Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

E Coli RP 4 37 werden in ein Chemotaxis-Gerät eingebracht, wo sie einer definierten räumlichen Konzentration ausgesetzt werden. Gradientenzellen, die in die Kammer eintreten, treffen auf den Mittelpunkt des Konzentrationsgradienten. Je nachdem, ob das Signal als Lockstoff oder als Repellent wahrgenommen wird, bewegen sich Bakterien im Konzentrationsgradienten schnell nach oben oder unten.

Hallo, ich bin Derek Engler vom Labor für Molekulare Systembiotechnologie und dem Department of Chemical Engineering an der Texas a and m University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem bakterielle Chemosteuern in einem mikrofluidischen Gerät untersucht werden. Wir verwenden dieses Verfahren in unseren Laboren, um zu untersuchen, wie e coli RP 4 37 im Konzentrationsgradienten von Nickelsulfat migriert.

Also lasst uns loslegen. Die Fluidikschicht und die Kontrollschicht werden durch Nachformen von PolymethylSUBOXANE oder PDMS aus dem SU-Acht-Master hergestellt. Um dieses Verfahren zu starten, mischen Sie das PDMS-Präpolymer und den Vernetzer in einem Gewichtsverhältnis von 10 zu eins.

Entgasen Sie das Gemisch eine Stunde lang in einem Trockenmittel, bis die Luftblasen entfernt sind. Wenn die PDMS-Mischung fertig ist, legen Sie den SU eight master in eine Petrischale und gießen Sie die Mischung vorsichtig auf den SU eight master auf die gewünschte Dicke Hitze. Die Petrischale, in der sich das PDMS und die SU-Acht-Urform befinden, wird zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius getestet, um das PDMS auszuhärten.

Entfernen Sie nach zwei Stunden den ausgehärteten PDMS-bedeckten SSU eight Master von der Heizplatte und schälen Sie die PDMS-Form vom SU eight Master. Die gewünschte Struktur wird mit einer 20-Gauge-Nadel mit stumpfem Ende in die PDMS-Form eingebettet, um vier Löcher in die PDMS-Form zu bohren, um den Gradientengenerator, den Zelleinlass und den Zellauslass zu verrohren. Jetzt sind wir bereit, das PDMS-Gerät zusammenzubauen, um das PDMS-Gerät zu verbinden.

Reinigen Sie zunächst einen Objektträger aus Glas mit Isopropanol und probieren Sie es mit einem Airstream aus. Setzen Sie anschließend die PDMS-Form und den Glasobjektträger etwa 30 Sekunden lang Sauerstoffplasma in einem Plasmaätzer aus. Bringen Sie die PDMS-Form mit dem Objektträger in Kontakt Erhitzen Sie den kontaktierten Objektträger und die PDMS-Form auf einer Heizplatte 15 Minuten lang auf 65 Grad Celsius.

Um das PDMS-Gerät zusammenzubauen, verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Schlauch in einem 45-Grad-Winkel auf die richtige Länge zu schneiden, die je nach Mikroskopkonfiguration erforderlich ist. Dann mit einer Pinzette. Führen Sie ein Ende des Schlauchs in eines der vier Löcher ein, die in das Gerät gestanzt sind.

Führen Sie eine stumpfe 30-Gauge-Nadelnabe in das andere Ende des Schlauchs ein. Wiederholen Sie das Einführen des Schlauchs und der Nadelnabe für alle verbleibenden Löcher. Laden Sie einen Milliliter Chemosteuern, Puffer oder CB in eine Drei-Milliliter-Spritze.

Achten Sie darauf, dass die Luft aus der Spritze entfernt wird. Geben Sie mit einer Pipette CB in die Auslassnadelnabe und klopfen Sie auf die Nadelnabe, um alle Luftblasen zu entfernen. Drücken Sie etwas CB aus der Spitze der Drei-Milliliter-Spritze und verbinden Sie die Spritze mit der Nadelnabe, ohne Luft einzuschließen.

Schieben Sie CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadelnaben mit CB gefüllt sind. Dadurch sollte ein Großteil der Luftblasen entfernt werden. Füllen Sie anschließend zwei 500-Mikroliter-Spritzen mit CB, das die entsprechenden Konzentrationen des zu testenden Chemoeffektors enthält.

Beseitigen Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken und die Tropfen der Flüssigkeit in der Nadelnabe berühren und die Spritze anbringen, um hochbewegliche Bakterien vorzubereiten. Für das Chemotaxis-Experiment wird eine Übernachtkultur von E. coli RP 4 37 mit einer GFP-Expression, Plasmid in Tripton-Bouillon oder TB bei 32 Grad Celsius gezüchtet und am nächsten Tag geschüttelt. Verwenden Sie die Übernachtkultur, um eine 20-Milliliter-Kultur TB in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,05 zu impfen.

Wachsen Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius unter Schütteln, wenn die Zellen einen OD 600 von etwa 0,35 bis 0,45 haben. Ernten Sie sie durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, reuse suspendieren Sie die Zellen auf einen OD 600 von etwa 0,35 in CB, der den Chemoeffektor in der erwarteten Konzentration in der Mitte des Kanals enthält. Schließlich fügen Sie RFP-markierte tote Zellen bei keinem D 600 von etwa 0,35 zu den GFP-exprimierenden lebenden Zellen hinzu.

