Name: Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung bakterieller Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten mit einer mikrofluidischen Vorrichtung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von E. coli RP 4 37 und deren Bewegungsmuster.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation (CBET 0846453) unterstützt.

1. Herstellung von Silizium-Master mithilfe von Standard-SU-8 Photolithographie 1 (nicht in diesem Video gezeigt). <ol><li> Verwenden Sie Standard-SU-8 Photolithographie Methoden, um eine SU-8 "Master" (SU-8 2025 MicroChem, Newton, MA) zur Herstellung der PDMS Form, dass die mikrofluidischen Netzwerk-und Chemotaxis Kammer enthält. Solche Master-Formen können jederzeit Mikrofabrikation Anlage (, z. B. Stanford Mikrofluidik Foundry hergestellt werden <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Vor PDMS-Replikation, setzen die SU-8 Master Fluorsilan Dampf in einem Exsikkator an einem Vakuum-Quelle auf einfache Veröffentlichung von PDMS aus dem Master zu erleichtern. Einen Tropfen Fluorsilan auf ein Papiertuch und gelten Vakuum für eine min. Entfernen Sie das Vakuum und damit 30 min für die Abscheidung von Fluorsilan. Halten Sie die SU-8-Master in einem geschlossenen Behälter für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. Replica Formen von PDMS von SU-8-Master: Die fluidische Schicht und die Kontrolle Schicht durch Replikat des PDMS von SU-8 Master gemacht. <ol><li> Mix der PDMS-pre-Polymer und Vernetzer bei einem 10:1-wt. Verhältnis und Degas in einem Exsikkator für 1 Stunde (oder bis Luftblasen aus der PDMS-Mischung entfernt). </li><li> Legen Sie die SU-8 Master in einer Petrischale und vorsichtig gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Oberseite des SU-8 Master auf die gewünschte Dicke. </li><li> Erhitzen Sie die Petrischale mit dem PDMS und der SU-8 Master-Form bei 80 ° C für zwei Stunden, um die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen Sie das gehärtete PDMS-bedeckten SU-8 Master von der Heizplatte und schälen die PDMS Form aus dem SU-8-Master. Die gewünschte Struktur wird in der PDMS-Form eingebettet sein. </li><li> Löcher in die PDMS Gussform für Schlauch mit dem Farbverlauf-Generator und Zell-Einlass mit einer 20-Gauge-blunt-end Nadel. </li></ol> 3. Kleben von PDMS-Geräte: <ol><li> Reinigen Sie einen Glasobjektträger mit Isopropanol und mit Stickstoff trocken oder einen Luftstrom. </li><li> Setzen Sie die PDMS-Glas-Folie, um Sauerstoff-Plasma in einem Plasma Asher. </li><li> Bringen Sie die PDMS Form in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas. Heizen Sie den Kontakt mit Rutsche und PDMS Form bis 65 ° C für 15 min. </li></ol> 4. Montage der PDMS-Gerät <ol><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten Rohres im 45 ° Winkel auf die richtige Länge für das Gerät erforderlich. </li><li> Stecken Sie ein Ende des Schlauches in die Löcher in das Gerät (zB Steckdose) mit einer Pinzette gestanzt. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine stumpfe 30-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.2 für alle übrigen Löcher. </li><li> Sammeln Sie 1 ml der Chemotaxis-Puffer (CB) in einer 3 ml Spritze, kümmert sich um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen. </li><li> Fix eine Nadel-Hub an einem Ende der Ablaufschlauch. </li><li> Add CB, um die Nadel-Hub, und tippen Sie auf die Nadel-Hub, um mögliche Luftblasen zu entfernen. </li><li> Schieben Sie ein wenig CB aus der Spitze der Spritze und schließen Sie das 3 ml Spritze mit der Nadel-Hub ohne Lufteinschluss. </li><li> Push-CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadel-Hubs mit mit CB gefüllt sind. Dies sollte die Mehrheit der Luftblasen. </li><li> Füllen zwei 500μL Spritzen mit CB mit den entsprechenden Konzentrationen der chemoeffector getestet. Vermeiden Sie Luftblasenbildung, indem ein kleiner Tropfen der Spritze Inhalte und berühren Sie mit dem Tropfen der Flüssigkeit in die Nadel-Hub und Befestigung. </li><li> Ebenso verbinden eine Spritze mit CB, um die Bakterien Einlass. Diese werden entfernt, wenn Bakterien in das Gerät eingeführt werden. </li></ol> 5. Das Wachstum von hoch bewegliche E. coli <ol><li> Wachsen Sie über Nacht Kulturen von E. coli RP437 mit einem GFP-Expressionsplasmid in 20 ml Trypton Bouillon (TB) bei 32 ° C unter Schütteln. Add geeigneten Konzentrationen von Antibiotika, um das Plasmid zu erhalten. In unserem Protokoll, verwenden wir ein low-copy Plasmid pCM182 zum Nachweis von Bakterien auf Fluoreszenz in dem Gerät auf. Für E. coli, wachsenden Kulturen bei 32 ° C ist für hohe Beweglichkeit zu empfehlen, da die Motilität ist niedriger bei höheren