Name: Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Organen aus adultem Zebrafisch für Entwicklungsbiologie und Neuroforschung. Diese Methode ermöglicht die systematische Dissektion von Gonaden, Herz, Leber und Gehirn.

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Diese Arbeit wurde vom NIH R01 HD050901 zu MCM und American Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041 bis 01-DDC zur TG unterstützt.

<ol><li> Ein männlicher Zebrafisch wird zuerst zerlegt werden, gefolgt von einer weiblichen Fische. Vor Beginn der Dissektion, betäuben ein Fisch in 0,2% Tricaine und dann einschläfern es durch Inkubation in Eiswasser für 15 Minuten. </li><li> Beginnen Sie mit dem leicht klopfen die Fische trocken auf einem Papiertuch und legt es auf dem Seziertisch Matte. Äußerlich haben Zebrafisch einzigen dorsalen, Schwanz-und Afterflossen und gepaart Brust-und Bauchflossen (Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Erwachsene männliche Fische mit Flossen gekennzeichnet. </li><li> Pin die Fische auf die Matte Sezieren durch den fleischigen Teil des Schwanzes und der ventrale Teil der Augenhöhle. </li><li> Snip die Haut an den Bauch des Fisches knapp vor der Afterflosse. Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur entlang der Bauch von der Afterflosse, die Operculum (die harte Abdeckung über der Kiemen) (Abbildung 2, Stufe 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Steps bei der Beseitigung von Haut und Körper Wand Muskulatur der inneren Organe freizulegen. </li><li> Dann entfernen Sie das Operculum und die Brustflosse, einschließlich der Schultergürtel (die dicken, knöchernen Region an der Basis des fin) (Abbildung 2, Schritt 2). Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur zu Beginn von oben der nun freiliegenden Kiemen hinten an der Seite des Fisches und dann auf der Afterflosse (Abb. 2, Schritt 3). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Haut und darunter liegende Muskulatur von der Seite des Fisches. Viele der inneren Organe sind jetzt sichtbar (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Erwachsene männliche Fische mit Körperwand und Muskulatur entfernt ermöglicht die Visualisierung der inneren Organe. </li><li> Die Hoden sind lang, weiß, gepaart Organe, die an der dorsalen Körperwand befestigt sind. Entfernen eines Hodens und legen Sie sie in eine Schüssel mit PBS. Untersuchen Sie die Hoden mit reflektiertem Licht zu den Samenkanälchen (Abbildung 4), die Zysten enthalten mit verschiedenen Stadien der Entwicklung von Keimzellen aus spermatagonia zu Spermatiden (Leal et al., 2009) zu visualisieren. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Dissection eines Hodens. Die weißen rundlichen Strukturen sind die Samenleiter. </li><li> Dann entfernen Sie den Magen-Darm-System aus der Körperhöhle des Fisches. Die Leber kann durch seine Größe, gelappt Morphologie, bräunlichen Farbe und umfangreiche Vaskularisierung identifiziert werden. Die Gallenblase, eine grüne durchscheinende Flüssigkeit gefüllten Sack, und die Milz, die leuchtend rot erscheint, sind in den Eingeweiden gefunden. </li><li> Separate den Darm aus dem Rest der Organe und auszustrecken. Die vorderen, mittleren und hinteren Regionen des Darms werden durch die Höhe der epithelialen Falten (Wallace et al., 2005) definiert. </li><li> Legen Sie ein Stück des Darms in PBS und beobachten Sie die epithelialen Falten mit Durchlicht. </li><li> Als nächstes untersuchen die Schwimmblase. Die Schwimmblase besteht aus einer hinteren Kammer, die an der Speiseröhre über den pneumatischen Kanal, und eine vordere Kammer, die an das Innenohr durch den Weberschen Apparat (Finney et al., 2006) ist in Verbindung steht. </li><li> Entfernen und Entsorgen der Schwimmblase. Unpin die Fische und re-pin es Bauchseite bis zu den Nieren, die sich entlang der dorsalen Körperwand befindet sezieren. Die Niere ist ein durchsichtiges Rosa-Struktur mit der dorsalen Aorta und pigmentierten Zellen assoziiert. Die Niere ist in Kopf, Körper und Schwanz Regionen (Abbildung 5) unterteilt. Dissect ein Stück der Niere und legen Sie sie in PBS. Tease neben dem Nierengewebe der Nierentubuli zu offenbaren. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Lage der Kopf, Körper und Schwanz Nieren entlang der dorsalen Körperwand. </li><li> Sezieren einen weiblichen Fisch. Wie zuvor beschrieben, euthanize die Fische in Eiswasser und pat es trocken ist, bevor Pinning es dem Sezieren Matte. Entfernen Sie die Haut von der Seite des Fisches, wie zuvor gezeigt. Der Eierstock ist ein bilobed Struktur, die in der Leibeshöhle durch einen vaskularisierten Mesovarium ausgesetzt ist. </li><li> Nehmen Sie einen Lappen des Eierstocks, legen Sie sie in PBS, und prüfen Sie mit Durchlicht. Die Eizellen können neben gehänselt werden mit feinen Nadeln und dann inszeniert (Abbildung 6, Selman et al., 1993). Stage I Eizellen sind ca. 10 bis 150 Mikrometer groß und durchscheinend. Stage II-Oozyten sind etwa 150 bis 350 Mikrometer groß und definiert durch das Auftreten von kortikalen Granula. Stadium III Oozyten sind 350 bis 750 Mikrometer groß und undurchsichtig sind aufgrund der Ansammlung von Dotter. Reifen Stadium IV und V Eizellen sind lichtdurchlässig und in der Regel nicht in den Eierstöcken der Frauen, die vor kurzem gepaart gefunden haben. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Live Stadium I, II, III und Eizellen unter einem beobachtetenBinokular mit Durchlicht. </li><li> Als nächstes zerlegen das Herz aus dem Fisch. Das Herz befindet sich posterior und ventral der Kiemen. Beginnen Sie mit dem Herausschneiden des Herzens und all das umliegende Gewebe und es in PBS. Sorgfältig sezieren weg das Gewebe rund um das Herz, darauf achten, daß die zarte Atrium Schäden. </li><li> Setzen Sie den sezierten Herzen in Ringer-Lösung, um den Herzschlag zu beobachten. Identifizieren Sie die Atrium, Ventrikel und Bulbus arteriosus (Abb. 7, Hu et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Dissected erwachsenen Herzens. </li><li> Füllen Sie das Sezieren, indem das Gehirn aus dem Fisch. Beginnen Sie mit der unpinning die Fische und das Entfernen der Kopf mit einer Rasierklinge. Entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich von der Bauchseite des Schädels mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Augen mit kleinen Feder Schere. Brechen Sie den Schädel und entfernen Sie die Knochen aus dem ventralen Seite des Gehirns. Setzen Sie nun den Kopf in eine Schüssel mit PBS und die Haut abziehen und Schädelknochen von der dorsalen Seite des Gehirns. </li><li> Identifizieren Sie die Riechkolben, Telencephalon, Habenula, Tectum opticum, Cerebellum und Medulla (Abbildung 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="Abbildung 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Dissected erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Dorsalansicht, anterior nach oben. </li></ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.

