Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Wir zeigen, dass durch den Einsatz von Eco-Chip-Bauelementen physikalische Strukturen und Druckhöhen konstant gehalten oder variiert werden können. Während der Einfluss der Oberflächenchemie, der Fluideigenschaften oder der Eigenschaften der Partikel oder Mikroben systematisch durch Transportexperimente mit einem nicht-pathogenen grün fluoreszierenden Protein untersucht wird, das den VIO-Bakterienstamm exprimiert, veranschaulichen wir die Bedeutung der Habitatstruktur, der Strömungsbedingungen und der Inokulumgröße für grundlegende Transportphänomene. Mikrofluidische Software Überzeugender Blick auf eine verborgene Welt.

Hallo, unser Dimitri Marker vom Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education an der Vanderbilt University. Und ich bin David Schafer, Forschungs- und Entwicklungsingenieur hier bei den Viro Laboratories. Hallo, ich bin Leslie Sho vom Department of Chemical Materials and Biomolecular Engineering am Center for Environmental Science and Engineering an der University of Connecticut, und ich habe Dicot ebenfalls von Zebra hinzugefügt.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erstellung modularer mikrofluidischer Habitat-Arrays für die umweltwissenschaftliche und ingenieurwissenschaftliche Grundlagenforschung. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Auswirkungen von mikrometerskaligen Strukturen auf mikrobielle Transportinteraktionen in Waldmedien zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Der erste Schritt bei der Erstellung eines mikrofluidischen Geräts besteht darin, ein zweidimensionales Layout des Geräts in einem computergestützten Zeichnungs- oder CAD-Programm zu zeichnen. Wir haben AutoCAD verwendet, aber es sind auch andere Zeichenprogramme verfügbar, wie z. B. clue in oder coral draw. Die Software ermöglicht es dem Designer, physikalische Strukturen in einem makroskopischen Feld originalgetreu zu replizieren, während einzelne Merkmale mit einer Auflösung von weniger als fünf Mikrometern definiert werden.

Aus der CAD-Zeichnung wird eine fotografische Maske erstellt. Wir verwenden eine Chrommaske, die von der Advanced Reproductions Corporation, North End of Massachusetts, hergestellt wird. Die nächsten Schritte der Herstellung von mikrofluidischen Geräten finden in einem Reinraum statt, um ein Master zu erstellen.

Ein sauberer Siliziumwafer wird in einem Spin-Coder mit Fotolack beschichtet. Zuerst wird der Wafer an die Spin-Coder-Plattform angehängt und einige Gramm SU 8 20 25 Photoresist werden auf die Mitte des Wafers gegossen. Dann wird der Wafer für einen anfänglichen 15-Sekunden-Spreizzyklus bei 500 U/min geschleudert, gefolgt von einem 4.000 U/min dünnen Beschichtungszyklus für 35 Sekunden.

Nach dem Schleudern wird der Wafer für 10 Minuten bei 95 Grad Celsius auf eine Heizplatte gelegt, um überschüssiges Lösungsmittel zu verflüchtigen. Der letzte Schritt bei der Vorbereitung des Wafers ist das Entfernen der Randraupe. Dies geschieht, indem der Wafer wieder in den Spin-Coder zurückgeführt und ein stetiger Strom von SUA-Kantengeschwindigkeitsentferner auf die Außenkante des beschichteten Wafers aufgetragen wird.

Der nächste Schritt besteht darin, den Fotolack durch selektive Belichtung mit UV-Licht zu strukturieren. Zuerst wird der beschichtete Wafer auf eine ebene Fläche gelegt und die Chrommaske direkt darauf gelegt. Rubylithrote Abdeckfolie blockiert die Übertragung von Mustern außerhalb des gewünschten Bereichs.

Als nächstes wird eine 300 Milli JUUL pro Quadratzentimeter große Dosis UV-Licht durch die Maske unter Verwendung eines Spot-Carry-Systems auf den beschichteten Wafer abgegeben. Schließlich wird der Wafer 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius gebacken, um die lichtbelichteten Bereiche des Fotolacks zu vernetzen und unlöslich zu machen. Der letzte Schritt bei der Erstellung des Masters besteht darin, die nicht vernetzten Bereiche des Fotolacks zu entfernen, wodurch erhabene Reliefstrukturen zurückbleiben.

