Name: Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Lernen Sie die Herstellung und Implantation von Multikanal-Elektroden zur Aufzeichnung neuromuskulärer Aktivität bei Aplysia californica. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Fütterungsverhalten in vivo.

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Wir bedanken uns für die Unterstützung aus dem NIH (NS047073 zu HJC). Wir sind auch dankbar, dass Catherine Kehl für ihre frühen Experimente mit Kwik-Sil, die uns, sie für unsere Anwendung gefördert.

1. Electrode Fabrication <ol><li> So erstellen Sie die Elektrode mit einer Schere ein Stück Emaille-Beschichtung 0,001 Zoll Durchmesser Edelstahldraht ca. 2 Meter lang geschnitten. Bringen Sie einen kleinen Ball aus Kitt an jedem Ende des Drahtes, falten Sie die Kabel in zwei Hälften, und drehen Sie die Enden mit einer Twisted-Pair zu schaffen, eine so genannte Differential-Elektrode. </li><li> Band an beiden Enden des Drahtes zu entwirren zu verhindern. Machen Sie vier differentielle Elektroden, mit einer anderen Farbe des Bandes für jedes Differential Elektrode zum Zwecke der Identifizierung (Abbildung 1A). </li><li> Twist zwei der Differential-Elektroden zusammen, so dass zwei Zoll aufgedreht an einem Ende und 1 Zoll am anderen Ende. Wiederholen Sie mit den restlichen zwei Differential-Elektroden (Abbildung 1B). </li><li> Twist beide Sätze von zwei differenzielle Elektroden zusammen, um sicherzustellen, dass die Enden aufgedreht bleiben. Halten Sie die Elektroden-Einheit und wenden Haushalt Silikonkleber an der Kreuzung der vier Differential-Elektroden, wobei die Enden frei. Hang und damit der Leim für mindestens 4 Stunden (Abbildung 1C) trocken. </li><li> Zur Isolierung der Filialen lag der Elektroden-Einheit nach unten auf eine ebene, beweglich, Oberfläche wie ein Stück Holz. Fan aus den Enden und sichern Sie sie mit Klebeband. Mit einem kleinen Stück Plastik um die Elektroden-Einheit, kurz bevor es Niederlassungen erheben und zu sichern, die mit Klebeband. </li><li> Bei einem Binokular, verwenden Pinzette zur Beschichtung der Filialen mit Silikonkleber. Die 1-Zoll langen Enden wird im Inneren des Tieres sein, so sollten sie eine sehr dünne Schicht Kleber haben. Lassen Sie den Kleber für mindestens 3 Stunden trocknen lassen. </li><li> Kürzen Sie die 1-Zoll langen Ende eines Differential-Elektrode bis zwei Zentimeter. Auf jeden Draht, entfernen 1cm von Silikon-und Schmelz. Locken eine nackte Draht zu einem Haken für die Aufnahme. Biegen Sie den anderen Draht nach oben und weg vom Haken, dies wird als das Erdungskabel dienen. Wiederholen Sie für die restlichen drei Elektroden. </li><li> Wählen Sie eine der vier Elektroden auf dem 2 Zoll zu beenden. Verwenden einer Pinzette zu Silikon kratzen und Email aus, auszusetzen 1cm bloßen Edelstahldraht auf jeder der 2 Drähte. Löten Sie eine Gold-Stecker an jeder der beiden Drähte. Verwenden Sie ein Stück Labor-Band bis zum Ende zu sichern und zu pflegen eine Trennung zwischen dem Boden und Aufnahme Pins. Wiederholen Sie für die restlichen drei Elektroden. </li><li> Bringen Sie einen 1-2cm Ball der Silikon-Kleber, um die Kabel, ca. 1,5 cm von der Hakenende an die Elektroden im Inneren des Tieres zu verankern. Lassen Sie für mindestens 1 Stunde (Abbildung 1D) trocken. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Electrode Assembly Fabrication. (A) Single Differential Elektrode, bestehend aus einem gefalteten und verdreht Draht mit seinen Enden mit Klebeband befestigt. (B) Zwei Differential Elektroden miteinander verdrillt, so dass ungedreht Raum an den Enden. Verschiedenfarbige Band oder eine andere Kennzeichnung sollte verwendet werden, um die Enden zu identifizieren. (C) Alle vier Differential-Elektroden in einem einzigen Elektroden-Einheit bilden, ein einziges Kabel mit getrennten Zweige der einzelnen Elektroden an jedem Ende, mit verschiedenen Farben des Bandes markiert kombiniert. (D) endgültige Form der Elektroden-Einheit. Auf der linken Seite gibt es Haken für Aufnahmen und Masseleitungen für jeden Differentialelektrode geringelt. Auf der rechten Seite, haben Gold Anschlusspins zu den Drähten wurden für den Anschluss an den Verstärker gelötet. Eine Verankerung Kugel aus Silikon-Kleber hat auch in Richtung der linken Seite der Baugruppe platziert. