Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Bei diesem Verfahren wird fluoreszenzmarkierte RNA. Transkripte werden in XUS-Zyten injiziert und ihre Lokalisation wird überwacht. Zunächst wird die RNA mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert.

In einer In-vitro-Transkriptionsreaktion wird die RNA dann in eine Mikroinjektionsvorrichtung geladen. Die Eizellen werden auf eine Injektionsschale gelegt und vorsichtig mikroinjiziert. Schließlich werden die Eizellen kultiviert, um die RNA-Lokalisierung vor der Bildgebung am konfokalen Mikroskop zu ermöglichen.

Hallo, ich bin James Gagnan aus dem Labor von Dr. Kimberly Mallory am Department of Molecular Biology, Zellbiologie und Biochemie an der Brown University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung der subzellulären RNA-Lokalisierung in Xap-Eizellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die RNA-Architektur und Proteinfaktoren zu untersuchen, die für die RNA-Lokalisierung während der frühen Wirbeltierentwicklung erforderlich sind.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, transkribieren Sie mRNA, die sowohl radioaktiv als auch fluoreszierend markiert ist, wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Fügen Sie DS hinzu, um die Matrizen-DNA abzubauen, und stoppen Sie dann die Reaktion durch Zugabe von EDTA.

Entfernen Sie nicht eingebaute Nukleotide und andere kleine Moleküle, indem Sie durch eine G 50-Säule drehen. Die RNA wird dann durch Ethanolfällung konzentriert, gewaschen und resuspendiert. Nach der Bestimmung der Konzentration durch Szintillationszählung verdünnt man die RNA auf 50 Nanomolare und lagert sie in fünf Mikroliter-Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius.

Wenn Sie bereit sind, die Mikroinjektion durchzuführen, tauen Sie ein Eloqua der markierten RNA fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius denaturieren. Schleudern Sie dann 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur, um Partikel zu entfernen und auf Eis zu halten. Als nächstes isolieren Sie die Cytes, die Schnittstücke von xap post lavu Eierstöcken enthalten, in eine konische 50-Milliliter-Zwei, die 25 Milliliter von drei Milligramm pro Milliliter enthält.

Kollagenase in einem 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,4. Vorsichtig bei 18 Grad Celsius schütteln, da es zu Chargenschwankungen kommt. Die Dauer der Kollagenase-Behandlung kann variieren und sollte sorgfältig durch visuelle Inspektion überwacht werden.

Um eine Entlaubung zu gewährleisten, schütteln Sie das Schütteln 15 Minuten lang oder bis die Eizellen sichtbar vom Eierstock getrennt sind, lassen Sie die Eizellen am Boden des konischen Röhrchens absetzen. Entfernen Sie die Lösung, und ersetzen Sie sie durch MBSH-Puffer. Wiederholen Sie dies und waschen Sie noch zweimal für insgesamt drei Wäschen.

Sortieren Sie anschließend die CYTES und den MBSH-Puffer der Stufen drei bis vier manuell unter einem Standardlichtmikroskop. Die Zyten im dritten Stadium sind völlig undurchsichtig, aber weiß. Während die Zyten im vierten Stadium etwas größer und mit Pigmenten gesprenkelt sind.

Zyten, die leicht transparent sind, sind zu jung und Zyten, die vollständig pigmentiert sind oder eine polarisierte Pigmentverteilung aufweisen, sind zu alt. Bereiten Sie schließlich die Nadeln für die Mikroinjektion vor, indem Sie dreieinhalb Zoll große Kapillaren ziehen und abschrägen, um Nadeln mit einem Außendurchmesser von etwa 0,05 Millimetern herzustellen. Jetzt, da die mRNA-Eizellen und -Nadeln bereit sind, fahren Sie mit der Mikroinjektion fort.

Beginnen Sie mit der Kalibrierung der Nadel mit Desy-Wasser, um zwei Nanometer pro Injektion zu liefern. Vorder-. Laden Sie die Nadel mit einem gasgesteuerten Mikroinjektor und kalibrieren Sie die Tropfengröße mit einem Mikrometer, nachdem Sie die zu injizierende RNA nach der Kalibrierung von vorne in die Nadel geladen haben. Legen Sie anschließend die sortierten Eizellen auf eine Injektionsschale In MBSH-Puffer enthält die Schale eine Schicht aus schwarzem Schaumgummi.