Reagenzien: 0,2% Tricaine (Ethyl-3-Aminobenzoesäure) 200 mg Pulver Tricaine 97,9 ml DD-Wasser ~ 1 ml 1 M Tris (pH 9) Der pH-Wert auf 7,0 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 4,0 g NaCl 0,1 g KCl 100 ml 0,1 M PO 4-Puffer, pH 7,3 150 ml dH 2 O Ringer-Lösung 6,7 g NaCl 0,2 g KCl 0,2 g CaCl 2 1,2 g Hepes 1 LH 2 O Der pH-Wert auf 7,2 Ausstattung: Dissecting Gericht mit Matte Electron Microscopy Sciences Katalog # 70540 Vannas Frühjahr Schere Feine Science Tools Katalog Nr. 91500-09

dissection von organen aus dem adult zebrafisch

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

In den letzten 20 Jahren hat sich der Zebrafisch zu einem leistungsfähigen Modell-Organismus für das Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren und Krankheit. Obwohl experimentelle Analyse des Embryos und Larven ist sehr umfangreich und die Morphologie ist gut dokumentiert, sind die Beschreibungen der erwachsenen Zebrafisch Anatomie und Studien über die Entwicklung der erwachsenen Strukturen und Organe, zusammen mit Techniken für die Arbeit mit Erwachsenen fehlen. Die Organe der Larve eine bedeutende Veränderung in ihrer gesamten Struktur, Morphologie und anatomische Lage während des Larven zu erwachsenen Übergang. Äußerlich entwickelt die transparente Larve ihren charakteristischen Erwachsenen gestreiften Pigment Muster und gepaart Bauchflossen, während intern die Organe zu unterziehen massives Wachstum und Umbau. Darüber hinaus entwickelt die bipotentialen Geschlechtsdrüse Primordium entweder in Hoden oder Eierstock. Dieses Protokoll enthält viele Organe des Erwachsenen und zeigt Methoden für die Präparation des Gehirns, Gonaden, Magen-Darm-System, Herz und Niere des erwachsenen Zebrafisch. Die sezierten Organe können in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie, RNA-Extraktion, Protein-Analyse und andere molekulare Techniken eingesetzt werden. Dieses Protokoll wird in die Erweiterung der Studien im Zebrafisch zu helfen, den Umbau des larvalen Organe, die Morphogenese von Organen spezifisch für die Erwachsenen und andere Untersuchungen der erwachsenen Organsysteme umfassen.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und seziert Organe von den erwachsenen Zebrafisch.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

In den letzten 20 Jahren hat sich der Zebrabär zu einem leistungsstarken Modellorganismus für das Verständnis der Entwicklung und von Erkrankungen bei Wirbeltieren entwickelt. Obwohl experimentelle ...

