Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Videoartikels ist es, Antworten auf die folgenden beiden Fragen zu geben. Erstens: Können Studien zu Proteininteraktionen zuverlässiger durchgeführt werden, indem der Anteil einer Proteinprobe gemessen wird, der tatsächlich in der Lage ist, an ein anderes Protein zu binden? Zweitens, wie kann uns die kinetische Analyse ein besseres Verständnis der Struktur- und Funktionsbeziehungen vermitteln?

Diesen beiden Fragen geht ein Experiment mit Corp X 100 nach, einem Instrument, das Proteininteraktionen in Echtzeit erkennt, ohne Markierungen zu verwenden. In diesem Experiment wird die Wechselwirkung von bovinem Cystatin B mit der Cystinprotease Papain untersucht, die Kristallstruktur der beiden Proteine in komplexen Punkten weist auf mehrere Reste hin, die an der Bindung an die Protease beteiligt sind, um zu bestimmen, wie jeder der interagierenden Reste die Cystatin-B-Papin-Interaktion beeinflusst. Mehrere Cystatin-B-Varianten werden durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt.

Bei solchen Experimenten besteht immer die Möglichkeit, dass rekombinante Proteine sich nicht richtig falten, aggregieren oder sich verschlechtern, was zu falschen und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führt. VIACORE X 100 ist in der Lage, den Anteil des Proteins zu bestimmen, der für die Bindung durch kalibrierfreie Konzentrationsanalyse, abgekürzt CFCA, zur Verfügung steht. Dieser Ansatz ermöglicht die Bestimmung der Konzentration von Proteinen mit beibehaltener Bindungsaktivität, auch wenn keine Kalibrierstandards verfügbar sind.

CFCA wird hier verwendet, um die Konzentration der Cystatin-B-Varianten zu bestimmen. Diese Daten werden dann als Input für die Bestimmung der Bindungskinetik der Cystatin-B-Varianten an Pepin verwendet, die ebenfalls mit BOR X 100 bewertet wird. Hallo, ich bin CLA gram von GE Healthcare in Schweden.

Heute zeigt Ihnen meine Kollegin Eva Pool, wie Sie eine Strukturfunktionsbeziehungsanalyse mit BOR X 100 durchführen können. Rekombinante Proteine können im Laufe der Zeit eine unsachgemäße Faltung oder lose Bin-Aktivität aufweisen, und dieses Verhalten kann mit Methoden, die auf der Gesamtkonzentrationsmessung beruhen, nicht nachgewiesen werden. Dies kann in der Folge zu fehlerhaften kinetischen Daten nach den Konzentrationsmessungen durch die kalibrierfreie Konzentrationsanalyse führen. Der B.A. Core X 100 wird verwendet, um die Kinetik und Affinität der Wechselwirkung von Cystatin-B-Varianten mit Pepane zu analysieren.

Diese Parameter geben einen Einblick in den Bindungsmechanismus. Wir beginnen mit einer kurzen Erklärung des Versuchsdesigns, also fangen wir an. Die Wechselwirkung zwischen Cystin, Protease, Papin und dem Inhibitor Cystatin B wird von hydrophoben Kontakten dominiert, wie die Kristallstruktur der beiden Proteine im Komplex zeigt.

Von der Inhibitorseite sind die Kontaktbereiche die N- und C-terminalen Ns und zwei Hairpin-Schleifen. In dieser Studie werden vier Mutanten untersucht, die jeweils die Cystein drei zur syrischen Mutation enthalten, die eingeführt wurde, um die Dimerisierung von Cystatin B zu verhindern. Basierend auf dem in der Kristallstruktur aufgedeckten Kontext wurde Leucin 73 zu Glycin, Histamin 75 zu Glycin und Tyrosin 97 zu Alanin verändert. Die beiden Glycin-Mutationen wurden eingeführt, um die Bedeutung der Seitenketten Histidin 75 und Leucin 73 für die Bindung an Pepin zu untersuchen, der Tyrosinrest wurde zu Alanin mutiert, um die Wechselwirkung zwischen dem C-Terminus von Cystatin B und Pepin zu untersuchen.