Diese toten Zellen werden eine interne Kontrolle sein, um sicherzustellen, dass eine Migration nicht auf Strömungseffekte zurückzuführen ist. Die Zellsuspension ist nun bereit, in das mikrofluidische Gerät für das Chemotaxis-Experiment geladen zu werden. Um das Chemotaxis-Experiment zu starten, entfernen Sie einen Teil des CB aus der Nachfüllung der Zelleinlassnadelnabe mit der Zellsuspension.

Füllen Sie vorsichtig eine 50-Mikroliter-Spritze mit den resuspendierten Zellen. Mache dies langsam, da Geißeln geschoren werden können, was die Beweglichkeit verringert. Befestigen Sie die 50-Mikroliter-Spritze an der Einlassnadelnabe, wie zuvor gezeigt, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken und den Tropfen mit der Flüssigkeit in der Nadelnabe berühren und die Spritze anbringen. Positionieren Sie das Gerät auf dem Tisch eines Fluoreszenzmikroskops, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera für die Bildaufnahme ausgestattet ist.

Setzen Sie beide Einlassspritzen in die Spritzenpumpe ein und initiieren Sie den Durchfluss, so dass sich der Gradient bildet und die Zellen durch den Schlauch fließen. Sobald die Zellen in die Chemosteuerkammer gelangen, warten Sie etwa 20 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat. Sammeln Sie vor der Bildgebung grüne und totrote Fluoreszenzbilder an verschiedenen Stellen entlang der Länge der Kammer.

In der Regel erfassen wir 100 Bilder an jedem Standort im Abstand von drei Sekunden. Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder können mit jedem kommerziell erhältlichen Bildanalyseprogramm wie Image J oder metamorph oder mit einfachen, in Matlab geschriebenen Codes analysiert werden. In diesem Beispiel verwenden wir MATLAB-Codes.

Beginnen Sie damit, die Hintergrundpixel im Bild durch diesen festgelegten Schwellenwert für die Pixelintensität zu entfernen, und entfernen Sie alle Pixel, deren Intensität unter dem Schwellenwert liegt. Dadurch wird der Lärm minimiert. Verwenden Sie in der Analyse die Position der toten Zellen, um die Mitte des Bildes zu bestimmen.

Dies stellt die Position dar, an der Zellen in die Chemotaxiskammer eingedrungen sind und an der sie ohne Migration nachgewiesen werden. Lokalisieren Sie als Nächstes lebende Zellen im Bild, unterteilen Sie das Bild in Kanäle und bestimmen Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer früheren Arbeit wurde die 10 50 Mikrometer breite Chemosteuerkammer in 64 Kanäle unterteilt, die jeweils etwa 16 Mikrometer breit waren.

Nachdem Sie diese Schritte für alle Bilder wiederholt haben, wird ein Teil der gesamten Zelle für jeden Kanal in allen Bildern gezählt. Dies ergibt die Gesamtzellzahl, die an jedem Kanal über die Dauer des Experiments nachgewiesen wurde. Berechnen Sie die Chemo-Steuern, den Verteilungskoeffizienten oder CPC, der die Richtung der Migration darstellt.

Indem Sie die folgenden Schritte ausführen, weisen Sie jeder Zelle, die sich auf der hohen Konzentration bzw. der rechten und niedrigen Konzentration bzw. der linken Seite der toten Zellen befindet, einen Multiplikator von plus eins und minus eins zu. Addieren Sie alle multiplizierten Werte und normalisieren Sie auf die Gesamtzahl der erkannten Zellen. Berechnen Sie die Chemosteuern, den Migrationskoeffizienten oder CMC, der die Wanderung der Zellen mit der zurückgelegten Strecke gewichtet.

Eine Zelle, die sich zum am weitesten entfernten Positionskanal 64 mit hoher Konzentration bewegt, erhält einen Gewichtungsfaktor von plus eins, während eine, die sich auf halbem Weg in die Seite mit höherer Konzentration bewegt, einen Gewichtungsfaktor von plus 0,5 und eine Zelle erhält. Der Wechsel in die am weitesten entfernte Position mit niedriger Konzentration wird mit minus eins gewichtet. Ein Teil aller gewichteten Zellzahlen wurde auf die Anzahl der Zellen normalisiert, um die CMC zu erzeugen.

Dieses Diagramm zeigt einen linearen Konzentrationsgradienten oder ein lineares Konzentrationsprofil, das in der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat gebildet wurde. Die Bildung eines Konzentrationsgradienten ist in dieser Abbildung unter Verwendung von blauen und gelben Farbstoffen dargestellt. Der Zelleinlass war CA, so dass es keine Strömung gab, und es ist zu sehen, dass sich ein Farbbereich zwischen Blau und Gelb bildet.

Hier sind Pseudofarbbilder aus einem repräsentativen Chemotaxis-Experiment, in dem e coli RP 4 37 in der Vorrichtung einem Gradienten von null bis 100 mikromolaren L-Aspartat oder null bis 225 mikromolaren Nickelsulfat ausgesetzt wurde. Die Wanderung lebender grüner Bakterien in Richtung Al-Aspartat oder weg von Nickel wurde alle 2,5 Sekunden für 30 Minuten abgebildet. Abgestorbene Bakterien, die in Rot dargestellt waren, dienten als Kontrolle für Strömungseffekte im Gerät.

Die räumliche Verteilung von RP 4 37 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Abwesenheit eines Gradienten ist in diesem Diagramm im Vergleich zu seiner Reaktion auf einen Aspartatgradienten und einen Nickelsulfatgradienten dargestellt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Chemosteuern von e coli RP 4 37 in einem Gradienten von Nickelsulfat überwachen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Vortexen der Zellen zu minimieren, damit eine Subpopulation mit hoher Motilität verwendet werden kann.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.