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere für die Implantation <ol><li> Wählen Sie ein gesundes Tier, das etwa 350-450g wiegt. In Reaktion auf kleine Algen, sollte das Tier beißt in Abständen von 3 bis 5 Sekunden. Die komplette Chirurgie mit Elektrodenimplantation sollte etwa eine Stunde dauern. </li><li> Um das Tier zu betäuben, spritzen sie mit 30% w / v isotonischer MgCl 2. Um zu verhindern, der Verlust der Hämolymphe und MgCl 2, kann der Injektionsstelle in Sekundenkleber vor dem Entfernen der Nadel überzogen werden. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung, wie das Tier für Elektrodenimplantation wird merken, und die Lage des Einschnitts (angezeigt durch ein bar). </li><li> Legen Sie den narkotisierten Tier in einer Dissektion Tablett mit dem Fuß nach unten. Mit Blick auf das Tier den Kopf auf, Verschiebung der Kiemen-Bereich auf der linken Seite, so dass das Tier teilweise auf seiner Seite und lehnte ab. Pin auf der vorderen Tentakeln (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie das Tablett auf der Bühne eines Binokular. Prop das Tablett auf ca. 20 Grad-Winkel auf den Kopf zu erheben und sammeln Sie die Hämolymphe in den Schwanz, weit weg von den Einschnitt. </li><li> Mit Dissektion Schere, starten Sie einen Schnitt leicht nach rechts von der Augenfleck und erweitern es 1 bis 1,5 cm nach vorn. Verwenden Sie Retraktoren, an den Kanten des Tabletts den Einschnitt offen zu halten (Abbildung 2; beachten Bar in der Nähe eyespot Angabe Schnitt). </li><li> Zur Freilegung der bukkalen Masse, verwenden ForcePs zu heben das klare Membran unter der Haut und mit einer Schere, um eine Öffnung passend zur wichtigsten Einschnitt geschnitten. Tuck die Ränder der Membran in die Retraktoren. </li></ol> 3. Elektrodenimplantation <ol><li> Platzieren Sie die Elektroden-Einheit auf einem Mikromanipulator und bewegen Sie ihn über das Tier Einschnitt. </li><li> Die radular Nerv ist am schwierigsten zu zugreifen, und sollte zuerst angegangen werden. Es gibt zwei Möglichkeiten für den Zugriff auf die radular Nerven. </li><li> Die erste Option, was bevorzugt ist, wird unter der bukkalen Ganglion zwischen BN1 und BN2 aussehen. Wenn ein Zweig der radular Nerven sichtbar ist, verwenden Sie spitzen Pinzette gebogen in einen Haken zu heben aus der Branche (Abbildung 3, Schleife von RN unter Ganglion bezeichnet 1). </li><li> Wenn ein Zweig der radular Nerven nicht zugänglich ist über dem Muskel, wird eine zweite Option, um sie über einen kleinen Einschnitt in I2 neben dem Bindegewebe an der Basis der bukkalen Ganglion (Abb. 3, RN unter Muskel bezeichnet 2) zugreifen. Der Einschnitt in I2 muss durch zwei Lagen des I2 Muskel gehen. Halten Sie an den Rand des Muskels Schnitt mit geraden Pinzette und verwenden Sie den Haken Zange herauszuziehen ein RN Branche. </li><li> Halten Sie die Nerven mit dem Haken Zange, eine andere Reihe von Zangen an der Elektrode Haken auf die Nerven zu manipulieren. </li><li> Verwenden Sie den Mikromanipulator an den Haken zu erhöhen, so dass der Nerv sich weg von der bukkalen Masse abgehoben und frei von jeglichen anderen Nerven oder Gewebe. Nicht überdehnen den Nerv. </li><li> Trocknen Sie die Elektrode mit einem Kim-Wipe oder Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit mit einer Spritze. Wasser Spannung kann dazu führen, den Mut, sich zusammenstürzen, oder ein Wasser-Dichtung unter dem Nerven bilden. In jedem Fall sollte die Fläche vollständig getrocknet sein, bevor Klebstoff aufgetragen wird. </li><li> Tragen Sie eine kleine Klecks Sekundenkleber, wo die Basis des Hakens ist in Kontakt mit dem Boden des Nervs. Tragen Sie einen Tropfen von Aplysia Kochsalzlösung oder Hämolymphe der Sekundenkleber gesetzt. Wenn der Kleber nass ist nichts als sollte verschoben werden