Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Wir zeigen, dass mithilfe von Eco-Chip-Geräten die physikalischen Strukturen und Druckhöhen konstant gehalten oder variiert werden können. Während systematisch der Einfluss der Oberflächenchemie, der Fluideigenschaften oder der Eigenschaften der Partikel beziehungsweise Mikroben durch Transportsversuche unter Verwendung eines nicht-pathogenen, grün fluoreszierendes Protein exprimierenden VIO-Bakterienstamms untersucht wird, verdeutlichen wir die Bedeutung der Habitatsstruktur, der Strömungsbedingungen und der Inokulumgröße für grundlegende Transportphänomene. Mikrofluidische Software bietet einen eindrucksvollen Einblick in eine verborgene Welt.

Hallo, ich bin Dimitri Marker vom Vanderbilt-Institut für integrative Biosystem-Restaurierungsausbildung an der Vanderbilt-Universität. Und ich bin David Schafer, Entwicklungsingenieur hier bei den Viro-Laboratorien. Hallo, ich bin Leslie Sho aus der Abteilung für Chemische, Material- und Biomolekulare Verfahrenstechnik im Zentrum für Umweltwissenschaften und Umwelttechnik an der Universität von Connecticut, und ich bin auch Dicot aus Zebra.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung modularer mikrofluidischer Habitat-Arrays für grundlegende Forschungsvorhaben in Umweltwissenschaft und Ingenieurwesen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Auswirkungen von mikrometergroßen Strukturen auf mikrobielle Transportwechselwirkungen in porösen Medien zu untersuchen. Beginnen wir also.

Der erste Schritt bei der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts besteht darin, ein zweidimensionales Layout des Geräts in einem computergestützten Zeichenprogramm oder CAD-Programm zu erstellen. Wir haben AutoCAD verwendet, aber es sind auch andere Zeichenprogramme verfügbar, wie beispielsweise Clue in oder CorelDRAW. Die Software ermöglicht es dem Konstrukteur, physische Strukturen innerhalb eines makroskopischen Felds treu zu reproduzieren, während einzelne Strukturelemente mit einer Auflösung von weniger als fünf Mikrometern definiert werden.

Aus der CAD-Zeichnung wird eine Fotomaske erstellt. Wir verwenden eine Chrommaske, die von Advanced Reproductions Corporation am nördlichen Ende von Massachusetts hergestellt wird. Die nächsten mehreren Schritte zur Herstellung des mikrofluidischen Geräts finden in einem Reinraum statt, um einen Master zu erzeugen.

Ein sauberer Siliziumwafer wird in einem Spin-Beschichter mit Fotolack beschichtet. Zunächst wird der Wafer auf der Plattform des Spin-Beschichters befestigt und einige Gramm SU 8 20 25 Fotolack werden in die Mitte des Wafers gegossen. Anschließend wird der Wafer 15 Sekunden lang mit 500 U/min für einen ersten Verteilzyklus rotiert, gefolgt von einem 35 Sekunden dauernden Dünnbeschichtungszyklus mit 4.000 U/min.

Nach dem Beschleunigen wird das Wafer 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius auf eine Heizplatte gestellt, um überschüssiges Lösungsmittel zu verflüchtigen. Der letzte Schritt bei der Vorbereitung des Wafers besteht darin, den Randtropfen zu entfernen. Dies erfolgt, indem das Wafer zurück in den Spin-Codierer gebracht und ein gleichmäßiger Strom von SUA-Randschicht-Entferner an den äußeren Rand des beschichteten Wafers appliziert wird.

Der nächste Schritt besteht darin, den Fotolack durch selektive Bestrahlung mit UV-Licht zu strukturieren. Zunächst wird die beschichtete Wafer auf eine ebene Oberfläche gelegt und die Chrommaske direkt darauf platziert. Rubylith-Rotabdeckfolie verhindert die Übertragung von Mustern außerhalb des gewünschten Bereichs.

Anschließend wird eine Dosis von 300 Millijoule pro Quadratzentimeter UV-Licht mithilfe eines Spotbelichtungssystems durch die Maske auf das beschichtete Wafer übertragen. Abschließend wird das Wafer 15 Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzt, um die durch Licht belichteten Bereiche des Photoresists zu vernetzen und sie unlöslich zu machen. Der letzte Schritt bei der Herstellung des Masters besteht darin, die nicht vernetzten Bereiche des Photoresists zu entfernen, wodurch erhabene Reliefstrukturen zurückbleiben.