Zunächst wird der Wafer wieder an den Spin-Coder zurückgegeben und mit der Entwicklerlösung belegt. Der Entwickler verbleibt etwa fünf Minuten auf dem beschichteten Wafer und wird dann abgeschleudert, wodurch ein deutlich sichtbares Muster auf dem Wafer entsteht. Verbleibende Rückstände werden durch Spritzen von Isopropylalkohol auf den rotierenden Wafer abgewaschen.

Wir verwenden für diesen Schritt eine Schleuderdrehzahl von 2200 U/min für etwa fünf bis 10 Sekunden. Schließlich wird das fertige Master mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet und in einer Schale gelagert, bis es zum Gießen eines Geräts benötigt wird. Wir stellen mikrofluidische Bauelemente aus dem Silikonelastomer Polymethylalan her.

Zunächst werden das Grundmaterial und das Härter im Verhältnis 10 zu eins in einen Kunststoffbecher gegeben. Als nächstes wird die Mischung gemischt. Andy sprudelte mit einem thinky AR 100 Konditionsmischer.

Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, wird flüssiges PDMS gleichmäßig über den Master gegossen. Die Schale, in der sich der Master und das nicht ausgehärtete PDMS befinden, wird dann zur Entgasung in eine Vakuumkammer gestellt. Die Polymerblasen treten fast sofort auf.

Die Entgasung wird so lange fortgesetzt, bis alle Blasen verschwunden sind. Das Gericht wird für mindestens vier Stunden bei 65 Grad Celsius in einen auf hoher Stufe geschobenen Ofen, um die Polymervernetzung vollständig zu ermöglichen. Anschließend wird das ausgehärtete PDMS vorsichtig aus dem wiederverwendbaren Master entfernt.

Die ersten vier Kanten werden mit einem Skalpell weit außerhalb des gemusterten Bereichs abgeschnitten, das Gerät wird mit einer Pinzette von der gemusterten Waffel abgezogen. Die Kanten des Gerätes können auf Wunsch mit einer Schere beschnitten werden. Ein Unterabschnitt der Vorrichtung kann vom Rest der geformten PDMS-Vorrichtung getrennt werden.

Als nächstes werden Zugangslöcher durch das PDMS gestanzt. Wir verwenden Biopsiestempel, die im Handel in verschiedenen Größen erhältlich sind und an einem kleinen Dorn montiert sind. Die PDMS-Kerne werden mit einer Pinzette entfernt.

Zum Schluss wird das getrimmte und gestanzte Gerät mit Isopropylalkohol und einem mit Schaumstoff bestückten Polypropylentupfer gereinigt. Das Gerät wird mit Stickstoff getrocknet und dann in den Ofen gestellt, um alle Spuren von Lösungsmittel zu entfernen. Der letzte Schritt bei der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts besteht darin, das PDMS auf ein Glasobjektträgersubstrat zu kleben und dann zuerst mit Flüssigkeit zu füllen.

Das PDMS-Gerät und ein Objektträger werden mit dem Abstand der Klebefläche nach oben in einen Plasmareiniger gelegt. In diesem Versuch verwenden wir einen Herrick Plasmareiniger PDC 32 G. Sobald das Vakuum hergestellt ist und das blauviolette Plasma sichtbar ist, wird ein Timer auf 30 Sekunden eingestellt.

Der Plasmagenerator wird abgeschaltet. Die Kammer wird wieder unter Druck gesetzt, und die Vorrichtung und der Schieber, die aus der Kammer entnommen werden, und die Klebeflächen werden in Kontakt gebracht. Bei der Entnahme der aktivierten Komponenten aus der Kammer ist es wichtig, schnell zu handeln, damit die Oberflächen aktiviert bleiben.

Sanfter Druck hilft, eine gute Verbindung zu gewährleisten. Die Qualität der Verbindung wird durch Ziehen an einer Ecke mit einer Pinzette überprüft. Das hydrophile Innere kann dann einfach mit einer wässrigen Lösung wie Puffermedien gefüllt oder deionisiert werden.

Die Wasserflüssigkeit wird in jede Quellvertiefung und durch die entsprechende mikroporöse Durchflusszelle verabreicht. Sobald alle Kammern voll sind, wird eine dünne Schicht ausgehärtetes PDMS über das gesamte Gerät gelegt, um die Verdunstung zu verzögern und die Sterilität zu erhalten. Um den druckgesteuerten Durchfluss im Gerät zu kalibrieren, laden Sie die mikrostrukturierten Durchflusszellen mit deionisiertem Wasser vor, platzieren Sie ein Durchflussmodul, das als Flüssigkeitsabgabeschnittstelle und sterile Dichtung auf dem Gerät fungiert.