Die drei Doppelmutanten sowie die INE-Drei- bis Syrisch-Einzelmutante werden auf ihre Interaktion mit einer katalytisch inaktiven Variante von Papain S-Methylpopin getestet. Diese katalytisch inaktive Form des Proteus hat eine Methylgruppe, die an CYS 25 im aktiven Spalt gebunden ist. Der Einfachheit halber werden wir diese Variante im gesamten Protokoll Propan nennen.

CFCA beruht auf der Messung der Bindungsrate unter Bedingungen, bei denen die Rate durch die Diffusion von Analytmolekülen zur Oberfläche begrenzt ist. Dies wird durch eine hohe Immobilisierung des Liganden begünstigt. Legen Sie vor Beginn des Immobilisierungsvorgangs den in den Experimenten verwendeten HEPs-Puffer auf das linke Tablett und führen Sie beide Schläuche ein.

Stellen Sie auch eine leere Abfallflasche auf das rechte Tablett. Legen Sie dann einen neuen Sensor Gips fünf in das Gerät ein, das über die Core X 100-Software initialisiert wird, und klicken Sie auf dem Startbildschirm auf das Dock-Chip-Tool-Element. Klicken Sie in der Software auf Dokument starten.

Verwenden Sie als Nächstes den Immobilisierungsassistenten, um den Pape und die Immobilisierung einzurichten, indem Sie auf dem Startbildschirm auf die Kopplung an Zensur CM fünf abzielen, auf die Schaltfläche "Andere Optionen" klicken und dann "Assistenten" auswählen. Daraufhin wird ein Fenster mit den verfügbaren Assistenten angezeigt. Wählen Sie Stilllegung aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neu Unten rechts wird der erste Bildschirm des Immobilisierungsassistenten angezeigt, wobei die Zielkopplung an den Sensor Gips fünf die Standardeinstellung ist.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen unter Durchflusszelle zwei, um in der Flusszelle zwei zu immobilisieren. Die erste Durchflusszelle wird unverändert gelassen, um sie als Referenzfläche aus den drei unten verfügbaren Optionen zu verwenden. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kontaktzeit angeben auf der rechten Zielebene, ändert sich die Kontaktzeit, und geben Sie eine Kontaktzeit von 900 Sekunden an.

Geben Sie als Nächstes die Immobilisierungsparameter unter Auffangen der Molekül-Slash-Ligandenlösung ein. Hier kommt Papain ins Spiel. Klicken Sie dann auf Weiter.

Der nächste Bildschirm zeigt das Layout des Probenracks. Position eins hält et Ethanolamin, das verwendet wird, um den verbleibenden Wirkstoff nach der gezielten Kopplung des Liganden Papain an die Chipoberfläche zu deaktivieren. Setzen Sie die Ethanolaminlösung an Position eins in Position zwei ein.

Platzieren Sie den Liganden Papain Papain wird in einem Überschuss an Methylsulfat gelagert und auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in 10 Millimolar Natriumacetat-Puffer hingewiesen. pH 4,5 Rekonstituieren Sie die EDC- und NHS-Kupplungsreagenzien aus dem Amin-Kupplungskit mit einer doppelt destillierten Wasserpipette, 85 Mikroliter EDC in ein Fläschchen. Verschließen Sie es und platzieren Sie es in Position drei.

Verwenden Sie das gleiche Volumen für NHS an Position vier. Beachten Sie, dass die fünfte Datei verschlossen und leer sein sollte, damit das Instrument ED, C und NHS in dieser Datei mischen kann. Denken Sie auch daran, die Waschdatei in Position H2O mit frischem entionisiertem Wasser zu füllen.

Wenn das Rack gemäß der Gliederung auf dem Bildschirm gefüllt ist, klicken Sie auf Proben laden und legen Sie das Rack in das Gerät ein. Wenn das Rack geladen ist, klicken Sie auf Weiter. Bevor der Lauf gestartet wird, wird eine Checkliste angezeigt.

Stellen Sie sicher, dass alle Aufzählungspunkte erfüllt sind, wenn dies der Fall ist. Der Lauf wird durch Drücken der Starttaste gestartet. Der Lauf wird während der Ruhigstellung gestartet.

