Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

Das Ziel der Präsentation ist es, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Herstellung von MASI mit para-Oxiden markierten HMEs zur Verfolgung einer stammzellbasierten Therapie zu demonstrieren. Für die MR-Bildgebungsmarkierung wird das Medium hergestellt, einem T-75-Fläschchen zugegeben und vier Stunden lang inkubiert. Anschließend werden die Zellen abgelöst, trypsiniert und gewaschen.

Dreimal nach dem Waschen werden die Zellen resuspendiert und Agros-Gel wird dem Reagenzglas hinzugefügt. Nun sind die Zellen bereit für die Implantation in Knorpeldefekte. Hallo, ich bin Alex.

Ich benötige die Wiederholung aus dem Labor von High Delta Blink, dem Kontrastmittel-Labor in der Abteilung für Radiologie an der University of California San Francisco. Ich bin Lydia Men. Ebenfalls aus dem Kontrastmittel-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Markierung von hämatopoetischen Stammzellen mit Eisenoxid-Nanopartikeln, um Zellaggregat-Konstrukte herzustellen, und zur Implantation dieser Konstrukte in Knorpeldefekte. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um mesenchymale Stammzellen nichtinvasiv mittels Magnetresonanztomographie zu verfolgen. Beginnen wir also.

Zunächst werden die Zellen mindestens 18 Stunden lang bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert. Währenddessen wird das Markierungsmedium vorbereitet, sodass es bereitsteht, sobald die Zellen konfluent sind. Dazu werden dem Beispiel End Durum in einer Dosis von 100 Mikrogramm Eisen pro Milliliter serumfreiem Medium zugesetzt.

Nachdem die Zellen bis zur Konfluenz angezüchtet wurden, das Kulturmedium abpipettieren und die Zellen mit PBS oder serumfreiem Medium waschen. Anschließend die Spüllösung abpipettieren und das vorbereitete Markierungsmedium hinzufügen. Die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Nach der vierstündigen Inkubation das Markierungsmedium abziehen. Die Zellen mit PBS und anschließend mit Trypsin-Eis waschen. Sobald tryis, die Zellen dreimal mit PBS waschen und bei 400 RCF fünf Minuten lang zentrifugieren.

Nach diesem Waschschritt resuspendieren, die Zellen suspendieren, sie zählen, ihre Vitalität beurteilen und sie schließlich je nach Bedarf für Experimente verwenden. Nun sehen wir uns an, wie man matrixassoziierte Stammzellimplantate herstellt. Beginnen Sie damit, eine frische Agaroselösung herzustellen.

Nachdem das Agros auf 42 Grad Celsius abgekühlt ist, zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und mischen die Zellen mit Dobe Echo's modifiziertem Eagles Medium, um eine Konzentration von 30 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen, bevor Sie die Zellen mit dem warmen Agros mischen. Erwärmen Sie die Pipettenspitze vor, indem Sie heißes, steriles PBS mehrmals auf- und abpipettieren. Dies verhindert, dass das Agros in der Spitze gerinnt.

Anschließend die gleiche Menge Aros wie Medium aufnehmen und gründlich mit der Zellsuspension vermischen, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine Blasen entstehen. Während des Mischvorgangs das Einor-Röhrchen in einem vorgewärmten Wasserbad belassen, damit das Agros nicht so stark abkühlt, dass es verfestigt, sobald die Suspension homogen ist. Die Zellen werden in den Defekt eingebracht und sind nun bereit für die MR-Bildgebung.

Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse, zunächst zu unserer Markierungstechnik und anschließend zu unserer Implantationstechnik. Nach der Markierung weisen die Zellen in den Kolben weiterhin das gleiche Aussehen wie die unmarkierten Zellen auf. Wie erwartet bleibt die Vitalität der markierten Zellen unverändert, wie der Caspase-3-Test zeigt.

Die Kombination von markierten Zellen mit Agros führt zu einem Signalverlust in den Implantaten, wie in T2-gewichteten MRT-Bildern zu sehen ist; nicht markierte Zellen zeigen kein Signal. Bei Schnitten von Zell-Agros-Konstrukten mit Abnahme der Zellzahl ergibt sich eine Färbung mit Berliner Blau. Bestätigen Sie die intrazelluläre Eisenakkumulation.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man mesenchymale Stammzellen mit dem Eisenoxid-Nanopartikel Endorem markiert, wie man Agros-Konstrukte mit den markierten Zellen herstellt und wie man diese in Knorpeldefekte einpflanzt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Pipettenspitze vor dem Hinzufügen von warmem Aros zur Zellsuspension vorzuwärmen.

Es ist außerdem entscheidend, dass bei der Mr.Bildgebung die Bildung von Blasen vermieden wird. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.