In den letzten 20 Jahren ist der Zebrafisch zu einem leistungsfähigen Modellorganismus für das Verständnis der Wirbeltierentwicklung und von Erkrankungen geworden. Obwohl die Embryo- und Larvenmorphologie gut dokumentiert ist, fehlen detaillierte Beschreibungen der Anatomie erwachsener Zebrafische sowie Methoden zum Arbeiten mit adulten Tieren. Die Arbeitsgruppe von Mary Mullin an der University of Pennsylvania untersucht die Gonadenentwicklung und führt routinemäßig die Dissektion von Eierstöcken und Hoden aus adulten Fischen durch.Dieses Protokoll demonstriert die Dissektion der Gonaden sowie die Identifizierung und Dissektion der anderen wichtigen Organsysteme. Zunächst wird ein Fisch anästhesiert und euthanasiert und anschließend auf einer Dissektionsunterlage fixiert. Die Haut und die darunterliegende Muskulatur werden vom Fisch entfernt, um Herz, Leber, Darm, Gonade und Schwimmblase freizulegen.Die inneren Organe werden aus der Körperhöhle entfernt. Für weitere Untersuchungen oder Experimente wird Tripti Gupta aus dem Labor von Mary Mullins von der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie der University of Pennsylvania viele der Organe des adulten Zebrabärblings identifizieren und demonstrieren, wie man sie von einem erwachsenen Zebrabärbling präpariert. Der Einfachheit und Klarheit halber werden die Hoden, das gastrointestinalen System und die Niere von einem männlichen Zebrabärbling sowie anschließend die Eierstöcke, das Herz und das Gehirn von einem weiblichen Zebrabärbling präpariert.Um die Menge an Nahrung im Darm zu verringern. Füttern Sie die Fische am Tag vor der Sektion nicht. Ein männlicher Zebrafisch wird seziert.Zunächst benötigen Sie eine Präparationsunterlage, Venetianer-Springer-Scherenpinzette, Präparationsnadeln, eine Schale mit PBS und einen Fisch, der anästhesiert und euthanasiert wurde. Tupfen Sie den Fisch leicht mit einem Papiertuch trocken und legen Sie ihn auf die Seite. Auf einer Präparationsunterlage haben Zebrafische eine einzelne dorsale Flosse und eine Afterflosse sowie gepaarte Becken- und Brustflossen.Verwenden Sie Präpariernadeln, um den Fisch durch den fleischigen Teil des Schwanzes und den ventralen Teil der Augenhöhle auf der Präparationsunterlage festzustecken. Schneiden Sie mit der Feder-Schere die Haut am Bauch des Fisches direkt vor der Afterflosse ein. Schneiden Sie die Haut und den darunterliegenden Muskel entlang des Bauches von der Afterflosse bis zum harten Deckel über der Kieme, dem sogenannten Operculum.Verwenden Sie die Schere und die Pinzette, um das Operculum und die Brustflosse, einschließlich des dicken knöchernen Bereichs an der Basis der Flosse, der als Brustgürtel bezeichnet wird, auszuschneiden. Entfernen Sie diese, um die Kiemen freizulegen. Schneiden Sie die Haut und den darunterliegenden Muskel beginnend oberhalb der freigelegten Kieme entlang der Seite des Fisches nach posterior und dann bis zur Afterflosse hinab. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und die darunterliegende Muskulatur an der Seite des Fisches, um die inneren Organe freizulegen. Die Hoden sind lange, weiße, paarig angeordnete Organe, die an der dorsalen Körperwand befestigt sind. Entfernen Sie einen Hoden und legen Sie ihn in eine Schale mit PBS bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das mit dem Hoden verbundene Fettgewebe.Untersuchen Sie das Hodengewebe mit reflektiertem Licht unter einem Stereomikroskop, um die seminiferen Tubuli sichtbar zu machen, die Zysten mit verschiedenen Entwicklungsstadien von Keimzellen enthalten, von den Spermatogonien bis zu den Spermatiden. Entfernen Sie anschließend das Gastrointestinalsystem aus der Körperhöhle des Fisches; die Gallenblase, ein grüner, durchscheinender, flüssigkeitsgefüllter Sack, sowie die Milz, die hellrot erscheint, befinden sich im Bereich der Eingeweide. Die Leber kann anhand ihrer großen Größe, gelappten Morphologie, bräunlichen Farbe und ausgeprägten