Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

Dieses Protokoll zeigt die Anwendung eines neuartigen mikrofluidischen Kokultursystems, das eine getrennte Kultivierung eukaryotischer Zellen zusammen mit Bakterien ermöglicht, um den Einfluss der kommensalen Mikroumgebung auf die Kolonisation durch Pathogene zu untersuchen. Das Kokultursystem wird demonstriert, indem ein kommensaler Escherichia coli-Biofilm zwischen HeLa-Zellen etabliert und anschließend enterohämorrhagisches Escherichia coli (EHEC) in die kommensale Insel eingeführt wird, und zwar in einer Abfolge, die der Reihenfolge der Ereignisse bei einer Infektion des Magen-Darm-Trakts nachempfunden ist.

Das resultierende Ausmaß der Besiedelung von Epithelzellen durch EHEC wird mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Hallo, ich komme aus dem Labor für molekulare Systembiotechnologie am Fachbereich Verfahrenstechnik der Texas und M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur gemeinsamen Kultivierung von Bakterien und eCard-Zellen in einem Mikrogerät, das die Organisation im menschlichen Magen-Darm-Trakt nachahmt.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu untersuchen, wie die Besiedlung epithelialer Zellen durch pathogene Bakterien von Signalen beeinflusst wird, denen sie vor der Kolonisation im Harntrakt begegnen. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor der Experimentierung einen Silikon-Abdruck vor, der gemäß dem vorgesehenen experimentellen Einsatz entworfen und hergestellt wurde.

Beispielsweise stellt die Stanford Microfluidics Foundry konstruierte Master her, von denen anschließend experimentelle Abformungen angefertigt werden können. Für die in diesem Protokoll beschriebene dreischichtige Vorrichtung werden Formen für zwei Membranen – für die eukaryotische Zellkulturschicht und die pneumatische Schicht – sowie ein bakterieller Kanal benötigt; die Kanalhöhen für die bakterielle, pneumatische und eukaryotische Zellkulturschicht betragen jeweils 5, 200 und 100 Mikrometer. Vor der Herstellung einer Abformung muss der SU-8-Master Fluorcyclin-Dampf in einem an eine Vakuumquelle angeschlossenen Exsikkator ausgesetzt werden. Um die einfache Entfernung der PDMS-Form vom Master zu ermöglichen, geben Sie einen Tropfen Fluorolube auf ein Papiertuch im Vakuumkammer und ziehen Sie für eine Minute ein Vakuum.

Entfernen Sie das Vakuum und lassen Sie 30 Minuten für die Ablagerung von Fluor zu. Bewahren Sie die SU-8-Masterform zur späteren Herstellung von Abformungen in einer Petrischale auf. Bereiten Sie das PDMS-Präpolymer und den Vernetzer im Gewichtsverhältnis 10:1 vor und mischen Sie die Komponenten gründlich. Entgasen Sie das Gemisch für eine Stunde in einer Vakuumkammer.

Um Luftblasen zu entfernen, stellen Sie die SU-8-Matrize in eine Petrischale und gießen Sie vorsichtig PDMS auf die Matrize, und zwar fünf Gramm PDMS für die und 30 Gramm PDMS für die bakterielle Schicht. Entgasen Sie das PDMS erneut für 10 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. Anschließend wird die Form eine Minute lang zentrifugiert, um das PDMS zu einer gleichmäßigen Membran zu verteilen.

In diesem Protokoll wird die Membran der eukaryotischen Zellkultur bei 1200 U/min für eine Dicke von 150 Mikrometern zentrifugiert, und die pneumatische Membran wird bei 800 U/min für eine Dicke von 250 Mikrometern zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren die Petrischale mit der zentrifugierten PDMS- und SU-8-Masterform 15 Minuten bei Raumtemperatur lagern, bevor sie eine Stunde lang auf einer Heizplatte bei 80 Grad Celsius erhitzt wird. Zum Aushärten der PDMS nach dem Aushärten die PDMS mit Methanol benetzen und vorsichtig mit sauberen Pinzetten von den SU-8-Masterformen ablösen.

Platzieren Sie die Bakterienschicht auf einem Stereomikroskop und bohren Sie mit einer stumpfen Nadel mit 20 Gauge-Durchmesser drei Löcher, zwei Bakterienzuläufe und einen Auslauf. Die dreischichtige Vorrichtung wird in der folgenden Reihenfolge zusammengebaut: Verbindung der pneumatischen Schicht mit der Bakterienschicht sowie Verbindung der eukaryotischen Zellkulturschicht mit der Bakterien- und pneumatischen Schicht.

Platzieren Sie die pneumatische Membran und die Bakterienschicht auf einem Objektträger und setzen Sie sie für 40 Sekunden einem Plasma in einer Sauerstoff-Plasmakammer bei einem Sauerstoffdruck von 10 standard cubic centimeters per minute (SCCM) und einer Hochfrequenz- (RF-)Leistung von 100 Watt aus. Die Zugabe von Methanol in die Membranen erleichtert die freie Bewegung der Schichten und macht die Ausrichtung einfacher. Innerhalb von 10 Minuten nach der Sauerstoff-Plasma-Behandlung platzieren Sie die Bakterienschicht mithilfe einer Pinzette und eines Stereomikroskops in eine Petrischale.