Temperaturen. </li><li> Verwenden Sie die Übernacht-Kultur zu einer 20 ml Kultur von TB in einem 250 ml Erlenmeyerkolben impfen zu einer optischen Dichte bei 600nm von ~ 0,05. Die Kultur unter Schütteln bei 32 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen bei einer OD 600 von ~ 0,35 0,45 langsame Zentrifugation bei 400 xg für 5 min. </li><li> Die Zellen auf eine OD 600 von ~ 0,35 in CB mit der chemoeffector auf die Konzentration in der Mitte des Kanals zu erwarten. </li><li> Add RFP-markierten toten Zellen bei einer OD 600 von ca. 0,35 bis die GFP-exprimierenden lebende Zellen. Die Toten (rot) Zellen sind als interne Kontrolle, um sicherzustellen, dass eine Migration nicht aufgrund Flow-Effekte verwendet. </li></ol> 6. Überwachung Chemotaxis <ol><li> Entfernen Sie einige der CB aus der Zelle EinlassnadelHub. Refill mit der Zellsuspension. </li><li> Vorsichtig füllt die 50 ul Spritze mit der resuspendierten Zellen. Dieser Schritt muss langsam erfolgen, wie Geißeln können geschert werden und Beweglichkeit zu reduzieren. </li><li> Bringen Sie die 50 ul Spritze mit dem Einlass-Kanülenansatz wie in den Schritten Schritt 4.10 beschrieben. </li><li> Stellen Sie das Gerät auf der Bühne ein Fluoreszenzmikroskop mit einem High-Speed-Kamera für die Bildaufnahme ausgestattet. Legen Sie die Einlass-Spritzen (beide 500 mL Gradienten Spritzen und die 50 ul Zell-Spritze) in die Spritzenpumpe und initiieren fließen, so dass der Gradient gebildet wird und die Zellen werden durch den Schlauch fließt. </li><li> Sobald Zellen der Chemotaxis Kammer betreten, warten ca. 20 min, bis das System vor Bildgebung zu stabilisieren. </li><li> Sammeln grün (live) und rot (tot) Fluoreszenzbilder an verschiedenen Orten entlang der Länge der Kammer (entsprechend unterschiedlichen Belichtungszeiten). Normalerweise sammeln wir 100 Bilder an jedem Ort auf 3 Sekunden-Intervallen. </li></ol> 7. Datenanalyse: Die folgenden Schritte kann mit jedem handelsüblichen Bildanalyse-Programm (zB ImageJ, Metamorph) oder mit einfachen Codes in Matlab geschrieben werden. <ol><li> Entfernen Sie den Hintergrund Pixel im Bild (dh eingestellte Schwelle Pixelintensität und entfernen Sie alle Pixel, die Intensität haben weniger als die Schwelle). Dies minimiert die Geräuschentwicklung in der Analyse. </li><li> Verwenden Sie die Position des toten Zellen (rote Fluoreszenz), um die Mitte des Bildes zu bestimmen. Da die toten Zellen keine Chemotaxis zeigen, ist dies die Stelle, an Zellen in die Chemotaxis Kammer und würde in Ermangelung einer Migration erkannt werden. </li><li> Suchen lebenden Zellen (grüne Fluoreszenz) in das Bild. </li><li> Unterteilen Sie das Bild in die Kanäle und die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer vorherigen Arbeit 3, wurde der 1050 um breit Chemotaxis Kammer in 64 Kanäle, die jeweils ~ 16 &amp;mgr; m breit sind geteilt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7,1 7,3 für alle Bilder und die Summe der gesamten Zellzahl pro Kanal auf allen Bildern. Dies gibt der gesamten Zellzahl bei jeder Kanal über die Dauer des Experiments erkannt. </li><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC), die die Richtung der Migration darstellt, wie folgt: Jede Zelle in der hohen Konzentration (rechts) und geringer Konzentration (links) Seiten des toten Zellen befindet, ist ein Multiplikator von +1 und -1 zugeordnet bzw.. Das heißt, eine Zelle, die bis wandert eine Steigung von +1 multipliziert wird, während Zellen bewegten sich die Steigung von -1 multipliziert werden. Alle multiplizierten Werte werden addiert und normiert auf die Gesamtzahl der gefundenen Zellen. Zum Beispiel zeigt eine CPC-Wert von 0,40, dass 40% mehr des gesamten Bakterien, die hohe Konzentration Seite geschoben, als die geringe Konzentration Seite (dh der chemoeffector ist ein Lockstoff als mehr Bakterien nachgewiesen wurden bewegt sich die Steigung). </li><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC), die die Migration von Zellen durch die zurückgelegte Strecke, wie folgt wiegt: Gewicht der Zellzahl in jedem Kanal durch einen Faktor, der proportional zum Abstand, dass die Zellen wandern wird. Eine Zelle, die bis in die entferntesten mit hoher Konzentration Position (Kanal 64) bewegt, ist ein Gewichtungsfaktor von +1 gegeben, während eine, die auf halbem Weg bewegt sich in der höheren Konzentration Seite ein Gewichtungsfaktor von +0,5 gegeben wird, und eine Zelle bewegen, die am weitesten low-Konzentration Position ist mit -1 gewichtet. Fassen Sie alle gewichteten Zellzahlen und normalisieren, um die Anzahl der Zellen, die CMC zu generieren. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse 3,4: Wir haben das Mikrofluidikvorrichtung (Abbildung 1A) beschrieben hier, um Chemotaxis von E. untersuchen coli in Gradienten von Lockstoffen (Asparaginsäure, Autoinducer-2) und Repellentien (NiSO 4, Indol) 3,4. Die prototypische Chemotaxis Belastung 5 E. coli RP437, die GFP verwendet wurde, zusammen mit Kanamycin-getötet E. coli TG1-Zellen, die rot fluoreszierendes Protein zu fließen Auswirkungen überwacht. Der Konzentrationsgradient in der μFlow Vorrichtung ausgebildet ist in Abbildung 1B gezeigt. Die Zelle Einlass wurde verschlossen, so dass es keine durchströmt und einen stabilen Verlauf der 0 100 ng / mL fluoresscein im Gerät eingerichtet wurde. Die Pixel-Intensität in das Gerät eingesetzt wurde, um die Konzentration Profil von Fluorescein zu bestimmen. Die Daten zeigen, dass Bakterien einen linearen Verlauf begegnen, wenn sie die Chemotaxis Kammer betreten. 2A und B zeigt Fluoreszenzbilder von E. coli RP437 Migration in Reaktion auf Gradienten von Asparaginsäure (0 100 uM) und NiSO 4 (0 225 uM). Die beobachteten Reaktionen auf diese kanonischen Lockstoff und abweisend sind wie vorhergesagt. 3A zeigt die quantifizierte Verteilung von E. coli RP437 in Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten (dh null Gefälle von Asparaginsäure), während3B und C zeigen die Verteilung in Steigungen von Asparaginsäure und NiSO 4. Die Spezifität dieser Reaktion (dh die Vorspannung in der Migration) ist offensichtlich, als E. coli RP437 Δ tar-Stammes (dh, Stamm fehlt die Tar Chemorezeptor, dass in E. coli verwendet wird, um Asparaginsäure und Nickel Sinne) nicht zeigen, die Vorspannung in der Migration in der Gegenwart eines Konzentrationsgradienten von Asparaginsäure oder NiSO 4. Die Trends evident in der räumlichen Verteilung Profile sind auch im Einklang mit den berechneten CPC und CMC-Werte. Die CPC-Werte für die Migration von E. coli RP437 in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO 4 sind +0,33 und -0,33 bzw.. Die entsprechenden CMC-Werte 0,13 und -0,14 bzw.. Im Gegensatz dazu schätzt die CPC und CMC mit dem E. coli RP437 Δ tar-Stamm in Steigungen von Asparaginsäure oder NiSO 4 sind vernachlässigbar. Darüber hinaus sind die CPC und CMC in ein Null-Gradienten von Asparaginsäure 0,03 und 0,02, bzw., und geben Sie die Unbefangenheit bei der Migration in der Abwesenheit eines Gradienten. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1b"> Abbildung 1. Geräte schematische und Konzentrationsgradienten. (A) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Chemotaxis Gerät. Das Gerät besteht aus einem Gradienten-Mischmodul (20 x 100 x 18750 um) und eine Chemotaxis Beobachtung Modul (20 x 1050 x 11500 um). Die Breiten der beiden Gradienten-Kanäle in das Gerät sind 500 mu m und die Breite der Bakterien Einlass ist 50 pm. Der Einschub zeigt eine Steigung von Signalmolekül (grau) und Bakterien wandern in Reaktion darauf. Live-Bakterien sind als feste Ovale dargestellt, von den toten Bakterien als offene Ovale dargestellt. (B) A Konzentrationsgradienten zwischen 0 und 100 ng / mL Fluorescein wurde in das Gerät erzeugt und aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenz-Bilder wurden nach 30 min erworben und quantifiziert durch Bildanalyse. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Chemotaxis von E. coli RP437 in der mikrofluidischen Gerät. E. coli RP437 wurde ein Gradient von exponierten (A) 0-100 uM L-Aspartat oder (B) 0 bis 225 uM NiSO 4 in das Gerät und die Migration von lebenden Bakterien (grün) in Richtung L-Aspartat-oder weg von Nickel abgebildet alle 2,5 sec für 30 min. Tote Bakterien (rot) diente als Kontrolle für die Flow-Effekte in das Gerät. Die Bilder wurden quantifiziert mit einem in-house entwickelte Analyse program3. Die angegebenen Daten sind repräsentativ für pseudo-farbigen Bilder von drei unabhängigen Experimenten. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Abbildung 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Abbildung 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3c"> Abbildung 3: Quantifizierung der Migration Profile zu einem kanonischen Lockstoff und abweisend. Räumliche Verteilung der RP437 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Reaktion auf (A) einheitlich 100 uM L-Aspartat-(dh, keine Steigung), (B) eine 0 100 uM Gefälle von Aspartat, und (C) eine 0 225 uM Steigung NiSO 4 . Die Verteilung der toten Zellen als durchgezogene Linie dargestellt ist, ist die Verteilung der RP437-Zellen als gestrichelte Linie dargestellt, und die Verteilung der RP437 eda + Δ tar-Zellen ist als gestrichelte Linie dargestellt. Die gezeigten Daten sind für die drei unabhängigen Experimenten gemittelt.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