Durchblutung identifiziert werden.Trennen Sie den Darm von den übrigen Organen und strecken Sie ihn aus. Die vordere, mittlere und hintere Region des Darms wird anhand der Höhe der epithelialen Falten definiert, wobei die vordere Region die höchsten Falten aufweist. Legen Sie ein Stück des Darms in PBS und betrachten Sie die epithelialen Falten unter dem Mikroskop mit Durchlicht.Untersuchen Sie nun die Schwimmblase. Die Schwimmblase besteht aus einer hinteren Kammer, die über den pneumatischen Gang mit der Speiseröhre verbunden ist, und einer vorderen Kammer, die über das Weber'sche Organ mit dem Innenohr verbunden ist. Entfernen und entsorgen Sie die Schwimmblase, lösen Sie die Fischpräparation von den Nadeln und legen Sie sie erneut mit der Bauchseite nach oben, um die Niere zu dissezieren.Die Niere ist eine durchscheinende, rosa Struktur, die entlang der dorsalen Körperwand liegt und mit der Aorta dorsalis und pigmentierten Zellen assoziiert ist. Die Niere ist in Kopf-, Körper- und Schwanzregion unterteilt. Okay, also hier sind der Kopf, der Nierenkörper und der Schwanz.Dies ist die Aorta und dies sind die pigmentierten Zellen. Präparieren Sie ein Stück der Niere und legen Sie es unter dem Mikroskop in PBS. Zupfen Sie das Nierengewebe mit den Nadeln auseinander, um die Nierentubuli freizulegen.Für die Dissektion eines weiblichen Fisches benötigen Sie die gleichen Werkzeuge wie zuvor sowie einige feine Nadeln, eine Rasierklinge und eine Schale mit Ringer-Lösung. Für die Herzdissektion tupfen Sie den euthanasierten Fisch trocken und fixieren ihn auf der Dissektionsunterlage. Entfernen Sie wie zuvor mithilfe der gleichen Techniken die Haut von der Seite des weiblichen Fisches.Der Ovar ist eine zweilappige Struktur, die im Körperhohlraum durch ein durchblutetes Mesovarium aufgehängt ist. Entfernen Sie eine Ovarlappen und geben Sie ihn in PBS. Untersuchen Sie den Ovar unter dem Mikroskop mit aufrechtem Licht.Die Zellen können mit feinen Nadeln auseinandergezogen und dann anhand ihrer Größe und ihres Erscheinungsbildes Stadien zugeordnet werden. Danach dissezieren Sie das Herz aus dem Fisch. Das Herz befindet sich hinter dem Kiemen und darunter.Schneiden Sie zunächst das Herz zusammen mit dem gesamten umgebenden Gewebe aus und legen Sie es unter dem Mikroskop in PBS. Dissezieren Sie vorsichtig das das Herz umgebende Gewebe, wobei darauf geachtet werden muss, das empfindliche Vorhofgewebe nicht zu beschädigen. Geben Sie das präparierte Herz in Ringer-Lösung und stellen Sie es unter das Mikroskop.Um den Herzschlag zu beobachten, identifizieren Sie das Atrium, den Ventrikel und den Bulbus arteriosus. Um Zugang zum Gehirn zu erhalten, nehmen Sie den Fisch von der Nadelung und entfernen Sie den Kopf mit dem Rasiermesser. Entfernen Sie mit der Pinzette so viel Weichgewebe wie möglich von der ventralen Seite des Schädels.Identifizieren Sie die Sehnervenkreuzung und entfernen Sie anschließend die Augen mit kleinen Feder-Scheren. Brechen Sie mit der Pinzette den Schädel auf und entfernen Sie den Knochen von der ventralen Seite des Gehirns. Durchtrennen Sie die Hirnnerven mit der Feder-Schere.Falls erforderlich, bewegen Sie den Kopf in eine Schale mit PBS. Drehen Sie den Kopf um und entfernen Sie die Haut und Schädelknochen von der dorsalen Seite des Gehirns unter dem Mikroskop; identifizieren Sie die Riechkolben. Benennen Sie Cephalon, ULA, optischen Tumor, Kleinhirn und Medulla oblongata.Hier sind die Riechkugeln, das türkisfarbene Cephalon, die Ula, der optische Tumor, das Kleinhirn und die Medulla, das Herz, das gastrointestinale System, die Gonaden, die Schwimmblase, die Niere und das Gehirn, die von adulten Zebrafischen isoliert wurden. Diese Organe können nun für die in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie, RNA-Extraktion oder andere molekulare Methoden verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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