immer Leim zwischen Draht und Nerven blockieren würde die elektrische Verbindung. </li><li> Trocknen Sie die Haken wieder. Mix Kwik-Sil Kleber auf einen Eisbeutel. </li><li> Verwenden Sie die Spitze eines Stiftes, eine kleine Menge des Kwik-Sil Kleber gelten, vollständig bedecken freiliegende Leiter des Hakens, aber nicht das Erdungskabel. </li><li> Lassen Sie den Kleber für ca. 5 Minuten eingestellt, Nachjustierung der Leim, wenn sie wegzieht von Teilen der Haken. Der Leim wird gesetzt, wenn es nicht mehr klebt, wenn sie mit dem Stift berührt (Abbildung 4 zeigt die endgültige Konfiguration). </li><li> Sobald die radular Nerven Elektrode eingestellt ist, kann der I2 Muskel zugegriffen werden. Im Bereich zwischen BN1 und BN2, die süchtig Pinzette Haken und 2 Bänder des I2 Muskel vom Rest des Muskels getrennt durch leichtes Ziehen die Bands nach oben. Befestigen Sie die Elektrode mit dem gleichen Verfahren. </li><li> Bukkalen Nerven 2 und 3 sind leicht zugänglich und Elektroden sind mit dem gleichen Verfahren angebracht. </li><li> Nachdem alle Elektroden angebracht sind, schieben Sie die Elektroden-Einheit in das Tier bis das Silikon zu verankern. </li><li> Suture der Einschnitt verschlossen um den hervorstehenden Elektrodenkabel, halten die Anker in das Tier. Sekundenkleber die Stiche, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die Gold-Anschlussstecker am anderen Ende der Elektrode in einem kleinen Block aus Styropor. Zurück das Tier an den Haupttank in einem belüfteten Isolation Behälter für Erholung über Nacht. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein Diagramm der Aplysia Zuführvorrichtung als die bukkale Masse bekannt. Dargestellt sind die bukkalen Nerven (BN1, BN2, BN3), die radular Nerven (RN), die Ausgänge der Unterseite des bukkalen Ganglion, dann taucht unter dem Muskel, und die Lage auf dem I2 Muskel, wo die Elektroden angebracht ist. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Schematische Darstellung der einzelnen Elektrode an einen Nerv (oder Muskel) und verklebt. Beachten Sie, dass die de-isolierten Region des gewellt Haken in direkten Kontakt mit den Nerven (oder Muskel), an Stelle mit Sekundenkleber verankert ist, und elektrisch von dem fluiden Medium mit Kwik-Sil isoliert. Beachten Sie auch, dass die deinsulated Spitze der Masseelektrode, um das flüssige Medium ausgesetzt ist. 4. Aufnahme <ol><li> Akklimatisieren das Tier in einem belüfteten Behälter während des Kontrollgeräts für mindestens 1,5 Stunden angebracht. Monitor das Signal, während das Tier gewöhnen, um sicherzustellen, dass alle Elektroden arbeiten und dass das Geräuschniveau niedrig sind. </li><li> Verwenden Sie eine Videokamera an Fressverhalten aufzeichnen, während Sie den Computer auf Signale von der Nerven-und Muskel-Elektroden aufnehmen. Synchronisieren Sie die Video-und Elektroden-Aufnahmen mit einem Rechtecksignal, dass ein digitaler Zähler in die Kamera-Ansicht steuert, während es gleichzeitig als zusätzlicher Kanal auf dem Computer in Axosc aufgezeichnetOPE. </li><li> Feeding Verhaltensweisen sind von den Techniken in Morton und Chiel 1993 beschrieben ausgelöst. </li></ol> Obwohl wirbellosen Tieren nicht eine formelle Genehmigung durch eine institutionelle Nutzung von Tieren und Pflege Ausschuss haben wir sichergestellt, dass alle Behandlungen der Aplysia Schaden zu minimieren und Leiden für das Tier, und dass alle chirurgischen Techniken sind fertig, während das Tier vollständig betäubt. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. (A) Gleichzeitige Vier-Kanal-Aufnahmen aus einem Muskel (dem Winkelmesser Muskel I2), und aus drei bukkalen Nerven (die radular Nerven, RN, N. buccalis 2, BN2 und N. buccalis 3, BN3) während eines Schlucken Antwort. (B) ein Standbild aus der gleichzeitigen Video-Aufzeichnung der frei verhalten Tier, als es schluckt eine vorgeschnittene Algen Streifen (0,5 cm in der Breite), die bei 0,5 cm Abstand mit weißen Bändern markiert wurde, so dass seine Bewegungen können leicht sichtbar gemacht werden, wie der Tierfutter.

