Name: Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Hämozyten aus dem Hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes für Zellbiologie und Mikrobiologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Zell-Bakterien-Interaktionen mittels Fluoreszenzfärbung.

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Finanzierungsquellen: University of Connecticut Research Foundation und dem Department of Molecular and Cell Biology an SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-Forschung und Antonio H. und R. Majorie Romano Graduate Education Fellowship zu AJC

<ol><li> Bereiten Sie 500 ml 0,22 um Filter-sterilisiert künstlichem Meerwasser (FSW; Salzgehalt 35 ppt). Filter künstlichen oder natürlichen Meerwasser durch ein 0,22 um-Mikron-Filter zur Entfernung von Partikeln und Bakterien. </li><li> Anesthetize einen Erwachsenen Hawaiian Bobtail Squid (Euprymna scolopes), indem Sie in eine 2% ige Lösung von Ethanol in FSW. Legen Sie das Tier in Narkose für etwa 10 Minuten. Der Tintenfisch wird aufhören Schwimmen und sich nicht aktiv auf Berührung reagieren. Fortsetzung Atmung, angegeben durch die Bewegung der Mantel und Chromatophor Aktivität sollte noch beachtet werden. </li><li> Legen Tintenfisch mit Bauchseite nach oben auf einem Standard-Wachs Dissektion Fach. Tauchen Sie das Tier mit FSW mit 2% Ethanol. </li><li> Mit einem Standard 200 ul Pipettenspitzen, ziehen Sie den Trichter und Mantel zu den wichtigsten cephalica Blutgefäß zwischen den beiden Augen entfernt aussetzen. </li><li> Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit 26,5-Gauge-Nadel, Punktion der V. cephalica Blutgefäß und ziehen zwischen 50-100 ul Hämolymphe. Legen Sie die Hämolymphe in ein steriles 1,5 ml-Röhrchen auf Eis. Hinweis: Wenn ein Tier als Spender mehrfach dienen soll, nur zurücktreten, 10-20 ul der Hämolymphe zu einem bestimmten Zeitpunkt. Zurück das Tier zu einem normalen Meerwasseraquarium. Das Tier wird innerhalb von 30 min wieder zu beleben. </li><li> Frisch gesammelte Blutzellen werden gewaschen und resuspendiert in 500 ul von Squid Ringer Lösung von (S-Ringers, 530 mm NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5). </li><li> Hemocyte Konzentrationen werden durch Zählkammer bestimmt, und etwa 2.000 Zellen werden chambered Glasdeckgläschen hinzugefügt, und man ließ sie auf das Glas für 10 min bei Raumtemperatur zu halten. Bei dieser Dichte, bilden die Blutzellen eines einheitlichen Monolage auf dem Glas Gleitfläche. </li><li> Zur Beobachtung bakterielle Bindung an Host Blutzellen sind Blutzellen zu einer fluoreszenzmarkierten Bakterienstamm wie Vibrio fischeri ES114 und / oder Vibrio harveyi B392, die jeweils eine grün fluoreszierende Reporter ausgesetzt. V. fischeri ES114 und V. harveyi B392 sind bis Mitte der log-Phase in einem Meerwasser-Trypton Medien (SWT) bei 28 ° C in einem Schüttler gewachsen. Die optische Dichte bei 600nm spektrophotometrisch die Zelldichte zu bestimmen. Die Bakterien werden durch Zentrifugation (5.000 rpm für 5 min), der Überstand verworfen und das Pellet wird in S-Ringers resuspendiert. </li><li> 100.000 Bakterienzellen werden mit jeder Kammer hinzugefügt gut so, dass gibt es 50 Bakterien pro hemocyte im Durchschnitt. Die hemocyte / Bakterien Mischungen werden in S-Ringer s-Lösung bei 25 ° C für 1 h, eine Zeit bestimmt, um die maximale Höhe der Bindungsausbeute inkubiert. </li><li> Das Zytoplasma der Blutzellen werden dann fluoreszierend mit 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) gefärbt und anschließend gewaschen in S-Ringers, um die Zellen zu visualisieren. </li><li> Stained Blutzellen mit assoziierten Bakterien werden durch Fluoreszenz betrachtet entweder mit einem Zeiss Entdeckung V20 fluoreszierenden Stereoskop oder eine Leica SP2 spektrale Laser konfokalen Mikroskop und zählte über die gesamte Oberfläche der tierischen Zelle. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Da Kopffüßer Hämolymphe enthält extrazellulären Hämocyanin und nicht Hämoglobin, auf Sauerstoffzufuhr wird die Hämolymphe wiederum dunkelblau. Ein Durchschnitt von ~ 5000 Haemocyten pro ul Hämolymphe wird man mit dieser Methode. Nach Einhaltung der Kammern Deckgläser und Fluoreszenzfärbung, sollte die Blutzellen erscheinen hell fluoreszierend rot und amöboide Form. Für bakterielle Adhäsion, V. fischeri wird schlecht haften, die Blutzellen (1-2 Bakterienzellen pro Blutkörperchen), während V. harveyi wird stark kleben (10-15 Bakterienzellen pro hemocyte). <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Adult Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes zeigt Lage der cephalica Blutgefäß. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Ergebnisse der hemocyte Exposition gegenüber Vibrio fischeri (A) und Vibrio harveyi (B). Red, Cell Tracker Orange; Green, GFP-markierten Bakterien.

