Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen
22. April 2010
Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Stimulation und Färbung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder PBMC. Für die mehrfarbige Durchflusszytometrie-Analyse werden Alec Watts von pbmc, die aus Vollblut isoliert wurden, in Gewebekulturplatten gegeben. Zellen werden chemisch oder biologisch stimuliert, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Nach der Stimulation wird ein Cocktail aus Antikörpern zugegeben, um Zelltypen anhand von exprimierten Oberflächenmarkern zu identifizieren. Die Zellen werden dann durchdrungen und ein anderer Cocktail von Antikörpern wird hinzugefügt, um die Expression von intrazellulären Zytokinen nachzuweisen, die Zellen werden dann anhand von Fakten analysiert, um die Zytokinprofile für bestimmte Untergruppen von pbmc zu bestimmen. Hallo, ich bin Amy Courtney aus dem Labor von Dr. Jagan SAS in der Abteilung für Immunologie am MB Anderson Cancer Center der University of Texas
.Hallo, ich bin Hong sie auch aus dem Labor. Heute zeigen wir Ihnen eine multizytometrische Analyse von T-Zell-Antworten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zelluläre Immunantworten in Reus Maca zu untersuchen.
Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie dieses Protokoll mit einem Hämozytometer, um die lebensfähigen Zellzahlen von pbmc aus Reuss Maca mit der Trian Blue Dye-Ausschlussmethode zu bestimmen. Arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube reus.
Suspendieren Sie die Zellen in vollständigem Medium in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter für eine unspezifische Stimulation bei 100 Mikrolitern der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Fügen Sie dann 100 Mikroliter PMA- und CIN-haltiges Medium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 0,2 Milliliter mit einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter PMA und 500 Nanogramm pro Milliliter CIN für negative Kontrollvertiefungen zu bringen, und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter des vollständigen Mediums allein hinzu. Inkubieren Sie die Zellen nach 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius in der befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid.
Ein Felden A in die Kultur bei einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter geben und weitere 4,5 Stunden inkubieren. Das Felden A wird zu Trapp-Zytokinen in der Gold-G-Apparatur hinzugefügt, um die Sichtbarkeit durch Immunfärbung zu erhöhen, gefolgt von der Stimulationszentrifuge, um das Medium zu entfernen, und anschließendem Waschen durch Zugabe von 200 Mikrolitern Kaltflusswaschung, Puffer und Zentrifuge bei niedriger Geschwindigkeit. Wiederholen Sie diesen Waschgang und senden Sie dann erneut 50 Mikroliter Flow-Wash-Puffer ein.
Die Zellen sind nun bereit, gefärbt zu werden, um Oberflächenmarker in jede Vertiefung der resuspendierten Zellen zu exprimieren. Fügen Sie einen Mikroliter lebenden, tot-fixierbaren Aqua-Fluoreszenz-Reaktivfarbstoff hinzu, der gemäß den Anweisungen des Herstellers und S hergestellt wurde. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 30 Minuten, während die Zellen inkubieren.
Bereiten Sie die Färbelösungen vor, die für Fakten in Mikroröhrchen verwendet werden. Bereiten Sie zunächst einen stehenden Cocktail zu, der die folgenden Punkte angemessen enthält. Titrierte fluoreszenzmarkierte monoklonale Antikörper, anti CD drei PE SCI sieben, anti CD acht Alexa 700 anti CD 28 pro CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC und anti CD vier Pacific Blue Inflow Wash Buffer.
Bereiten Sie als Nächstes Kompensationskontrollen vor, die zur Bestimmung der Spillover-Koeffizienten jedes einzelnen Farbstoffs in andere Detektoren verwendet werden, indem ein Röhrchen jedes fluoreszierend konjugierten Antikörpers einzeln als einfarbiger Farbstoff präpariert wird. Bereiten Sie abschließend Fluoreszenz-Minus- oder FMO-Färbungen vor, indem Sie alle Reagenzien bis auf das interessierende Reagenzien kombinieren. Dies wird verwendet, um die Grenze zwischen einer positiven und einer negativen Population zu bestimmen, indem Autofluoreszenzwerte und Daten in vollständig gefärbten Proben dupliziert werden.