Zunächst wird der Wafer erneut zum Spin-Beschichter zurückgebracht und mit der Entwicklerlösung bedeckt. Die Entwicklerlösung verbleibt etwa fünf Minuten auf dem beschichteten Wafer und wird anschließend abgeschleudert, wodurch ein deutlich sichtbares Muster auf dem Wafer entsteht. Eventuell verbleibende Rückstände werden entfernt, indem Isopropylalkohol auf den rotierenden Wafer gesprüht wird.

Für diesen Schritt verwenden wir eine Schleudergeschwindigkeit von 2200 U/min für etwa fünf bis 10 Sekunden. Abschließend wird der fertige Master mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet und bis zur Verwendung zum Gießen eines Geräts in einer Schale aufbewahrt. Wir stellen mikrofluidische Geräte unter Verwendung des Silikonelastomers Polymethylalans her.

Zunächst werden das Grundmaterial und das Härtemittel im Gewichtsverhältnis 10 zu 1 in einen Plastikbecher gegeben. Anschließend wird das Gemisch mit einem Thinky AR 100 Mischgerät entgast.

Nach Abschluss des Zyklus wird flüssiges PDMS gleichmäßig über den Master gegossen. Die Schale mit dem Master und dem ungehärteten PDMS wird anschließend zur Entgasung in eine Vakuumkammer gegeben. Die Polymerblasen treten nahezu sofort auf.

Das Entgasen wird fortgesetzt, bis alle Blasen verschwunden sind. Die Schale wird für mindestens vier Stunden in einen ebenerdigen Ofen bei 65 Grad Celsius gestellt, um die vollständige Vernetzung des Polymers zu ermöglichen. Anschließend wird das ausgehärtete PDMS vorsichtig vom wiederverwendbaren Master abgelöst.

Die ersten vier Kanten werden mithilfe eines Skalpells deutlich außerhalb des strukturierten Bereichs geschnitten, das Gerät wird anschließend mit einer Pinzette von der strukturierten Waferplatte abgezogen. Die Kanten des Geräts können bei Bedarf mit einer Schere nachgeschnitten werden. Ein Teilabschnitt des Geräts kann von dem übrigen geformten PDMS-Gerät abgetrennt werden.

Anschließend werden Zugangsöffnungen durch das PDMS gestanzt. Wir verwenden Biopsiestanzen, die in mehreren verschiedenen Größen erhältlich sind und auf einem kleinen Arbor montiert sind. Die PDMS-Kerne werden mit einer Pinzette entfernt.

Schließlich wird das zugeschnittene und perforierte Gerät mit Isopropylalkohol und einem mit Polypropylen bespitzten Schaumstofftupfer gereinigt. Das Gerät wird mit Stickstoff getrocknet und anschließend in den Ofen gegeben, um alle Spuren des Lösungsmittels zu entfernen. Der letzte Schritt bei der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts ist das Verbinden des PDMS mit einem Glasobjektträger als Substrat, gefolgt vom ersten Befüllen mit Flüssigkeit.

Das PDMS-Gerät und ein Objektträger werden mit der zu verbindenden Oberfläche nach oben in einen Plasma-Reiniger eingelegt. In diesem Experiment verwenden wir einen PDC-32-G-Herrick-Plasma-Reiniger. Sobald das Vakuum hergestellt ist und das blauviolette Plasma sichtbar wird, wird ein Timer auf 30 Sekunden gestellt.

Der Plasmagenerator wird abgeschaltet. Die Kammer wird wieder unter Druck gesetzt, und das Gerät sowie der Schieber werden aus der Kammer entnommen, wobei die Bonding-Oberflächen in Kontakt gebracht werden. Beim Entfernen der aktivierten Bauteile aus der Kammer ist es wichtig, schnell vorzugehen, damit die Oberflächen aktiviert bleiben.

Sanfter Druck hilft, eine gute Verbindung sicherzustellen. Die Qualität der Verbindung wird überprüft, indem mit einer Pinzette an einer Ecke gezogen wird. Das hydrophile Innere kann anschließend leicht mit einer wässrigen Lösung wie Puffermedium oder deionisiertem Wasser gefüllt werden.