Richten Sie die mittlere pneumatische Membran anhand der Einlass- und Auslassöffnungen für die Bakterien an der Bakterienschicht aus. Nach der Ausrichtung stellen Sie die Petrischale mit der ausgerichteten PDMS-Struktur acht Stunden lang auf eine Heizplatte bei 80 Grad Celsius, um eine Bindung herzustellen. Sobald dies abgeschlossen ist, bohren Sie ein Loch in die pneumatische Schicht, um den pneumatischen Kanal zu steuern.

Als Nächstes wiederholen Sie die Schritte von der Montage bis zur Ausrichtung, um den Kanal für die eukaryotische Zellkultur mit dem zusammengesetzten PDMS-Gerät zu verbinden. Bohren Sie Löcher in die Einlass- und Auslassöffnungen, die zum Ansäen der eukaryotischen Zellen verwendet werden. Verbinden Sie Tigon-Schläuche mit den Öffnungen und betreiben Sie die pneumatische Schicht, indem Sie mit der 20-Milliliter-Spritze ziehen.

Platzieren Sie die zusammengesetzte PDMS-Struktur und einen vorher gereinigten Glasobjektträger in eine Sauerstoff-Plasma-Kammer. Schalten Sie das Plasma für 20 Sekunden ein, ohne ein Vakuum anzulegen. Entnehmen Sie die zusammengesetzte PDMS-Struktur aus der Sauerstoff-Plasma-Kammer und verbinden Sie eine 20-Milliliter-Spritze damit.

Ziehen Sie sofort, um ein Vakuum zu erzeugen und den Kontakt zwischen den Ventilen und dem Glas zu verhindern. Verschieben Sie innerhalb einer Minute. Drücken Sie nach der Plasmaexposition die zusammengesetzte PDMS-Struktur vorsichtig auf das Glas.

Den PDMS-Chip 10 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 80 Grad Celsius aushärten lassen. Anschließend Tigon-Schläuche an jeden Anschluss anschließen und das Gerät 15 Minuten lang unter UV-Licht sterilisieren. Danach 500 Mikroliter sterile PBS-Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze füllen und in den Kanal einführen, um eventuelle Rückstände zu entfernen.

Falls eine Luftblase beobachtet wird, klemmen Sie den Auslassschlauch mit einem Einweg-Mikrozentrifugenröhrchen ab und üben Sie leichtem Druck aus, um die Blase durch die gasdurchlässigen PDMS-Schichten zu entfernen. Füllen Sie steriles Wasser in den pneumatischen Kanal ein, um die Bildung von Luftblasen in dem Kanal zu verhindern.

Ein selbstgebauter Luft-Flüssig-Druckwandler wird verwendet, um die Bildung von Luftblasen in dem pneumatischen Kanal zu verhindern. Um die Aussaat eukaryotischer Zellen auf dem Glas vorzubereiten, geben Sie 500 Mikroliter Fibronectin in den Zellkultur-Bereich über den Eingang für die Kultur eukaryotischer Zellen. Unter Verwendung einer Spritze, bei geschlossenem Ventil, 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Spülen Sie schließlich das überschüssige Fibronectin mit einem Milliliter Wachstumsmedium unter Verwendung der Spritzenpumpe ab. Die Vorrichtung ist nun bereit, für das Experiment verwendet zu werden, um einen kommensalen Biofilm zu bilden. Verdünnen Sie die Bakterien in M9-Minimalmedium auf eine OD 600 von etwa eins. In diesem Beispiel verwenden wir einen Laborstamm von e coli, aber jeder nicht-pathogene Bakterienstamm kann verwendet werden.

Schließen Sie das Ventil, das die Bereiche der Bakterien- und Eukaryontenzellkultur voneinander trennt, indem Sie positiven Flüssigkeitsdruck anwenden. Geben Sie 0,2 Milliliter E. coli mit einem OD600 von etwa 1,0 mithilfe einer Spritzenpumpe in die Inseln ein und lassen Sie die Bakterien eine Stunde lang bei 32 Grad Celsius anheften. Nach der Inkubation.

Perfusieren Sie eine verdünnte bakterielle Suspension mit einem OD 600 von etwa 0,05 und frischem M-neun-Minimalmedium mit 0,25 Millilitern pro Stunde über einen Zeitraum von 12 Stunden. Spülen Sie den Biofilm unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit 0,5 Millilitern frischem, serumfreiem und antibiotikafreiem DMEM-Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millilitern pro Stunde, um locker angeheftete Bakterien zu entfernen und den Biofilm für die Anheftung eukaryotischer Zellen vorzubereiten. Bilden Sie den Biofilm ab. Visualisieren Sie die Biofilmarchitektur mithilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Leica T-C-S-S-P fünf und der MS-Software.