<ol><li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li>
<li>Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nbsp%3BNeuromechanics+of+multifunctionality+during+rejection+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica.</a> J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).</li>
</ol>

Eine wichtige Innovation, die aus diesen Aufnahmen bewährt hat sich die Kombination der Elektroden in einem Kabel. Zwei Elektroden Aufnahmen wurden bereits verwendet, sondern baut auf vier einzelnen Elektroden führte zur Bildung von chirurgischen Adhäsionen, die oft verhindert das Tier aus machen normale Fress-Bewegungen. Die Kombination der Elektroden in einem Kabel reduziert die Masse der Elektroden im Inneren des Tieres, das wiederum reduziert die Immunantwort und ermöglicht es dem Tier, sich freier zu bewegen. <...

<table><tbody><tr><td>Edelstahldraht mit Emailbeschichtung</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>0.001D, Beschichtung h</td></tr><tr><td>Silikonkleber für den Hausgebrauch, Typ II</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil-Klebstoff</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duro Qwik-Gel-Superkleber</td><td>Henkel Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verstärker A-M Systems Modell 1700</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Filtereinstellungen: 100–1000 Hz für Nerven, 10–1000 Hz für I2-Muskel</td></tr><tr><td>Axoscope 10.1</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold-Steckkontakte, Stifte</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Gold-Steckkontakte, Buchsen</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr></tbody></table>

electrode herstellung und implantation in aplysia californica für multi-channel-neuro-und muskel-recordings in intact, frei behaving tiere

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Aufnahme von wichtigen Nerven und Muskeln<em&gt; Aplysia</em&gt; Während der Fütterung Verhalten ermöglicht es uns, die Muster der neuronalen Kontrolle in einer intakten Tier zu studieren. Gleichzeitig Aufnahme von mehreren Nerven und Muskeln gibt präzise Auskunft über den Zeitpunkt der neuronalen Aktivität. Vorherige Aufnahme Methoden sind für zwei Elektroden gearbeitet, aber die Studie von zusätzlichen Nerven oder Muskeln benötigt die Kombination und die Mittelung der Aufnahmen von mehreren Tieren, die es schwierig, feine Details von Timing-und Ausstieg zu bestimmen hat, weil der Variabilität aus der Reaktion auf Ansprechen, und von Tier zu Tier. Die Implantation vier einzelnen Elektroden hat eine sehr niedrige Erfolgsquote aufgrund der Bildung von Verwachsungen, dass die Tiere von der Durchführung normaler Fütterung Bewegungen zu verhindern. Wir entwickelten eine neue Methode zur Herstellung Elektrode, dass der Großteil der Elektroden im Inneren des Tieres ermöglicht für die normale Ernährung Bewegungen reduziert. Mit einer Kombination von Klebstoffen zu den Elektroden führt zu einer zuverlässigen Isolierung der Elektrode, die länger dauert legen, die es ermöglichen, für einen Zeitraum, solange in der Woche aufzunehmen. Die Herstellungstechnik, die wir beschreiben, könnte erweitert werden, um mehrere zusätzliche Elektroden enthalten sein, und wäre für Wirbeltiere.