Wasserflüssigkeit wird in jede Quellmulde und durch die entsprechende mikroporöse Durchflusszelle gegeben. Sobald alle Kammern gefüllt sind, wird eine dünne Schicht gehärtetes PDMS über das gesamte Gerät gelegt, um Verdunstung zu verlangsamen und Sterilität aufrechtzuerhalten. Um den druckgesteuerten Durchfluss im Gerät zu kalibrieren, füllen Sie die mikrostrukturierten Durchflusszellen zunächst mit entionisiertem Wasser, setzen Sie ein Durchflussmodul auf, das als Flüssigkeitszufuhrinterface und steriles Siegel auf der Oberseite des Geräts dient.

Dieses Durchflussmodul kann allein verwendet oder mit einem externen Flüssigkeitsbehälter wie einer Plastikspritze verbunden werden. Verbinden Sie einen Flüssigkeitsbehälter, beispielsweise eine Plastikspritze oder das Durchflussmodul, mit dem Einlassstrom. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeitshöhe im Behälter über der Höhe des Auslassstroms bleibt.

Der Höhenunterschied zwischen dem oberstromigen Reservoir und jedem unterstromigen Auslassbrunnen definiert die treibende Kraft für den druckgetriebenen Fluss, um die Durchflussraten durch die Vorrichtungen zu quantifizieren. Eine stumpfe Nadel mit 25 Gauge wird verwendet, um in regelmäßigen Abständen Proben aus den unterstromigen Brunnern zu entnehmen. Beispielsweise sammeln wir alle 15 bis 20 Minuten Proben, wobei wir sorgfältig die tatsächliche verstrichene Zeit zwischen den Proben notieren.

Das Gewicht der Spritze wird vor und nach der Probenahme auf einer Analysenwaage erfasst. Das aggregierte Volumen wird über der aggregierten Zeit aufgetragen, wobei die Steigung der durchschnittliche Massenstrom entspricht. Der große Querschnitt des Einlassreservoirs im Vergleich zu den Auslassöffnungen trägt dazu bei, zu verhindern, dass sich die Durchflussraten signifikant ändern, während die Flüssigkeit durch die Vorrichtungen strömt. Tragen Sie das entnommene Volumen auf der Y-Achse über der Probenahmezeit auf der X-Achse auf.

In einem einfachen Diagrammprogramm wie Excel wird die Steigung der Geraden ermittelt, wobei die Steigung für die durchschnittliche volumetrische Durchflussrate verwendet wird. Eine verdünnte Lösung aus dreimikromolaren fluoreszierenden Latexkügelchen mit carboxy-, YG- und unbeschichteten YG-Oberflächen wird verwendet, um die Strömung sichtbar zu machen und Oberflächenwechselwirkungen zu untersuchen. Zunächst wird eine Kügelchenlösung in entionisiertem Wasser mit einer Konzentration von 0,01 % Feststoff hergestellt.

Die Lösung wird in die stromaufwärts gelegenen Vertiefungen gegeben, und das Durchflussmodul wird wieder an zu angebracht. Der Fluss der Beads wird über einen Zeitraum von einer Stunde verfolgt und etwa alle 10 Minuten mit einem fluoreszierenden Zeiss AIOt 25-Mikroskop aufgezeichnet, das mit einer monochromen MITx BCEB 0 1 3 U-Kamera ausgestattet ist. Einzelne Bilder werden in schneller Abfolge aufgenommen und mithilfe einer Software wie Image J zu Filmen zusammengefügt, wobei Fluoreszenzbeleuchtung und Durchlichtbeleuchtung verwendet werden.

Die Kügelchen und Strukturen sind beide sichtbar. Wenn das durchgehende Licht blockiert ist, sind nur die hell leuchtenden fluoreszierenden Kügelchen sichtbar. Stationäre Kügelchen, die entlang der Unterseite abgelagert oder an den Sammlern befestigt sind, sind im gesamten Gerät erkennbar.

Für Experimente mit lebenden Bakterien wird eine Kultur wie eine Vibrio-Art, ein nicht-pathogenes, grün fluoreszierendes Protein exprimierendes Bakterium, vorbereitet. Zunächst wird eine Stammkultur aus der Tiefkühlhaltung entnommen. Ein Kolben mit sterilen LB-Wachstumsmedien wird mit der Stammkultur beimpft.

Unter Verwendung einer Einweg-Inokulationsöse wird der Kolben über Nacht unter Schütteln inkubiert, um eine Kultur in der stationären Phase mit einer Konzentration von etwa 10^9 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Je nach Anwendung kann die Anfangskonzentration der Bakterien genauer quantifiziert werden. Eine mikrofluidische Vorrichtung, die mit steriler Pufferlösung gefüllt ist, wird vorbereitet.