Die Daten werden in Echtzeit gesammelt. Zunächst werden die Kupplungsreagenzien injiziert. Als nächstes wird Pape an die Chipoberfläche gekoppelt und der Vorgang endet mit der Deaktivierung der verbleibenden aktiven Ester.

Nach dem Lauf wird in einem Dialogfenster das Ergebnis des Laufs zusammengefasst. In diesem Fenster wird der Immobilisierungsgrad angezeigt. Der gesamte Kopplungsvorgang sollte zu etwa 3000 HE immobilisiertem Papain führen.

Sobald Papain auf dem Sensorchip immobilisiert wurde, beginnen Sie mit der CFCA-Analyse, indem Sie die Cystatin-B-Mutantenproben auf eine Gesamtkonzentration von etwa 10 Nanomolar in mindestens 300 Mikrolitern verdünnen. Notieren Sie den Verdünnungsfaktor, da wir ihn später im Assay-Setup verwenden werden. Beginnen Sie damit, das Dialogfeld des Assistenten aufzurufen, wie im vorherigen Abschnitt im Abschnitt Konzentration des Assay-Ordners beschrieben.

Wählen Sie "Kalibrierung frei" und dann "Neu". Auf dem ersten Bildschirm des Assistenten wird die Injektionssequenz angezeigt. Die Einstellungen können unverändert bleiben, da hier der Sensorchip CM five und ein direkter Immobilisierungs-Assay-Ansatz verwendet werden.

Klicken Sie im nächsten Bildschirm auf Weiter. Lassen Sie die Kontrollkästchen "Prime" vor "Ausführen" und "Startzyklen ausführen" aktiviert. Lassen Sie außerdem die Standardanzahl der Startzyklen unverändert bei drei.

Geben Sie heaps buffer in den Namen des Lösungsfelds ein. Klicken Sie dann auf Weiter. Geben Sie im nächsten Bildschirm den Namen der Regenerationslösung ein, bei dem es sich um 20 Millimolare Natriumhydroxid handelt.

Lassen Sie die anderen Parameter unverändert. Klicken Sie auf Weiter, um die Beispieltabelle anzuzeigen. Richten Sie die Proben gemäß der Beispieltabelle ein.

Jede Zeile in der Beispieltabelle ergibt zwei Zyklen. Einer mit einer Durchflussmenge von 10 Mikrolitern pro Minute und einer mit 100 Mikrolitern pro Minute. Beginnen Sie den Lauf mit einem Leerzeichen.

Geben Sie dann den Namen Verdünnungsfaktor, Diffusionskoeffizient bei 20 Grad Celsius und Molekulargewicht ein. Für jede Mutante kann der Diffusionskoeffizient mit dem Webtool auf der Produktwebsite berechnet werden. Ein Link zu diesem Tool wird im Support-Navigator der Software bereitgestellt.

Da es empfohlen wird, jede Stichprobe auszuführen und zu duplizieren, kopieren Sie die gesamte Tabelle von der leeren Zeile bis zur letzten Stichprobe, und fügen Sie sie am Ende der Tabelle ein. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren. Auf dem nächsten Bildschirm wird das Probengestell angezeigt.

Platzieren Sie die Proben und Reagenzien gemäß dem von der Software vorgegebenen Layout in das Rack. Legen Sie das Rack in das Gerät ein, indem Sie die Taste zum Laden von Proben drücken. Klicken Sie dann auf Weiter.

Nach dem Laden der Proben wird ein Erinnerungsbildschirm mit einer Checkliste angezeigt. Stellen Sie sicher, dass Sie alles überprüfen, und drücken Sie dann Start. Die Daten werden während des Laufs in Echtzeit gesammelt.

Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, schließen Sie das Fenster, in dem die gesammelten Daten angezeigt werden. Beachten Sie, dass ein neues Ergebniselement im Hauptfenster angezeigt wurde. Um die Konzentrationen aus den Daten zu berechnen, wählen Sie das neue Ergebniselement aus und klicken Sie auf die Schaltfläche.

Evaluierung über Core X 100. Die Auswertesoftware wird gestartet und zeigt alle gesammelten Daten in der Symbolleiste an, wählen Sie Konzentrationsanalyse und dann Kalibrierung frei aus dem Menü. Wählen Sie im ersten Fenster die Daten aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen.