Die Chemotaxis Verteilungskoeffizient (CPC) und die Chemotaxis Migration Koeffizient (CMC) kann berechnet als in Mao et al 5 beschrieben. Wenn eine Zelle auf die hohe Konzentration Seite erkannt wird, ist es ein Wert von +1 gegeben, während eine Zelle auf die geringe Konzentration Seite hat einen Wert von -1 gegeben ist. Die Werte werden addiert und dividiert durch die Gesamtzahl der Zellen auf die CPC zu generieren. Das Vorzeichen der CPC (positiv oder negativ) gibt die Richtung der Migration (hin ...

einer mikrofluidischen vorrichtung zur quantifizierung von bakteriellen chemotaxis in stable konzentrationsgradienten

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis ermöglicht Bakterien zu den Quellen der Lockstoff Chemikalien-Ansatz oder die Quellen der abweisenden Chemikalien zu vermeiden. Bakterien ständig die Konzentration von bestimmten chemoeffectors durch den Vergleich der aktuellen zur Konzentration detektiert ein paar Sekunden früher. Dieser Vergleich bestimmt, die Netto-Richtung der Bewegung. Obwohl mehrere, konkurrierende Verläufe oft in der Natur existieren, sind konventionelle Ansätze zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis suboptimal für die Quantifizierung der Migration in Reaktion auf Konzentrationsgradienten von Lockstoffen und Repellents. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer mikrofluidischen Chemotaxis-Modell für die Präsentation präzise und stabile Konzentrationsgradienten chemoeffectors Bakterien und quantitative Untersuchung ihrer Reaktion auf das angelegte Gefälle. Das Gerät ist vielseitig, dass Konzentrationsgradienten beliebiger absolute Konzentration und Gradientenstärke kann leicht durch diffusive Mischen erzeugt werden. Das Gerät wird demonstriert mit der Reaktion der<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 an Steigungen von Aminosäuren und Nickel-Ionen.