Nachdem die Zellen im lebenden toten Fleck inkubiert wurden, waschen Sie sie einmal mit Kaltfluss-Waschpuffer, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und aspirieren Sie den Waschpuffer. Fügen Sie dann die vorbereiteten Färbelösungen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 30 Minuten.
Waschen Sie die gefärbten Zellen mit Kaltfluss-Waschpuffer, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter BD-Fixationspermeationslösung für mindestens 10 Minuten hinzu. Lagern Sie die Zellen bis zu 24 Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie verwendet werden, oder fahren Sie mit der Markierung der intrazellulären Zytokine fort, um intrazelluläre Zytokine zu markieren.
Zuerst permieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern einer X Perm. Waschpuffer 10 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren, während die Zellen inkubieren. Bereiten Sie die Färbeantikörper, Kompensationskontrollen und FMO-Kontrollen wie bisher in einem x perm Waschpuffer vor.
Nachdem die Zellen 10 Minuten lang inkubiert wurden, schleudern Sie nach unten und entfernen Sie den Waschpuffer mit einer x Dauerwelle. Fügen Sie die entsprechenden Färbeantikörper hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Zellen und Antikörper nach der Inkubation 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit der Permeationslösung. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in 1%Paraformaldehyd in DPBS suspendiert, um die Zellen zu fixieren. Lagern Sie die Zellen bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie bis zu 24 Stunden lang verwendet werden.
Sobald die Zellen gefärbt wurden, verwenden Sie ein LSR-Zwei-Durchfluss-Zytometer oder cyan ein DP-Durchflusszytometer, um Fakten durchzuführen. Analysieren Sie dann die Daten mit FlowJo oder einer ähnlichen Software. Die PBMC-Zusammensetzung in reuss Maca wurde mittels Faxanalyse bestimmt.
Diese Abbildung zeigt das Gating-Schema, das für die Analyse der verschiedenen T-Zell-Untergruppen eines repräsentativen Tieres verwendet wird. Die Lymphozyten wurden zunächst über Forward Scatter FSC versus Side Scatter SSC gated und dann wurden lebende Lymphozyten basierend auf SSC und AQUA negativer Population identifiziert. Die T-Zellen wurden dann durch die Zöliakie-3-Expression, die CD vier positiv, die CD acht negativ und die CD vier negativen CD acht positiven Populationen innerhalb der CD drei positiven T-Zellpopulationen identifiziert.
Die CD-4-positiven und die CD8-positiven T-Zellen wurden auf der Grundlage der CD-28- und CD-95-Expression als naive Zentralgedächtnis- und Effektor-Gedächtniszellen weiter in verschiedene Untergruppen unterschieden. Diese Abbildung zeigt die Interferon-Gamma- und IL-2-Produktion in Unstimulated und pma. CIN stimulierte Zöliakie, vier positive T-Zellen und Untergruppen.
Beachten Sie die unterschiedlichen Zytokinprofile, die durch die Stimulation hervorgerufen werden. In jeder Teilmenge. Wir zeigen Ihnen, wie Sie eine Multi-Durchflusszytometrie-Analyse von pbmc durchführen können.
Wenn Sie dieses Verfahren ausführen, ist es wichtig, daran zu denken, sowohl Steuerelemente für die Einzelfarbkompensation als auch für die Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerung einzurichten. Beide Kontrollen sind für die ordnungsgemäße Analyse von Durchflusszytometriedaten erforderlich. Weitere Informationen zur Auswahl von Kompensationskontrollen finden Sie in unserem schriftlichen Protokoll.
Bitte denken Sie auch daran, dass es bei der Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern wichtig ist, die Proben abzudecken, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Überblick
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Stimulation und Färbung von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) für die Mehrfarben-Fluoreszenzzytometrieanalyse. Die Studie konzentriert sich auf die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von CD4+ und CD8+ T-Zell-Subgruppen bei Rhesusaffen, einem Modell für die HIV/AIDS-Impfstoffforschung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Fluoreszenzzytometrie
- HIV/AIDS-Forschung
Hintergrund
- Rhesusaffen werden als Modell für die Untersuchung von HIV/AIDS verwendet.