Eine Technik ist für die Implantation vier beschriebenen<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroden auf die neuromuskuläre Kontrolle der Fütterung Verhalten im Monitor<em&gt; Aplysia californica</em&gt;.

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Die Ableitung von Signalen aus zentralen Nerven und Muskeln von Aplysia während des Fressverhaltens ermöglicht es uns, die Muster der neuralen Steuerung in einem intakten Tier zu untersuchen.

Um die Elektrodenanordnung für multikanalige In-vivo-Aufnahmen herzustellen, werden vier differentielle Elektroden angefertigt und zusammengedreht, wobei die einzelnen differentiellen Elektroden am Ende auseinandergeführt werden. Am Ende wird das anästhesierte Tier fixiert und ein Schnitt seitlich neben dem Augenfleck vorgenommen. Die Zielnerven und -muskeln werden lokalisiert, und die Elektroden werden an dem Tropfen Supergleber an der Basis des Hakens befestigt und anschließend mit Schnellversiegelungsmittel isoliert.Hallo, ich bin Miranda Collins aus dem Labor von Dr. Halal Thiel aus dem Fachbereich Biologie der Kiss Western Reserve University. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Herstellung und Implantation von Elektroden für In-vivo-Ableitungen in SIA, Kalifornien. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die neuromuskuläre Steuerung der Nahrungsaufnahme und von SIA zu untersuchen.Beginnen wir. Um die Elektrode herzustellen, schneiden Sie mit einer Schere ein etwa zwei Fuß langes Stück Emaille-beschichteten Edelstahldraht mit einem Durchmesser von 0,001 Zoll ab. Befestigen Sie an jedem Ende des Drahts einen kleinen Klecks Knetmasse.Biegen Sie den Draht in der Mitte und verdrehen Sie die Enden, um ein verdrilltes Paar zu bilden, das als Differenzelektrode bezeichnet wird. Kleben Sie beide Enden des Drahtes fest, um ein Aufwickeln zu verhindern. Stellen Sie vier Differenzelektroden her, wobei für jede Differenzelektrode eine andere Farbe Klebeband verwendet wird.Zur Identifikation werden zwei der Differenzelektroden miteinander verdrillt, wobei an einem Ende zwei Zoll und am anderen Ende ein Zoll nicht verdrillt bleiben. Wiederholen Sie dies mit dem verbleibenden Paar von Differenzelektroden. Verdrillen Sie beide Paare von Differenzelektroden miteinander, wobei sichergestellt werden muss, dass die Enden unverdrillt bleiben.Halten Sie die Elektrodenanordnung hoch und tragen Sie Haushalts-Silikonkleber an der Verbindungsstelle der vier Differenzelektroden auf, wobei die Enden frei bleiben. Hängen Sie sie auf und lassen Sie den Kleber mindestens vier Stunden trocknen. Um die Äste zu isolieren, legen Sie die Elektrodenanordnung auf eine flache, bewegliche Unterlage, beispielsweise ein Stück Holz.Verwenden Sie ein kleines Stück Plastik, um die Elektrodenanordnung direkt vor der Verzweigung anzuheben, und befestigen Sie dies mit Klebeband. Spreizen Sie die Enden auseinander und sichern Sie sie mit Klebeband. Benutzen Sie unter dem Stereomikroskop eine Pinzette, um die Verzweigungen mit Silikonkleber zu überziehen.Die einen Zoll langen Enden befinden sich im Inneren des Tieres und sollten daher mit einer sehr dünnen Klebeschicht versehen sein. Lassen Sie den Klebstoff mindestens drei Stunden lang trocknen. Verkürzen Sie das einen Zoll lange Ende einer differentiellen Elektrode an jedem Ende der Elektrode auf zwei Zentimeter.Verwenden Sie eine Pinzette, um Silikon und Isolack von beiden Drähten abzukratzen. Um einen Zentimeter blanken Draht freizulegen, wickeln Sie einen blanken Draht zu einem Haken zur Aufnahme auf. Führen Sie dann den anderen Draht nach oben und weg vom Haken, um als Masseleitung zu dienen; an dem zwei Zoll langen Ende wird an jeden Draht eine goldene Anschlussnadel gelötet.Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um das Ende zu sichern und einen Abstand zwischen Erdungs- und Ableitungsstiften zu gewährleisten. Wiederholen Sie diese Schritte, sodass an allen vier differenziellen Elektroden Haken und goldene Anschlüsse angebracht sind. Befestigen Sie eine Kugel aus Silikonkleber von ein bis zwei Zentimeter Durchmesser am Kabel etwa 1,5 Zoll vom Hakenende entfernt.Um die Elektroden in einem Tier zu verankern, das mindestens eine Stunde lang trocknen durfte, wählen Sie ein gesundes Tier mit einem Gewicht von etwa 350 bis 450 Gramm, das auf kleine Algenstücke reagiert. Das Tier sollte alle drei bis fünf Sekunden Bissbewegungen erzeugen. Die vollständige Operation mit der Implantation der Elektroden sollte etwa eine Stunde dauern.Legen Sie das anästhesierte Tier mit dem Fuß nach unten und dem Kopf nach vorne in ein Präparationsgefäß. Drehen Sie den Kiemenbereich nach links, sodass das Tier teilweise seitlich liegt und sich leicht nach außen neigt, und fixieren Sie die vorderen Tentakel. Stellen Sie das Gefäß auf den Objekttisch eines Stereomikroskops.Stellen Sie das Tablett in einem Winkel von etwa 20 Grad hoch, um den Kopf anzuheben und die Hämolymphe im Schwanzbereich von der Schnittstelle weg mit einer Schere zu sammeln. Beginnen Sie einen Schnitt leicht rechts vom Augenfleck und führen Sie ihn um ein bis 1,5 Zentimeter in Richtung Kopf fort. Verwenden Sie Ihre Traktoren. Befestigen Sie sie an den Rändern des Tabletts, um den Schnitt offen zu halten.Um die Buccalamasse freizulegen. Heben Sie mit einer Pinzette die durchsichtige Membran unter der Haut an und schneiden Sie mit einer Schere eine Öffnung, die der Hauptinzision entspricht. Legen Sie die Ränder der Membran in die Retraktoren. Platzieren Sie die Elektrodenanordnung auf einem Mikromanipulator und bewegen Sie sie über den Einschnitt des Tieres. Für jede der vier Elektroden dauert die Befestigung etwa 10 bis 15 Minuten; zuerst wird der Zugang zu den Nerven gezeigt, gefolgt von der Befestigung der Elektrode am endgültigen Nerv. In der Praxis sollte jedoch jeder Nerv an eine Elektrode angeschlossen werden, bevor der nächste Nerv freigelegt wird.Der ular-Nerv ist am schwierigsten zu erreichen und sollte zuerst angegangen werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, auf den ular-Nerv zuzugreifen. Die erste, bevorzugte Möglichkeit besteht darin, unterhalb des Buccalganglions zwischen BN eins und VN zwei zu schauen.Falls ein Zweig des ular-Nervs sichtbar ist, heben Sie den Zweig mit einer fein zulaufenden, zu einem Haken gebogenen Pinzette an. Falls ein Zweig des ular-Nervs oberhalb des Muskels nicht zugänglich ist, besteht eine zweite Möglichkeit darin, über einen kleinen Schnitt in I zwei neben dem Bindegewebe an der Basis des Buccalganglions darauf zuzugreifen. Der Schnitt in I zwei muss durch zwei Schichten des I-zwei-Muskels verlaufen, um eine Elektrode an I zwei anzubringen.Verwenden Sie die hakenförmige Pinzette, um die beiden Bänder des I. zwei Muskelzugangs zum zweiten bukkalen Nerv hier anzuheben und zu trennen. Der dritte bukkale Nerv befindet sich hier und wird verwendet, um die Elektrodenanbringung zu demonstrieren. Alle Elektroden werden auf dieselbe Weise angebracht, wie nun am dritten bukkalen Nerv gezeigt.Wenn der Nerv an der Pinzette hängt, verwenden Sie eine weitere Pinzette, um mithilfe des Mikromanipulators einen Elektrodenhaken am Nerven anzubringen. Heben