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Der squid / vibrio System hat sich als gefügig Modellsystem, um grundsätzliche Fragen in diesem Bereich 2,3,5,6,8 beantworten bewährt. Das Licht-Orgel des Tintenfisches Euprymna scolopes erlaubt Kolonisierung ausschließlich durch die leuchtende Ba...

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek-Kammer mit #1,0-Borosilikat-Deckglas (8-Kammern)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>26,5-G-1-ml-Insulin-Spritze ohne Latex</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V20 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP2 Konfokalmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beziehen blutzellen aus dem hawaiianischen bobtail squid euprymna scolopes und die beobachtung ihrer einhaltung symbiotic und non-symbiotischen bakterien

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Die symbiotische Beziehung zwischen den Hawaii-Bobtail Tintenfisch,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Und die Biolumineszenz Bakterium<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Hat als Modellsystem für das Verständnis der Auswirkungen von nützlichen Bakterien auf tierische Entwicklung genutzt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Makrophagen-ähnliche Blutzellen, die einzige zelluläre Komponente des Tintenfisches Host angeborenen Immunsystems, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen bei der Vermittlung der Einrichtung und Unterhaltung des Vereins. Dieses Protokoll wird zeigen, wie Blutzellen erhalten Sie bei<em&gt; E. scolopes</em&gt; Und verwenden Sie dann diese Zellen in bakteriellen Bindungsassays. Adult Tintenfische sind zunächst betäubt, bevor Hämolymphe wird mit einer Spritze von der Hauptstraße cephalica Blutgefäß gesammelt. Der Gastgeber Blutzellen, in der extrahierten Hämolymphe enthalten sind, zu chambered Deckgläser aufgeklebt und dann auf grün fluoreszierende Protein-markierten symbiotische ausgesetzt<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt; Und nicht-symbiotische<em&gt; Vibrio harveyi</em&gt;. Die Blutzellen werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cell Tracker Orange, Invitrogen) gegengefärbt und anschließend visualisiert Fluoreszenz-Mikroskopie.

Dieses Video wird zeigen, wie Blutzellen (Blutkörperchen) aus dem hawaiianischen Bobtail Squid zu erreichen,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Für den Einsatz in zellbiologischen und bakterielle Adhäsion Assays. Blutzellen wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt werden und ausgesetzt GFP-markierten Bakterien.

Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Untersuchungen zur Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung molekularer Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben in den letzten Jahren ...