- Das Verständnis von T-Zell-Subgruppen ist entscheidend für die Impfstoffentwicklung.
- Die Mehrfarben-Fluoreszenzzytometrie ermöglicht eine detaillierte Analyse von Immunzellen.
- PBMCs sind Schlüsselkomponenten bei der Untersuchung von Immunreaktionen.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Gesamt- und Gedächtnis-Subgruppen von T-Zellen.
- Nutzung der Mehrfarben-Fluoreszenzzytometrie für detailliertes Immunprofiling.
- Verbessertes Verständnis von Immunreaktionen im Kontext von HIV/AIDS.
Verwendete Methoden
- Isolierung von PBMC aus Vollblut.
- Chemische oder biologische Stimulation von PBMCs.
- Verwendung von Antikörper-Cocktails zur Identifizierung von Zelltypen und Oberflächenmarkern.
- Analyse von Zytokinprofilen mittels Fluoreszenzzytometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Stimulation und Färbung von PBMCs zur Analyse.
- Identifizierung spezifischer T-Zell-Subgruppen basierend auf Oberflächenmarkern.
- Charakterisierung der intrazellulären Zytokinexpression.
- Einblicke in Immunreaktionen, die für HIV/AIDS relevant sind.
Schlussfolgerungen
- Die Mehrfarben-Fluoreszenzzytometrie ist effektiv für die T-Zell-Analyse.
- Rhesusaffen liefern wertvolle Erkenntnisse für die HIV-Impfstoffforschung.
- Das Verständnis der T-Zell-Dynamik ist wesentlich für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Multicolor flow cytometry enables precise phenotypic and functional profiling of T-cell subsets in rhesus macaques, a critical preclinical model for HIV vaccine development. This approach supports target validation by quantifying cytokine-producing immune responses, informing go/no-go decisions in early discovery. The method enhances predictive confidence by linking antigen-specific stimulation to measurable intracellular cytokine outputs in defined memory populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring IFN-γ and IL-2 production in CD4+ and CD8+ T-cell subsets following stimulation.
- Operational Value: Provides qualitative and quantitative measures of intracellular cytokine expression to de-risk mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through sensitive detection of minor antigen-specific T-cell fractions in PBMC samples from vaccinated animals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing standardized staining and stimulation protocols for reproducible immune profiling.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through use of compensation controls and FMO controls to ensure accurate population gating.
- Scientific Value: Highlights screening readiness by enabling detection of cytokine profiles across naive, central memory, and effector memory T-cell subsets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by aligning intracellular cytokine measurements in rhesus macaques with HIV pathogenesis and vaccine-induced immune responses.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking PBMC stimulation outcomes to functional T-cell characterization.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by using cytokine production as a functional readout for vaccine immunogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within the discovery continuum from early immune profiling to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in infectious disease models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by quantifying cytokine production in specific T-cell subsets following PMA/ionomycin or antigen-specific stimulation.
- Screening: Describes assay readiness through standardized stimulation, surface and intracellular staining, and flow cytometric analysis of PBMC samples.
- Analytics: Highlights measurements such as IFN-γ and IL-2 production frequencies that enable comparison of immune responses across conditions and subsets.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking vaccine-induced T-cell responses in rhesus macaques to functional immune profiling relevant to HIV vaccine development.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal immune monitoring across vaccine candidates and adjuvant formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell-mediated immune responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multicolor flow cytometry assays for immune profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in vaccine development programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative cytokine profiles in preclinical models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in flow cytometry panel design, compensation, and gating strategy for multicolor immunophenotyping.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including flow cytometer (e.g., LSR II) and software (e.g., FlowJo) for high-dimensional data analysis.
- Cross-team standardization requirements for stimulation conditions, antibody titration, and control setup (single-color and FMO) across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of stimulation concentrations and incubation times for non-human primate PBMC.
- Practical limitations supported by source material: necessity of light protection for fluorescent antibodies and careful titration to minimize spillover in multicolor panels.
