Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Nachdem adulte Bobtail-Tintenfische aus ihren Becken entfernt und mit einer 2 %igen Ethanol-Lösung in gefiltertem Meerwasser anästhesiert wurden, werden sie durch das zephalische Blutgefäß geblutet. Mit einer Spritze mit einer Nadelstärke von 26,5 wird das extrahierte Hämolymphe entnommen, das blau erscheint.

Aufgrund der Anwesenheit von Hämocyanin werden die Erythrozyten auf eine gewünschte Konzentration verdünnt und in eine achtgeteilte Deckglas-Kammer pipettiert. Sobald die Erythrozyten an das Deckglas angeheftet sind, werden sie mit Cell Tracker Orange, einem fluoreszierenden Farbstoff, gefärbt und mit GFP-markierten Bakterien herausgefordert, die mittels Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können. Hallo, ich bin Spencer Olm vom Department für Molekulare und Zellbiologie an der University of Connecticut.

Und ich bin Andrew Collins vom NY Home Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Gewinnung von Hämolymphe oder Blut aus dem hawaiianischen Kurzkiemer-Tintenfisch. Sie bereiten diese Opis vor.

Die Kurzschwanztintenfische sind nachtaktive Tiere, die vor der Küste Hawaiis in der Nähe von Korallenriffen vorkommen, und sie nutzen das Licht ihrer Symbiose, um sich nachts zu tarnen, wenn sie auf die Suche nach ihrer Lieblingsspeise, Garnelen, gehen. In unserem Labor nutzen wir diese Assoziation, um zu untersuchen, wie nützliche Bakterien tierische Gewebe besiedeln. Mithilfe dieses Verfahrens erforschen wir in unserem Labor die Wechselwirkungen zwischen Bestandteilen des angeborenen Immunsystems des Wirts und seinem biolumineszenten bakteriellen Partner VIO ide.

Beginnen wir. Bevor Sie Hämolymphe entnehmen, betäuben Sie einen erwachsenen Tintenfisch in einem Ein-Liter-Becher, der eine frisch zubereitete Lösung mit 2 % Ethanol in 500 Milliliter filtrierter, sterilisierter künstlicher Meerwasser enthält. Nach 10 Minuten wird der Tintenfisch nicht mehr schwimmen und nicht aktiv auf Berührung reagieren.

Jedoch sollte eine anhaltende Atmung, erkennbar an der Bewegung des Mantels, sowie eine Aktivität der Chromatophoren, die auf eine Aktivität der Pigmentzellen hinweist, weiterhin beobachtet werden. Gießen Sie etwas von der sterilen Meerwasser-Ethanol-Lösung aus dem Becher in ein standardmäßiges Wachspräparationsfeld und tauchen Sie den Tintenfisch mit der Bauchseite nach oben in das Feld ein. Ziehen Sie mit einer standardmäßigen 200-Mikroliter-Pipettenspitze den Flossenträger und den Mantel zurück, um das Hauptblutgefäß des Kopfes freizulegen, das sich zwischen den beiden Augen befindet.

Verwenden Sie eine sterile Spritze mit einer Nadel der Größe 26 und einem halben Gauge, um die zephalische Blutgefäße zu punktieren und 50 bis 100 Mikroliter Hämolymphe oder 10 bis 20 Mikroliter abzuziehen. Falls das Tier mehrmals als Spender dienen soll, geben Sie die Hämolymphe in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass das Tintenfischblut dunkelblau erscheinen sollte, wenn dieser Schritt korrekt durchgeführt wurde.

Das Tier in einen normalen Meerwassertank zurückbringen, um es zu reanimieren. Das Hämolymphe in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugieren, um das Hämocyten-Pellet zu erhalten, und den Überstand abpipettieren. Die Hämocyten in 500 Mikrolitern Tintenfisch-Ringer-Lösung resuspendieren, um sie zu waschen. Anschließend erneut zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren, und den Überstand entfernen.

Schließlich resuspendieren Sie die Hämocyten in Squid-Ringer-Lösung. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mittels Hämocytometer. Geben Sie anschließend etwa 2000 Zellen in jede Kammer eines Glas-Deckgläschens.

Lassen Sie die Zellen etwa 10 Minuten lang an das Glas andocken. Bei dieser Dichte sollten die Hemos eine gleichmäßige Monoschicht auf der Glasoberfläche bilden. Halten Sie die Hemos auf Eis, während Sie die Bakterien in einem Rüttelinkubator bei 28 Grad Celsius vorbereiten.

Züchten Sie eine oder mehrere Stämme von Vireo-Bakterien, die ein grün fluoreszierendes Reportergen enthalten, in Seewasser-Triton-Medium bis zur mittleren log-Phase. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der Kultur bei 600, um die Zelldichte zu bestimmen; pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation, verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie die Bakterien in ein Milliliter Tintenfisch-Ringer-Lösung und fügen Sie sie den Hämocyten hinzu.

In den gekammerten Objektträgern mit 100.000 Bakterien pro Kammer. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur. Um eine maximale Bindung zu erzielen, geben Sie Cell Tracker Orange hinzu und fügen Sie eine Endkonzentration von 0,005 % hinzu, um das Hämocytoplasma anzufärben.

30 Minuten inkubieren und anschließend mit 150 Mikrolitern frischer Squid-Ringer-Lösung waschen. Ein konfokales Mikroskop hinzufügen, die gefärbten He-Zellen und assoziierte Bakterien betrachten und die Bakterien über die gesamte Oberfläche der He-Zelle hinweg zählen. Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Bilder von He-Zellen, die mit dem GFP-markierten nicht-symbiotischen Bakterium Filio Harvey Eye und dem natürlichen Tintenfisch-Symbionten Filio fii herausgefordert wurden.

Hier ist ein Bild einer Hämolysestelle, die mit keinem Bakterium herausgefordert wurde. Die Zelle erscheint rot und ist aktiviert worden. Man kann also deren pseudopodienartige Ausstülpungen erkennen.

Wenn die Zelle mit dem bakteriellen Symbionten *Vibrio fischeri* herausgefordert wird, sind nur wenige Bakterien an der Zelloberfläche gebunden zu erkennen. Im Gegensatz dazu binden deutlich mehr Bakterien, wenn die nicht-symbiotische Bakterienart *Vibrio harveyi* dem Hämolymphe ausgesetzt wird. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Hämolymphe aus einem Kurzschwanztintenfisch gewinnt, die Hämocyten isoliert und in Experimenten verwendet, um die bakterielle Adhärenz an diesen Tintenfischzellen zu charakterisieren.

Dieses Protokoll könnte für die Immunchemie modifiziert werden, indem die Hämocyten fixiert werden, nachdem sie an der Oberfläche des Deckgläschens haften. R-N-A-D-N-A und Proteine können ebenfalls extrahiert werden, sobald die Hämocyten aus dem Tier gewonnen wurden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.