Dieses Durchflussmodul kann allein verwendet oder an ein externes flüssigkeitshaltiges Reservoir, wie z. B. eine Kunststoffspritze, angeschlossen werden. Schließen Sie ein flüssigkeitshaltiges Reservoir, wie z. B. eine Kunststoffspritze oder das Durchflussmodul, an den vorgeschalteten Einlass an. Halten Sie die Höhe der Flüssigkeit im Behälter über der Höhe des flussabwärts gelegenen Behälters.

Nun, der Höhenunterschied zwischen dem stromaufwärts gelegenen Reservoir und jedem stromabwärts gelegenen Auslassbrunnen definiert die treibende Kraft für den druckgetriebenen Durchfluss, um die Durchflussraten durch die Geräte zu quantifizieren. Eine 25-Gauge-Nadel mit stumpfem Ende wird verwendet, um in regelmäßigen Abständen Proben aus den nachgelagerten Bohrlöchern zu entnehmen. Zum Beispiel entnehmen wir alle 15 bis 20 Minuten Proben und notieren sorgfältig die tatsächlich verstrichene Zeit zwischen den Proben.

Das Gewicht der Spritze wird vor und nach der Probenahme auf einer Analysenwaage aufgezeichnet. Das Gesamtvolumen in Abhängigkeit von der Gesamtzeit wird grafisch dargestellt, wobei die Steigung dem durchschnittlichen Massendurchfluss entspricht. Der große Querschnitt des Einlassbeckens im Vergleich zu den Auslassbrunnen trägt dazu bei, dass sich die Durchflussraten nicht signifikant ändern, wenn sich die Flüssigkeit durch die Geräte bewegt. Plottet das gemessene Volumen auf der Y-Achse im Vergleich zur Probenzeit auf der x-Achse.

In einem einfachen Grafikprogramm wie Excel zur Ermittlung der Steigung der Linie wird die Steigung für den durchschnittlichen Volumenstrom verwendet. Eine verdünnte Lösung aus drei mikromolaren fluoreszierenden Latexkügelchen mit Carboxy-, YG- und glatten YG-Oberflächen wird verwendet, um die Strömung zu visualisieren und Oberflächenwechselwirkungen zu untersuchen. Zunächst wird eine Lösung von Kügelchen in entionisiertem Wasser mit einer Konzentration von 0,01 % Feststoffen hergestellt.

Die Lösung wird in die vorgelagerten Bohrlöcher gegeben und das Durchflussmodul wieder an zu angebracht. Die Strömung der Kügelchen wird über einen Zeitraum von einer Stunde visualisiert und etwa alle 10 Minuten auf einem Zeiss AIOt 25 Fluoreszenzmikroskop aufgezeichnet, das mit einer MITx BCEB 0 1 3 U Monochromkamera ausgestattet ist. Einzelne Bilder werden in schneller Folge aufgenommen und mit einer Software wie Image J mit Fluoreszenzbeleuchtung und Durchlichtbeleuchtung zu Filmen zusammengefügt.

Die Perlen und Strukturen sind beide sichtbar. Wenn das Durchlicht blockiert wird, sind nur die hellen fluoreszierenden Kügelchen sichtbar. Stationäre Perlen, die entlang der Unterseite abgelagert oder an den Kollektoren befestigt sind, sind im gesamten Gerät sichtbar.

Für Experimente mit lebenden Bakterien wird eine Kultur wie Vibrio-Spezies hergestellt, ein nicht-pathogenes grün fluoreszierendes Protein, das das Bakterium exprimiert. Zunächst wird eine Stammkultur aus dem freien Tieflager entnommen. Ein Kolben mit sterilem LB-Wachstumsmedium wird mit der Stammkultur beimpft.

Unter Verwendung einer Einweg-Impföse wird der Kolben über Nacht unter Schütteln inkubiert, um eine stationäre Phasenkultur mit einer Konzentration von etwa 10 bis neun Zellen pro Milliliter zu erhalten. Je nach Anwendung kann die Ausgangskonzentration von Bakterien genauer quantifiziert werden. Es wird ein mikrofluidisches Gerät hergestellt, das mit sterilem Puffer gefüllt ist.