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis ermöglicht es Bakterien, sich Lockstoffen zu nähern oder Quellen abstossender Chemikalien zu meiden. Bakterien überwachen ständig die ...

E. coli RP4-37 werden in eine Chemotaxis-Vorrichtung eingeführt, in der sie definierten räumlichen Konzentrationen ausgesetzt werden. Zellen, die in die Kammer eintreten, treffen auf den Mittelpunkt des Konzentrationsgradienten. Abhängig davon, ob das Signal als Attraktant oder Repellent wahrgenommen wird, bewegen sich die Bakterien schnell entlang des Konzentrationsgradienten aufwärts oder abwärts.Hallo, ich bin Derek Engler vom Labor für molekulare Systembiotechnologie und vom Fachbereich Verfahrenstechnik der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in einer mikrofluidischen Vorrichtung. In unseren Laboren verwenden wir dieses Verfahren, um zu erforschen, wie E. coli RP437 in einem Konzentrationsgradienten aus Nickelsulfat migriert.Beginnen wir also. Die fluidische Schicht und die Steuerschicht werden durch Abformung von Polymethyl SUBOXANE oder PDMS von der SU-acht-Masterform hergestellt. Mischen Sie zu Beginn des Verfahrens das PDMS-Präpolymer und den Vernetzer im Gewichtsverhältnis 10 zu 1.Entgasen Sie die Mischung eine Stunde lang im Exsikkator, bis die Luftblasen entfernt sind. Wenn die PDMS-Mischung bereit ist, stellen Sie die SU-acht-Masterform in eine Petrischale und gießen Sie die Mischung vorsichtig in der gewünschten Dicke darauf. Heizen Sie die Petrischale mit der PDMS-Mischung und der SU-acht-Masterform zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius, um das PDMS zu aushärten.Nach zwei Stunden das ausgehärtete, mit PDMS beschichtete SU-8-Master vom Heizblock nehmen und die PDMS-Form vorsichtig vom SU-8-Master ablösen. Die gewünschte Struktur wird in die PDMS-Form eingebettet sein. Mit einer stumpfen Nadelspitze (20 Gauge) vier Löcher in die PDMS-Form stanzen, um Schläuche an den Gradientengenerator, den Zellzulauf und den Zellauslauf anzuschließen. Nun ist die Montage des PDMS-Geräts zur Verbindung des PDMS-Geräts möglich.Zunächst reinigen Sie einen Glasobjektträger mit Isopropanol und trocknen ihn mit einem Luftstrom. Danach setzen Sie die PDMS-Form und den Glasobjektträger etwa 30 Sekunden lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung in einem Plasma-Ätzer aus. Bringen Sie die PDMS-Form mit dem Glasobjektträger in Kontakt. Erhitzen Sie den verbundenen Objektträger und die PDMS-Form 15 Minuten lang auf einer Heizplatte auf 65 Grad Celsius.Um das PDMS-Gerät zusammenzubauen, schneiden Sie das Schlauchstück mit einer Rasierklinge im 45-Grad-Winkel auf die je nach Mikroskopaufbau benötigte korrekte Länge zu. Anschließend führen Sie mit einer Pinzette ein Ende des Schlauchs in eines der vier in das Gerät gestanzten Löcher ein.Setzen Sie die stumpfe Nadelhülse einer 30-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs ein. Wiederholen Sie das Einführen des Schlauchs und der Nadelhülse für alle verbleibenden Löcher. Füllen Sie einen Milliliter Chemoattraktanzien, Puffer oder CB in eine Drei-Milliliter-Spritze. Darauf achten, dass keine Luft in der Spritze verbleibt. Fügen Sie CB mit einer Pipette an der Auslassnadelnabe hinzu und klopfen Sie leicht auf die Nadelnabe, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Drücken Sie etwas CB aus der Spitze der Dreimilliliterspritze heraus und verbinden Sie die Spritze mit der Nadelnabe, ohne Luft einzuschließen.Drücken Sie CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadelaufsätze mit CB gefüllt sind. Dadurch sollten die meisten Luftblasen entfernt werden. Füllen Sie anschließend zwei 500-Mikroliter-Spritzen mit CB, der die geeigneten Konzentrationen des zu testenden Chemo-Effektors enthält.Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken, die Flüssigkeitstropfen im Nadelstutzen berühren und die Spritze anschließen, um hochbewegliche Bakterien vorzubereiten. Für das Chemotaxie-Experiment züchten Sie eine Übernachtkultur von E. coli RP437 mit GFP-Expression, Plasmid in Triptonbrühe oder TB bei 32 Grad Celsius unter Schütteln am nächsten Tag. Verwenden Sie die Übernachtkultur, um eine 20-Milliliter-Kultur von TB in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,05 zu impfen.Züchten Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius unter Schütteln, sobald die Zellen einen OD 600 von etwa 0,35 bis 0,45 erreicht haben. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und resuspendieren Sie die Zellen auf einen OD 600 von etwa 0,35 in CB, das den Chemo-Effektor in der Konzentration enthält, die in der Mitte des Kanals erwartet wird. Geben Sie schließlich RFP-markierte tote Zellen mit einem OD 600 von etwa 0,35 zu den GFP-exprimierenden lebenden Zellen hinzu.Diese toten Zellen dienen als interne Kontrolle, um sicherzustellen, dass eine eventuelle Migration nicht auf Strömungseffekte zurückzuführen ist. Die Zellsuspension ist nun bereit, in die mikrofluidische Vorrichtung für das Chemotaxis-Experiment geladen zu werden. Um das Chemotaxis-Experiment zu beginnen, entnehmen Sie etwas CB aus dem Nadelaufsatz des Zellzulaufports und füllen diesen mit der Zellsuspension wieder auf.Füllen Sie eine 50-Mikroliter-Spritze vorsichtig mit den resuspendierten Zellen. Gehen Sie dabei langsam vor, da Geißeln abgeschert werden können, was die Beweglichkeit verringern würde. Befestigen Sie die 50-Mikroliter-Spritze an der Einlassnadelhalterung, wie zuvor gezeigt, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken, den Tropfen mit der Flüssigkeit in der Nadelhalterung in Kontakt bringen und die Spritze anschließen. Platzieren Sie die Vorrichtung auf dem Objekttisch eines Fluoreszenzmikroskops, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera zur Bildaufnahme ausgestattet ist.Platzieren Sie beide Zulauf-Spritzen in der Spritzenpumpe und starten Sie den Fluss, sodass der Gradient gebildet wird und die Zellen durch die Schläuche fließen. Sobald die Zellen in die Chemotaxis-Kammer eintreten, warten Sie etwa 20 Minuten, bis das System stabil ist. Vor der Bildaufnahme sammeln Sie lebende grüne und tote rote Fluoreszenzbilder an verschiedenen Stellen entlang der Länge der Kammer.Üblicherweise sammeln wir an jedem Ort 100 Bilder im Abstand von drei Sekunden. Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder können mit jedem handelsüblichen Bildanalyseprogramm wie ImageJ oder MetaMorph oder mit einfachen in MATLAB geschriebenen Codes analysiert werden. In diesem Beispiel verwenden wir MATLAB-Codes.Entfernen Sie zunächst die Hintergrundpixel im Bild anhand dieses Schwellenwerts für die Pixelintensität und eliminieren Sie alle Pixel mit einer geringeren Intensität als der Schwellenwert. Dadurch wird das Rauschen minimiert. Verwenden Sie in der Analyse die Position der toten Zellen, um das Zentrum des Bildes zu bestimmen.Dies stellt die Position dar, an der die Zellen die Chemotaxis-Kammer betraten und an der sie ohne jegliche Migration detektiert würden. Als Nächstes lokalisieren Sie lebende Zellen im Bild, teilen das Bild in Kanäle auf und ermitteln die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer vorherigen Arbeit wurde die 10 bis 50 Mikrometer breite Chemotaxis-Kammer in 64 Kanäle unterteilt, von denen jeder etwa 16 Mikrometer breit war.Nachdem diese Schritte für alle Bilder wiederholt wurden, ergeben sich aus der Gesamtanzahl der Zellen für jeden Kanal über alle Bilder hinweg. Dies ergibt die insgesamt über die Dauer des Experiments in jedem Kanal detektierte Zellanzahl. Berechnen Sie die Chemotaxis, den Verteilungskoeffizienten oder CPC, der die Richtung der Migration darstellt.Indem Sie die folgenden Schritte durchführen, weisen Sie jeder Zelle auf der Seite mit hoher Konzentration bzw. rechts einen Multiplikator von plus eins und jeder Zelle auf der Seite mit niedriger Konzentration bzw. links einen Multiplikator von minus eins zu. Addieren Sie alle multiplizierten Werte und normalisieren Sie diese auf die Gesamtanzahl der detektierten Zellen. Berechnen Sie die Chemotaxis, den Migrationskoeffizienten oder CMC, der die Zellmigration nach der zurückgelegten Distanz gewichtet.Einer Zelle, die sich in den am weitesten entfernten Kanal mit hoher Konzentration, Kanal 64, bewegt, wird ein Gewichtungsfaktor von plus eins zugewiesen, während einer Zelle, die sich zur Hälfte in den Bereich mit höherer Konzentration bewegt, ein Gewichtungsfaktor von plus 0,5 zugewiesen wird. Eine Zelle, die sich in die am weitesten entfernte Position mit niedriger Konzentration bewegt, erhält eine Gewichtung von minus eins. Die Summe aller gewichteten Zellanzahlen wird durch die Anzahl der Zellen normalisiert, um den CMC zu berechnen.Dieses Diagramm zeigt ein lineares Konzentrationsgefälle oder Profil, das in der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat gebildet wird. Die Bildung eines Konzentrationsgradienten wird in dieser Abbildung anhand von blauen und gelben Farbstoffen veranschaulicht. Der Zellzulauf war verschlossen, sodass kein Durchfluss erfolgte, und es ist erkennbar, dass eine Farbskala zwischen Blau und Gelb entsteht.Hier sind Falschfarbenbilder eines repräsentativen Chemotaxis-Experiments, bei dem E. coli RP437 einem Gradienten von null bis 100 Mikromolar L-Aspartat oder null bis 225 Mikromolar Nickelsulfat im Gerät ausgesetzt wurde. Die Migration lebender, grüner Bakterien in Richtung L-Aspartat oder weg von Nickel wurde alle 2,5 Sekunden über einen Zeitraum von 30 Minuten aufgezeichnet. Tote, rot dargestellte Bakterien dienten als Kontrolle für Strömungseffekte im Gerät.Die räumliche Verteilung von RP 4 37 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Abwesenheit eines Gradienten ist in diesem Diagramm im Vergleich zu ihrer Reaktion auf einen Aspartat-Gradienten und einen Nickelsulfat-Gradienten dargestellt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die Chemotaxis von E. coli RP 4 37 in einem Nickelsulfat-Gradienten überwacht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Wirbelbildung der Zellen zu minimieren, damit eine hochbewegliche Subpopulation verwendet werden kann.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