Trypsinieren Sie die Augen, heela-Zellen aus einem Gewebekulturkolben, und resuspendieren Sie sie in DMEA-Medien auf ein Gesamtvolumen von 0,1 Milliliter mit einer Besiedlungsdichte von fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter. Führen Sie die heela-Zellen in den eukaryotischen Bereich des Geräts bei einer Flussrate von zwei Milliliter pro Minute mittels einer Pico-Plus-Spritzenpumpe ein.

Danach mithilfe eines Lichtmikroskops sicherstellen, dass das Ventil, das den Bereich der kommensalen Bakterien vom Bereich der eukaryotischen Zellen trennt, vollständig geschlossen ist, sodass der bakterielle Biofilm vom Helozellenbereich getrennt ist. Mit einem Einweg-Mikrozentrifugenröhrchen den Zellauslass abklemmen, um die Bewegung der Zellsuspension im Kanal zu verringern, und sechs Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation das Gerät mit einem Spritzenpumpensystem mit 50 Mikrolitern DMEM-Wachstumsmedium bei 0,5 Millilitern pro Stunde perfundieren.

Um nicht angeheftete Zellen zu entfernen, erneuern Sie das DMEM-Medium für die Hela- und die kommensalen E. coli-Bereiche alle sechs Stunden. Bereiten Sie E. coli O157:H7, oder EHEC, in M9-Medium vor, um Hela-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 bis 200 EHEC-Zellen pro Hela-Zelle zu infizieren, und waschen Sie locker angeheftete kommensale Bakterien wie im vorherigen Abschnitt beschrieben aus. Geben Sie eine 100-Mikroliter-Verdünnung der EHEC-Suspension mit einem OD600 von etwa 0,1 über eine Spritzenpumpe in die Inseln bei einer Flussrate von 0,25 Millilitern pro Stunde ein.

Anschließend das Gerät sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator ohne Durchfluss inkubieren, um EHEC den Signalen im kommensalen Biofilm auszusetzen. Nach der Inkubation öffnen Sie das Ventil zwischen dem Bereich der kommensalen Bakterien und dem der eukaryotischen Zellen, indem Sie mit einer Vakuumpumpe ein Vakuum erzeugen, und halten das Ventil sechs Stunden lang geöffnet. Dadurch werden die HEC im kommensalen bakteriellen Biofilm den HeLa-Zellen ausgesetzt. Danach erfolgt eine erneute Inkubation für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator.

Lebend-Tot-Färbung in das Gerät einführen, das gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet wurde. Um die Helo-Zellviabilität zu bestimmen, 0,1 Milliliter der Standlösung mithilfe einer Ein-Milliliter-Spritze in den eukaryotischen Bereich des Geräts injizieren, als Kontrolle zur Abschätzung des Helo-Zelluntergangs. In Abwesenheit von EHEC die vorherigen drei Schritte wiederholen und steriles, serumfreies und antibiotikafreies DMEM-Medium in das Gerät einführen.

Statt des EHEC-Bildes mehrere Stellen auf einem Zeiss AIOt 200 M Fluoreszenzmikroskop aufnehmen und die Anzahl lebender epithelialer Zellen in Grün unter den toten epithelialen Zellen in Rot abschätzen, indem die Anzahl der grünen Zellen in Bildern gezählt wird, die an mindestens sieben Stellen aufgenommen wurden. Nun zeigen wir einige repräsentative Bilder der Trialayer-Mikrofluidikvorrichtung. In diesem Bild verwenden wir eine inerte Lebensmittelfarbe, um die verschiedenen Kulturbereiche darzustellen.

Der violette Farbstoff repräsentiert den Bereich der eukaryotischen Zellkultur, während der grüne Farbstoff den gemeinsam lebenden bakteriellen Biofilm darstellt. In diesem Bild zeigen wir die Machbarkeit, die eukaryotischen und bakteriellen Bereiche voneinander getrennt zu halten, da der violette Farbstoff im bakteriellen Bereich deutlich vom umgebenden gelben Farbstoff abgegrenzt ist. Die Besiedlung des grünes Protein exprimierenden, gemeinsam lebenden bakteriellen Biofilms durch pathogene, rotes Protein exprimierende Bakterien wird hier dargestellt.

Wie in diesem Bild gezeigt, unterscheiden sich die EHEC- und die kommensalen Bakterien von den Hela-Zellen, die den bakteriellen Biofilm umgeben. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Trockenschicht-Mikrogerät zur Kokultur von Bakterien und Epithelzellen zusammenbaut und üblicherweise die Wirkung von Signalstoffen auf die Besiedlung durch Krankheitserreger untersucht. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, alle Blasen im Gerät zu entfernen und den Erreger mit der geeigneten Multiplizität der Infektion zu verwenden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.