Sie den Haken an, sodass der Nerv angehoben und vom Buccalorgan weggeführt wird. Achten Sie darauf, dass keine anderen Nerven oder Gewebe mit angehoben werden; heben Sie so wenig wie möglich an, etwa einen halben Zentimeter oder weniger.Um eine Überdehnung des Nervs zu vermeiden, verwenden Sie ein Kim-Tuch, um die Elektrode und den angrenzenden Bereich des Nervs abzutrocknen. Ein Insektenpin wird verwendet, um den Kleber aufzutragen, und befestigen Sie die Elektrode mit einem kleinen Tropfen Sekundenkleber an der Stelle, an der die Basis des Hakens mit dem Boden des Nervs in Kontakt steht. Geben Sie einen Tropfen Alysia-Salzlösung oder Hämolymphe auf, um den Sekundenkleber zu fixieren.Dann trocknen Sie den Haken rot auf einer Kühltaschenmischung. Schnellverschlusskleber. Dadurch bleibt der Kleber etwa 30 Minuten lang verarbeitbar.Weitere Mischungen können im Verlauf der Operation erforderlich sein. Verwenden Sie die Insektennadel, um jeden freiliegenden Draht der Hakenelektrode mit einer kleinen Menge Schnellversiegelung vollständig abzudecken. Vermeiden Sie dabei den Masse draht.Lassen Sie den Kleber fünf Minuten lang aushärten. Korrigieren Sie den Kleber neu. Wenn er sich von dem Haken löst, warten Sie, bis der Kleber trocken ist, bevor Sie auf den nächsten Nerv zugreifen.Nachdem alle Elektroden angebracht sind, schieben Sie die Elektrodenanordnung bis zum Silikonanker in das Tier hinein. Nähen Sie die Inzision um das hervorstehende Elektrodenkabel herum zu. Um den Anker im Inneren des Tieres zu belassen, kleben Sie die Nähte mit Sekundenkleber fest, um eine gute Abdichtung sicherzustellen.Stecken Sie die goldenen Anschlusskappen am anderen Ende der Elektrode in einen kleinen Styroporblock. Bringen Sie das Tier zur Erholung über Nacht in einen belüfteten Isolierbehälter im Hauptbecken zurück. Akklimatisieren Sie das Tier mindestens 1,5 Stunden lang in einem belüfteten Behälter, während es an die Aufnahmegeräte angeschlossen ist.Überwachen Sie das Signal, während sich das Tier akklimatisiert, um sicherzustellen, dass alle Elektroden funktionieren und die Rauschpegel niedrig sind. Verwenden Sie eine Videokamera, um das Fressverhalten aufzuzeichnen, während Sie mithilfe des Computers Signale von den neuronalen und muskulären Elektroden aufzeichnen. Synchronisieren Sie die Video- und Elektrodenaufzeichnungen mithilfe eines Rechteckwellensignals, das einen digitalen Zähler im Kamerabild steuert, während es gleichzeitig als zusätzlicher Kanal am Computer aufgezeichnet wird.Bei der Fütterung zeigt sich im Auge des Tieres ein Aktivitätsanstieg in den Nerven und Muskeln. Hier sehen Sie ein Beispiel für ein Schluckmuster mit EMG-Aktivität von I zwei sowie ENG von RN BN zwei und BN drei. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Multikanalelektroden herstellt und implantiert, um die neuronale und muskuläre Aktivität während des Fressverhaltens bei frei beweglichen Sia aufzuzeichnen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Sie den Nerv sorgfältig behandeln und sicherstellen, dass die Ableithaken vollständig versiegelt sind, sodass kein Draht freiliegt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Lernen Sie die Herstellung und Implantation von Multikanal-Elektroden zur Aufzeichnung neuromuskulärer Aktivität bei Aplysia californica. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Fütterungsverhalten in vivo.

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere (Video) | JoVE Journal

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

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