Dann wird die sterile Flüssigkeit in den stromaufwärts gelegenen Vertiefungen entleert und durch 20 Mikroliter Bakterienkultur ersetzt. Mithilfe einer Pipette werden die Bakterien unter sanfter Absaugung mit einer Spritze an den Ausgangsvertiefungen in das Gerät eingeimpft. Nach der Inkubation kann die Menge der Bakterien in den Vertiefungen bestimmt werden, indem die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung nach der Besiedlung quantifiziert wird. Die stromaufwärts gelegene Zulaufvertiefung wird wie zuvor entleert und durch Puffer ersetzt, der mit 25 Teilen pro Tausend Salzen gespült wurde.

Künstliches Meerwasser wird mit sanftem Druck auf die Upstream-Vertiefungen aufgebracht, wobei einzelne Flusszellen mit 20 bis 40 Mikrolitern der Pufferlösung durch eine Spritze gespült werden. Dies entspricht etwa dem 100- bis 200-fachen Volumen des mikrofluidischen Bodenabschnitts der Flusszelle nach dem anfänglichen Spülvorgang. Die Langzeit-Perfusion von Bakterien durch das poröse Medium wird mithilfe des Flussmoduls genau wie zuvor gezeigt erreicht.

Fluoreszierende und Weißlichtbilder des bakteriellen Wachstums und Transports können über die Zeit gemessen werden. In diesem Experiment werden alle 15 bis 20 Stunden über einen Zeitraum von sieben Tagen Bilder mit einer farbigen, gekühlten CCD-Kamera der Firma Q imaging ink aufgenommen. Unsere Vorrichtungen können auch verwendet werden, um die Auswirkungen der physikalischen Habitatstruktur darauf zu untersuchen, wie Bakterien vor der Prädation durch Protozoen Schutz finden.

Hier sind Bakterien in einer mikroporösen Durchflusszelle zu sehen, wobei die deutlich größeren cilierten Protozoen Eulo im Gerät sichtbar sind, die von den Bakterien fressen. Bei der Analyse des Flüssigkeitsstroms in der mikrofluidischen Vorrichtung ergab sich eine durchschnittliche Durchflussrate von 0,71 Mikrolitern pro Minute bei einem Druckgefälle von 40 Millimetern. Durch Erhöhung des Druckgefälles auf 60 Millimeter stieg die Durchflussrate proportional auf 1,04 Mikroliter pro Minute an.

Bei Verwendung von Kügelchen mit verschiedenen Oberflächenchemien in der Vorrichtung beobachten wir eine stärkere Ansammlung uncarboxylierter Kügelchen an den Oberflächen der Vorrichtung. Kügelchen mit einem Durchmesser von sechs bis zehn Millimetern wurden hingegen viel eher in den kleineren Porenöffnungen eingefangen. Höhere Flussraten, verursacht durch einen größeren hydrostatischen Druck, führten zu einer verminderten Rückhaltung und Einfangung der Kügelchen, wie es bei der Analyse des bakteriellen Wachstums in der Eco-Chipp-Mikrofluidikvorrichtung zu erwarten ist.

Wir weisen auf die qualitativen Unterschiede der Bildintensität in verschiedenen Sektoren des Geräts hin. Die Fluoreszenzintensität kann als Proxy für die mikrobielle Biomasse im Kanal quantifiziert werden. In laufenden Experimenten beobachten wir, dass die kontinuierlichen Scherkräfte unter niedrigen Durchflussbedingungen eine bakterielle Aggregation und Schwarmbildung hervorzurufen scheinen, wie in diesen Bildern ersichtlich ist. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man einfache mikrofluidische Geräte herstellt und verwendet, um Partikelgrößen zu messen, Kollisions-Transport durch poröse Medien zu untersuchen oder mikrobielle Wechselwirkungen in mikrostrukturierten Lebensräumen zu analysieren.

Bei der Durchführung von Studien mit Flusszellen ist es wichtig, die Auftriebskraft der Partikel sowie die Oberflächenchemie der Kolloide und Sammler zu berücksichtigen. Beim Übergang in den mikrofluidischen Bereich können Oberflächeneffekte die beobachteten Phänomene dominieren. Praktisch jede physikalische Struktur kann in die Konstruktion mikrofluidischer Flusszellen integriert werden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.