten konfokalen Mikroskop ab; sowohl ein Zeiss LSM 510 als auch ein Aica TCS SP liefern gute Ergebnisse. Nun zeigen wir einige repräsentative Bilder der subzellulären RNA-Lokalisation unmittelbar nach der Mikroinjektion. Acht Stunden nach Kultivierung ist fluoreszierende RNA im Kern einer fluoreszenzmarkierten Kontrolle sichtbar.RNA ist gleichmäßig im Zytoplasma der Oozyte verteilt sichtbar. Allerdings kann eine fluoreszenzmarkierte RNA, die Sequenzen enthält, die die Transportmaschinerie rekrutieren, während der subzellulären Lokalisierung zur Vegetalpolregion der Oozyte beobachtet werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man fluoreszenzmarkierte RNAs in Oozyten mikroinjiziert und die RNA-Lokalisierung mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, diethylpyrokarbonatbehandelte Lösungen zu verwenden, um RNA-Kontaminationen der Kultur zu vermeiden, Ihre Zellen in OCM mit Antibiotika zu kultivieren und Ihre Zellen nach Möglichkeit vor Sonnenlicht zu schützen, um Photo-Bleichen zu verhindern. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Xenopus embryonalen Ektoderm hat sich ein attraktives Modell für Studien der Zellpolarität. Ein Assay ist beschrieben, in denen subzellulären Verteilung von fluoreszierenden Proteinen in Ectodermzellen beurteilt wird. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, Fragen im Zusammenhang mit räumlichen Steuerung der Signalisierung.

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine ​​oder autofluoreszierenden Strukturen in den...

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

Wir beschreiben Methoden zur Visualisierung der entstehenden Transkription während der zygotischen Genomaktivierung in Einzelzellen während der frühen Embryogenese.

Visualisierung der zygotischen Genomaktivierung in Einzelzellen früher Embryonen

Lernen Sie die Visualisierung von RNA-Transport in Xenopus-Oozyten mittels fluoreszenzmarkierter Transkripte und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von RNA-Lokalisierungsmechanismen in vivo.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

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