Scrollen Sie durch die Liste und durchlaufen Sie die Ansichtsliste, um die Daten für alle Beispiele anzuzeigen. Wenn Sie Daten ausschließen möchten, entfernen Sie das Häkchen aus der Liste. Klicken Sie auf Weiter, um die Berechnung zu starten.

Das CFCA-Interaktionsmodell wird automatisch an die experimentellen Daten angepasst, wenn die Anpassung abgeschlossen ist, und die Ergebnisse werden für jede Probe im Ergebnisfenster angegeben. Gehen Sie die Anpassungen für jedes Muster durch, indem Sie die entsprechende Zeile in der Tabelle auswählen. Die Spalte mit der Bezeichnung "Gemessene Konzentration" zeigt die Konzentration in der analysierten Probe an.

Die Konzentration in der Originalprobe wird anhand des zuvor eingegebenen Verdünnungsfaktors berechnet und in der Spalte berechnete Konzentration angezeigt. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Fertig, um das Ergebnis zu speichern. Nachdem wir nun die Konzentrationen der Proteine aus der CFCA-Analyse kennen, haben wir eine hervorragende Grundlage für unsere nachfolgenden kinetischen Messungen. Die kinetische Analyse wird uns nun helfen, die Bedeutung der wichtigsten Aminosäurereste für den Bindungsmechanismus zu verstehen.

wir mit einem Setup der kinetischen Analyse. Die kinetische Analyse beginnt mit dem Andocken eines neuen Sensorchips CM five an das Gerät im Startbildschirm. Wählen Sie diese Option, um einen Assay-Workflow für die Affinität der Kinetik zu erstellen.

In der oberen linken Ecke erscheint ein Dialogfenster, in dem Informationen über den Liganden eingegeben werden. Geben Sie den Namen papain in das Feld für den Ligandennamen ein und wählen Sie ein anderes Protein aus der Liste der Speziestypen aus. Wählen Sie dann die kovalente Immobilisierung des Liganden mit dem Sensorchip CM fünf aus den beiden vorgestellten alternativen Ligandenbindungsansätzen aus. Der empfohlene Assay-Arbeitsablauf ist nun auf der rechten Seite des Fensters dargestellt.

Es beginnt mit einem Immobilisierungsschritt, gefolgt von einem Assay-Schritt. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren. Speichern Sie den Assay-Workflow wie gewünscht, indem Sie einen Namen eingeben und auf Speichern klicken.

Die Software skizziert jetzt den Assay-Arbeitsablauf mit Schaltflächen, die jedem Schritt zugeordnet sind. Der erste Schritt bei der Vorbereitung der Sensoroberfläche besteht darin, einen Mobilisierungs-pH-Wert zu finden. Da dieser pH-Wert bekannt ist, drücken Sie im angezeigten Dialogfeld die Eingabetaste für den bekannten Wert.

Geben Sie den Puffernamen Acetat und pH 4,5 ein und wählen Sie Speichern. Der Assay-Workflow wird jetzt mit einem grünen Häkchen aktualisiert, um anzuzeigen, dass dieser Schritt abgeschlossen wurde. Jetzt ist es an der Zeit, die Ruhigstellung zu machen, indem Sie die Run-Taste im immobilisierten Schritt drücken.

Dadurch wird derselbe Assistent angezeigt, der für Propan und Immobilisierung für die CFCA-Analyse verwendet wurde. Die Immobilisierung von Papin für die kinetische Analyse wird hier auf die gleiche Weise eingerichtet, mit dem Unterschied, dass eine stärker verdünnte Lösung für weniger Zeit injiziert wird. Dies dient dazu, weniger Papin zu immobilisieren, um Situationen zu vermeiden, in denen die Bindungsraten der Cystatin-Mutanten durch Diffusion begrenzt sind, so dass kinetische Daten isoliert gemessen werden können. Da der Name des Liganden und der pH-Wert der Immobilisierung in den vorherigen Schritten des Assay-Workflows eingegeben wurden, sind diese hier beide voreingestellt.