Die weiße Zyte hebt sich gut von einem schwarzen Hintergrund ab. Injizieren Sie dann vorsichtig jede Eizelle mit zwei Litern RNA bei 50 Nanomolaren. Achten Sie darauf, jede Eizelle nur einmal zu injizieren und überprüfen Sie die Nadel regelmäßig auf Verstopfungen, wenn die Injektion abgeschlossen ist.

Stoßen Sie die restliche RNA aus, spülen Sie die Nadel mit Desy-Wasser aus und laden Sie die nächste RNA zur Injektion. Nach der Injektion werden die injizierten Zyten in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte bis zu tausend Zyten übertragen. CYTES können pro Vertiefung kultiviert werden.

Entfernen Sie den Puffer und ersetzen Sie ihn durch 400 Mikroliter Cyt-Kulturmedium pro Vertiefung. Legen Sie dann die Kulturplatte mit einem feuchten Papiertuch in einen Plastikbehälter, um während der Kultur eine feuchte Umgebung zu erhalten, und inkubieren Sie die Eizellen bei 18 Grad Celsius für Zeitpunkte zwischen acht und 48 Stunden nach der gewünschten Inkubationszeit. Die Eizellen können nach der Inkubation der injizierten Eizellen für die Mikroskopie vorbereitet werden.

Sortieren Sie alle toten Eizellen aus und legen Sie die überlebenden Eizellen in Glasfläschchen. Das Überleben von mehr als 90 % der Eizellen wird routinemäßig beobachtet. Ersetzen Sie den Puffer durch M-E-M-F-A-Fixiermittel und schütteln Sie die Zyten 20 Minuten lang.

Schützen Sie die Eizellen während der Fixierung vor Sonnenlicht nach Abschluss der Fixationsperiode. Waschen Sie die Eizellen, indem Sie das Fixiermittel entfernen und durch ein gleiches Volumen MBSH-Puffer ersetzen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal für insgesamt zwei Wäschen.

Waschen Sie anschließend die Eizellen in wasserfreies Methanol. Entfernen Sie zunächst die Hälfte des Volumens und ersetzen Sie es durch Methanol. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male.

Entfernen Sie nach diesen Wäschen die gesamte Lösung und ersetzen Sie sie durch Methanol. Wiederholen Sie diese Methanolwäsche noch einmal. Die fixierten und dehydrierten Eizellen können bis zur Bildgebung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Geben Sie vor der Bildgebung Maries Reinigungsmedium in eine WPI-Fluorschale mit Glasboden, um die Bildgebungsoberfläche abzudecken. Übertragen Sie die Eizellen vorsichtig von Methanol in die Fluorschale und minimieren Sie dabei das übertragene Methanolvolumen. Stellen Sie sich die Eizellen auf einem inversen konfokalen Mikroskop vor, sowohl ein Zeiss LSM five 10 als auch ein aica TCSs P liefern gute Ergebnisse. Jetzt zeigen wir einige repräsentative Bilder der subzellulären RNA-Lokalisierung unmittelbar nach der Mikroinjektion: Fluoreszierende RNA ist im Zellkern nach acht Stunden Kultur der fluoreszenzmarkierten Kontrolle zu sehen.

Die RNA ist gleichmäßig im Zytoplasma der Eizelle verteilt. Eine fluoreszenzmarkierte RNA, die Sequenzen enthält, die die Transportmaschinerie rekrutieren, ist jedoch im Prozess der subzellulären Lokalisation am Gemüsepol der Eizelle zu sehen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie fluoreszenzmarkierte RNAs in Zap-Zyten mikroinjizieren und die RNA-Lokalisierung durch konfokale Mikroskopie beobachten können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, mit Deci behandelte Lösungen zu verwenden, um eine Kontamination der RNAs in der Kultur zu vermeiden, Ihre Zyten in OCM, die Antibiotika enthalten, und um Ihre Zyten nach Möglichkeit vor Sonnenlicht zu schützen, um Photobleiche zu vermeiden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.