Dann wird die sterile Flüssigkeit in den vorgeschalteten Vertiefungen entleert und durch 20 Mikroliter der Bakterienkultur ersetzt. Mit einer Pipette werden die Bakterien durch sanftes Ansaugen mit einer Spritze an den Ausgangsvertiefungen in das Gerät ausgesät. Nach der Inkubation kann die Menge der Bakterien in den Vertiefungen bestimmt werden, indem die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung nach der Besiedlung quantifiziert wird. Die vorgeschaltete Einlaufbohrung wird wie bisher geleert und durch einen Puffer ersetzt, der mit 25 Teilen pro Tausend Salzen gespült wird.

Künstliches Meerwasser, sanfter Druck wird mit einer Spritze auf die vorgeschalteten Bohrlöcher ausgeübt und die einzelnen Durchflusszellen mit 20 bis 40 Mikrolitern der Pufferlösung gespült. Dies ist etwa das 100- bis 200-fache des geringen Volumens des mikrofluidischen Bodenanteils der Durchflusszelle nach der ersten Spülung. Eine langfristige Perfusion von Bakterien durch die porösen Medien wird durch den Einsatz des Strömungsmoduls genau wie zuvor gezeigt erreicht.

Fluoreszenz- und Weißlichtbilder des Bakterienwachstums und -transports können im Zeitverlauf gemessen werden. In diesem Experiment werden Bilder alle 15 bis 20 Stunden über einen Zeitraum von sieben Tagen mit einer fünffarbigen gekühlten CCD-Kamera von Q Imaging Ink aufgenommen. Unsere Geräte können auch verwendet werden, um die Auswirkungen der physischen Lebensraumstruktur auf die Bereitstellung von Zuflucht für Bakterien vor der Prädation durch Protozoen zu untersuchen. Gesehen.

Hier sind Bakterien in einer mikroporösen Durchflusszelle zu sehen, wobei die viel größeren Flimmertierchen eulo im Gerät sichtbar sind und Bakterien abstreifen. Bei der Analyse der Flüssigkeitsströmung in der mikrofluidischen Vorrichtung stellen wir fest, dass die durchschnittliche Durchflussrate bei einer Förderhöhe von 40 Millimetern 0,71 Mikroliter pro Minute beträgt. Durch die Erhöhung der Druckhöhe auf 60 Millimeter stieg die Durchflussmenge proportional auf 1,04 Mikroliter pro Minute.

Bei der Verwendung von Kügelchen mit unterschiedlichen Oberflächenchemien im Gerät beobachten wir eine größere Anhäufung von uncarboxylierten Kügelchen an den Geräteoberflächen. Während Kügelchen mit einem Durchmesser von sechs bis 10 Millimetern viel wahrscheinlicher in den kleineren Porenöffnungen mitgerissen wurden. Schnellere Durchflussraten, die durch einen höheren hydrostatischen Druck verursacht wurden, führten zu einer verringerten Bead-Retention und -Mitnahme, wie man es bei der Analyse des Bakterienwachstums im eco chipp Mikrofluidik-Gerät erwarten würde.

Wir stellen die qualitativen Unterschiede in der Bildintensität in verschiedenen Bereichen des Geräts fest. Die Fluoreszenzintensität kann als Proxy für die mikrobielle Biomasse im Kanal quantifiziert werden. In laufenden Experimenten beobachten wir, dass die kontinuierlichen Scherkräfte bei geringer Strömung eine bakterielle Aggregation und Schwarmbildung zu verursachen scheinen, wie in diesen Bildern zu sehen ist. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man einfache mikrofluidische Geräte erstellt und verwendet, um den Partikelmaßstab zu messen, den Kollisionstransport durch poröse Medien zu verhindern oder mikrobielle Wechselwirkungen in mikrostrukturierten Lebensräumen zu untersuchen.

Bei der Durchführung von Studien mit Durchflusszellen ist es wichtig, den Auftrieb der Kügelchen und die Oberflächenchemie der Kolloide und Kollektoren zu berücksichtigen. Beim Herunterskalieren auf den mikrofluidischen Bereich können Oberflächeneffekte die beobachteten Phänomene dominieren. Praktisch jede physikalische Struktur kann in das Design von mikrofluidischen Durchflusszellen integriert werden.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.