Die einzige erforderliche Aktualisierung beträgt 50 Sekunden für die Kontaktzeit. Die Ruhigstellung verläuft dann wie zuvor gezeigt. Die erwartete Bindung nach der Immobilisierung beträgt 50 R ru.

Ein grünes Häkchen neben der Schaltfläche Ausführen zeigt an, dass die Immobilisierung abgeschlossen ist. Geben Sie anschließend im Schritt die Regenerierungslösung im Workflow ein. Suchen Sie die Regenerierungsbedingungen, indem Sie im angezeigten Dialogfeld auf Bekannte Werte eingeben klicken.

Geben Sie die Regenerationslösung und die Kontaktzeit ein. Klicken Sie dann auf Speichern. Nachdem der Ligand immobilisiert und die Regenerationsbedingungen eingegeben wurden, ist alles so eingestellt, dass Kinetikdaten in der Affinitätsassay-Box für den Lauf generiert werden. Drücken Sie die Lauftaste, den ersten Schritt in der Kinetik.

Der Affinitätsassistent skizziert die Einspritzsequenz jedes Zyklus für die Einzelzykluskinetik, die hier verwendet wird, es besteht keine Notwendigkeit, etwas zu ändern. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren. Behalten Sie im nächsten Schritt die Standardeinstellungen bei, die das Ansaugen des Systems vor dem Ausführen anzeigen.

Wählen Sie aus, ob Sie einen Startzyklus ausführen möchten, um die Chipoberfläche auszugleichen. Definieren Sie als Nächstes die Injektionsparameter für die Probe. Da die Regenerierungslösung bereits früher angegeben wurde und die Einstellung vordefiniert ist, ist es nicht erforderlich, die Parameter im Bild zu ändern.

Klicken Sie auf Weiter. Geben Sie abschließend die Beispiele an. Geben Sie für jede Mutantenvariante zwei Zeilen ein, eine leere und die andere mit Stichprobe.

Ein Blindzyklus wird angezeigt, indem der höchste Konzentrationsparameter auf Null gesetzt wird. Zwei. Cystatin B-Varianten können in jedem Lauf eingebaut werden. Geben Sie für jede Mutante das Molekulargewicht, die höchste Konzentration und den Verdünnungsfaktor ein und drücken Sie auf Weiter.

Im folgenden Bildschirm wird das Probengestell skizziert. Bereiten Sie eine Verdünnungsserie der Proteinproben vor und setzen Sie die Fläschchen mit den Kappen in das Gestell ein. Wie auf dem Bildschirm dargestellt, wird ein Fläschchen mit Puffer in Position 13 und ein Fläschchen mit der Regenerationslösung in Position 14 platziert. Achten Sie darauf, die Wasserposition mit frischem Wasser zu füllen.

Platzieren Sie das Gestell in der Maschine und laden Sie die Proben, indem Sie auf die Schaltfläche Proben laden klicken und auf Weiter klicken. Führen Sie wie zuvor eine abschließende Überprüfung durch, bevor Sie mit dem Ausführen des Experiments fortfahren, indem Sie auf Start drücken Interaktionsdaten werden in Echtzeit angezeigt. Wenn der Lauf beendet ist, fahren Sie sofort mit der Ausführung der verbleibenden Cystatin-B-Varianten fort, wie gerade gezeigt.

Wenn die verbleibenden Cystatin-B-Varianten nacheinander ausgeführt werden, lassen Sie den Prime-Schritt und den Startzyklus aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen im Schritt deaktivieren. Wenn jeder Lauf abgeschlossen ist, kann über den Link auf die Daten zugegriffen werden. Alle Ergebnisse im Assay-Workflow.

Es erscheint ein Dialogfenster mit allen Ergebnissen, die innerhalb dieses Workflows generiert wurden. Um die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten zu berechnen, wählen Sie das auszuwertende Ergebnis aus und drücken Sie Auswerten, bis die Core X 100-Auswertesoftware erneut gestartet wird und alle kollektiven Daten anzeigt. Wählen Sie Kinetik-Affinität aus dem Symbolleistenmenü aus.