Quelle: Scheidweiler, D., et al. Die Kombination von fluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Quantifizierung der bakteriellen Beweglichkeit durch eine poröse Matrix, die aus zufällig angeordneten Säulen besteht. Fluoreszierend markierte Bakterien werden in das Gerät eingeführt, mikroskopisch...

Beurteilung der bakteriellen Beweglichkeit mit einem mikrofluidischen Gerät

Dieses Video zeigt den Chemotaxis-Assay von Neutrophilen mit einer All-on-Chip-Methode. Die Methode ermöglicht die direkte Isolierung von Neutrophilen aus dem Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion, gefolgt von einem Chemotaxis-Assay auf einem mikrofluidischen Chip.

Eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zur schnellen Chemotaxis-Analyse von Neutrophilen mit Vollblut

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Ein Protokoll zur Erzeugung dynamischer chemischer Landschaften durch Photolyse in mikrofluidischen und millifluidischen Setups wird vorgestellt. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich des Motilverhaltens, der Nährstoffaufnahme oder der Anpassung an Chemikalien von Mikroorganismen, sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene.

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

Hier wird das Protokoll für einen In-situ-Chemotaxis-Assay vorgestellt, ein kürzlich entwickeltes mikrofluidisches Gerät, das Studien des mikrobiellen Verhaltens direkt in der Umwelt ermöglicht.

In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen

Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Erfahren Sie die Quantifizierung bakterieller Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten mit einer mikrofluidischen Vorrichtung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von E. coli RP 4 37 und deren Bewegungsmuster.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

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