Nachdem adulte Bobtail-Tintenfische aus ihren Becken entfernt und mit einer 2 %igen Ethanol-Lösung in gefiltertem Meerwasser anästhesiert wurden, werden sie durch das zephalische Blutgefäß geblutet. Mit einer Spritze mit einer Nadelstärke von 26,5 wird das extrahierte Hämolymphe entnommen, das blau erscheint.Aufgrund der Anwesenheit von Hämocyanin werden die Erythrozyten auf eine gewünschte Konzentration verdünnt und in eine achtgeteilte Deckglas-Kammer pipettiert. Sobald die Erythrozyten an das Deckglas angeheftet sind, werden sie mit Cell Tracker Orange, einem fluoreszierenden Farbstoff, gefärbt und mit GFP-markierten Bakterien herausgefordert, die mittels Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können. Hallo, ich bin Spencer Olm vom Department für Molekulare und Zellbiologie an der University of Connecticut.Und ich bin Andrew Collins vom NY Home Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Gewinnung von Hämolymphe oder Blut aus dem hawaiianischen Kurzkiemer-Tintenfisch. Sie bereiten diese Opis vor.Die Kurzschwanztintenfische sind nachtaktive Tiere, die vor der Küste Hawaiis in der Nähe von Korallenriffen vorkommen, und sie nutzen das Licht ihrer Symbiose, um sich nachts zu tarnen, wenn sie auf die Suche nach ihrer Lieblingsspeise, Garnelen, gehen. In unserem Labor nutzen wir diese Assoziation, um zu untersuchen, wie nützliche Bakterien tierische Gewebe besiedeln. Mithilfe dieses Verfahrens erforschen wir in unserem Labor die Wechselwirkungen zwischen Bestandteilen des angeborenen Immunsystems des Wirts und seinem biolumineszenten bakteriellen Partner VIO ide.Beginnen wir. Bevor Sie Hämolymphe entnehmen, betäuben Sie einen erwachsenen Tintenfisch in einem Ein-Liter-Becher, der eine frisch zubereitete Lösung mit 2 % Ethanol in 500 Milliliter filtrierter, sterilisierter künstlicher Meerwasser enthält. Nach 10 Minuten wird der Tintenfisch nicht mehr schwimmen und nicht aktiv auf Berührung reagieren.Jedoch sollte eine anhaltende Atmung, erkennbar an der Bewegung des Mantels, sowie eine Aktivität der Chromatophoren, die auf eine Aktivität der Pigmentzellen hinweist, weiterhin beobachtet werden. Gießen Sie etwas von der sterilen Meerwasser-Ethanol-Lösung aus dem Becher in ein standardmäßiges Wachspräparationsfeld und tauchen Sie den Tintenfisch mit der Bauchseite nach oben in das Feld ein. Ziehen Sie mit einer standardmäßigen 200-Mikroliter-Pipettenspitze den Flossenträger und den Mantel zurück, um das Hauptblutgefäß des Kopfes freizulegen, das sich zwischen den beiden Augen befindet.Verwenden Sie eine sterile Spritze mit einer Nadel der Größe 26 und einem halben Gauge, um die zephalische Blutgefäße zu punktieren und 50 bis 100 Mikroliter Hämolymphe oder 10 bis 20 Mikroliter abzuziehen. Falls das Tier mehrmals als Spender dienen soll, geben Sie die Hämolymphe in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass das Tintenfischblut dunkelblau erscheinen sollte, wenn dieser Schritt korrekt durchgeführt wurde.Das Tier in einen normalen Meerwassertank zurückbringen, um es zu reanimieren. Das Hämolymphe in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugieren, um das Hämocyten-Pellet zu erhalten, und den Überstand abpipettieren. Die Hämocyten in 500 Mikrolitern Tintenfisch-Ringer-Lösung resuspendieren, um sie zu waschen. Anschließend erneut zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren, und den Überstand entfernen.Schließlich resuspendieren Sie die Hämocyten in Squid-Ringer-Lösung. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mittels Hämocytometer. Geben Sie anschließend etwa 2000 Zellen in jede Kammer eines Glas-Deckgläschens.Lassen Sie die Zellen etwa 10 Minuten lang an das Glas andocken. Bei dieser Dichte sollten die Hemos eine gleichmäßige Monoschicht auf der Glasoberfläche bilden. Halten Sie die Hemos auf Eis, während Sie die Bakterien in einem Rüttelinkubator bei 28 Grad Celsius vorbereiten.Züchten Sie eine oder mehrere Stämme von Vireo-Bakterien, die ein grün fluoreszierendes Reportergen enthalten, in Seewasser-Triton-Medium bis zur mittleren log-Phase. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der Kultur bei 600, um die Zelldichte zu bestimmen; pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation, verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie die Bakterien in ein Milliliter Tintenfisch-Ringer-Lösung und fügen Sie sie den Hämocyten hinzu.In den gekammerten Objektträgern mit 100.000 Bakterien pro Kammer. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur. Um eine maximale Bindung zu erzielen, geben Sie Cell Tracker Orange hinzu und fügen Sie eine Endkonzentration von 0,005 % hinzu, um das Hämocytoplasma anzufärben.30 Minuten inkubieren und anschließend mit 150 Mikrolitern frischer Squid-Ringer-Lösung waschen. Ein konfokales Mikroskop hinzufügen, die gefärbten He-Zellen und assoziierte Bakterien betrachten und die Bakterien über die gesamte Oberfläche der He-Zelle hinweg zählen. Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Bilder von He-Zellen, die mit dem GFP-markierten nicht-symbiotischen Bakterium Filio Harvey Eye und dem natürlichen Tintenfisch-Symbionten Filio fii herausgefordert wurden.Hier ist ein Bild einer Hämolysestelle, die mit keinem Bakterium herausgefordert wurde. Die Zelle erscheint rot und ist aktiviert worden. Man kann also deren pseudopodienartige Ausstülpungen erkennen.Wenn die Zelle mit dem bakteriellen Symbionten *Vibrio fischeri* herausgefordert wird, sind nur wenige Bakterien an der Zelloberfläche gebunden zu erkennen. Im Gegensatz dazu binden deutlich mehr Bakterien, wenn die nicht-symbiotische Bakterienart *Vibrio harveyi* dem Hämolymphe ausgesetzt wird. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Hämolymphe aus einem Kurzschwanztintenfisch gewinnt, die Hämocyten isoliert und in Experimenten verwendet, um die bakterielle Adhärenz an diesen Tintenfischzellen zu charakterisieren.Dieses Protokoll könnte für die Immunchemie modifiziert werden, indem die Hämocyten fixiert werden, nachdem sie an der Oberfläche des Deckgläschens haften. R-N-A-D-N-A und Proteine können ebenfalls extrahiert werden, sobald die Hämocyten aus dem Tier gewonnen wurden. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

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Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

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