Im ersten Screening wird die cystein drei bis syrische Mutante für die Bewertung ausgewählt. Die Daten dieser Mutante werden zusammen mit dem Blankolauf angezeigt, der für diese Mutante durchgeführt wurde, und fahren Sie mit einem Klick fort. Nächster. Der nächste Bildschirm zeigt die Daten mit dem leeren Lauf subtrahiert von dem Lauf mit Stichprobe.

Wählen Sie aus, ob Sie die Kinetik auswerten möchten, indem Sie auf die Schaltfläche "Kinetik" klicken. Wählen Sie nun, ob Sie die Daten an ein Eins-zu-Eins-Interaktionsmodell anpassen möchten. Mit einem Klick auf die Schaltfläche Passung wird die Passung bei der Berechnung auf dem Bildschirm angezeigt.

Sobald es fertig ist, werden Qualitätskontrollen automatisch angewendet und unten hervorgehoben. Durchsuchen Sie die Qualitätskontrollelemente und sehen Sie sich dann die Sensorgrammdaten an, um sicherzustellen, dass die Sensorgramme eine ausreichende Krümmung aufweisen. Werfen Sie auch einen Blick auf das Residuendiagramm, das die Unterschiede zwischen den gesammelten Daten und dem angepassten Modell zeigt.

Achten Sie auf systematische und nicht zufällige Abweichungen. Diese Passform ist akzeptabel. Werfen Sie nun einen Blick auf die kinetischen Daten auf der Registerkarte Bericht.

Die Assoziationsratenkonstante, die Dissoziationsratenkonstante und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie auf Fertig und wiederholen Sie den gleichen Vorgang für alle anderen Mutanten. Hier sind repräsentative Ergebnisse der CFCA-Analyse für die verschiedenen untersuchten Cystatin-B-Varianten.

Die spezifischen Bindungskonzentrationsdaten werden aus den Sensorgrammen extrahiert, die bei Durchflussraten von 10 und 100 Mikrolitern pro Minute erhalten werden. Vergleicht man die Konzentration, die durch eine Zwei-80er-Messung bestimmt wurde, mit der durch CFCA bestimmten, so wird deutlich, dass das Protein bei der Leucin-73-Glycin-Variante zwar in den meisten Fällen voll aktiv ist, der Anteil des aktiven Proteins jedoch sehr gering ist. Die Kinetik von Cystatin-B-Varianten, die an Pepin binden, wird mit Hilfe der Einzelzykluskinetik bestimmt.

Die Sensorgramme zeigen leere und subtrahierte Referenzdaten mit kinetischen Daten für ein Eins-zu-Eins-Interaktionsmodell, die schwarz überlagert sind. Die mit CFCA gemessene spezifische Bindungskonzentration für die Leucin-73-Variante beträgt nur etwa 10 % der Gesamtproteinkonzentration, die durch eine Messung von zwei 80 bestimmt wurde. Bei der Berechnung der kinetischen Parameter mit der richtigen Konzentration wird deutlich, dass die Assoziationsrate für Lucien 73 ähnlich ist wie bei den anderen Varianten.

Während die Assoziationsraten der Mutanten mit denen des Wildtyp-Proteins vergleichbar sind, kann die Dissoziationsratenkonstante der Mutanten um fast zwei Größenordnungen höher sein, was zu einem entsprechenden Anstieg der Gleichgewichtsdissoziationskonstante führt. Die verringerten Affinitäten hängen hauptsächlich von erhöhten Dissoziationsraten ab, was darauf hindeutet, dass sowohl die zweite Bindungsschleife als auch das C-terminale Ende von Cystatin B zur Bindungsaffinität beitragen, indem sie den Inhibitor an das Enzym binden, sobald der Komplex gebildet wurde. Die Verwendung einer kalibrierfreien Konzentrationsanalyse war für diese Schlussfolgerung unerlässlich, da sich herausstellte, dass eine der Mutanten eine sehr geringe Bindungsaktivität aufwies. Mein Kollege Pol hat Ihnen nun in einer strukturierten Funktionsstudie gezeigt, wie Sie bi core X 100 nutzen können. Bei der Durchführung dieser Experimente ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass, obwohl sowohl die Konzentration als auch die kinetische Analyse auf dem gleichen Bindungsverfahren basieren, die experimentellen Bedingungen sehr unterschiedlich sind.