Name: Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie die künstliche Besamung bei Mäusen zur Reproduktionsbiologie und Transgenforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Zeitplanung bei der Zucht und den Einsatz von gefrorenem Sperma.

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Ich möchte Mike Dewey vom Peromyscus Genetic Stock Center für seine wertvolle Einblicke, Geduld und Wissen auf Nagetier-Reproduktion zu danken.

Künstliche Befruchtung Künstliche Befruchtung wird anstelle der natürlichen Paarung, um die Chancen, dass alle Frauen geworden sind wird schwanger zu erhöhen. 2 männliche wurde für alle 1 superovulierten Weibchen oder ein Weibchen bekannt, in Östrus verwendet werden. Die caudae Nebenhoden von reifen männlichen Mäusen wurden in einer 9% Milch Suspension gegeben und offen mit 18-Gauge-Nadel in Scheiben geschnitten. Das Sperma wurde erlaubt, sich frei zu schwimmen ein paar Minuten und dann den Nebenhoden wurden aus dem Gemisch entnommen. Die Suspension wurde mit einem Mikroskop für Zusammenfluss und beweglichen Spermien untersucht. Eine stumpfe 22 Gauge 1 ½ Zoll lange Nadel verwendet wurde, um die Spermien zu verwalten. A 120 °-Bogen war etwa 3 / 4 th dem Weg nach unten die Nadel gesetzt. 0.05mls injiziert - Die Nadel wurde in die Vagina bis zur Kurve und 0,025 eingesetzt. Wenn ein Assistent wird verwendet, um das Weibchen in die entsprechende Position zu halten, ist der Einsatz von Anästhetika nicht benötigt. Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie 4 Rüden für 6 Frauen </li><li> Euthanize Männchen das Vivarium </li><li> Bereiten Sie ca. 5 ml 9% Milch aus Milchpulver </li><li> Legen Sie 1,5 ml in kleine Petrischale </li><li> Schneiden Sie die Nebenhoden und Samenleiter </li><li> Legen Sie in 1.5ml von 9% Milch </li><li> Mit zwei 18-Gauge-Nadel und mit langen Schneiden Bewegung mit Nadeln, aufschneiden der Nebenhoden und Samenleiter die Spermien Release </li><li> Nehmen Sie links über Gewebe und prüfen Spermien unter dem Mikroskop </li></ol> Injektion <ol><li> Verwenden Sie stumpfen Nadel bei 120 ° Winkel </li><li> Halten Sie die Maus in der Hand und spritzen Mischung. Bei Unwohlsein mit einer Person, und die Injektion können zwei Personen genutzt werden. Keine Narkose sollte verwendet werden, da auf einer weiß, wie diese könnte das Verfahren zu beeinflussen. </li><li> Verwenden Sie 0,05 ml der Spermien / Milch-Mix pro Weibchen </li></ol> Empfänger Weibchen <ol><li> Sie Vaginalabstrich auf Empfänger Weibchen (bis zu diesem Zeitpunkt den Empfänger Weibchen sollten in Proöstrus / Östrus werden) </li><li> Frauen, die nicht Östrus wurden von Tag 5 erreicht, sollten Sie vielleicht nicht verwendet </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Petri-Schale</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 18 G</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Millipulver</td><td>Reagenz</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 1 mL</td><td>Werkzeug</td><td>National Scientific Company</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphatgepufferte Salzlösung</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe Nadel, 22 G</td><td>Werkzeug</td><td>Give to me</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting sperma und künstliche besamung von mice

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Nagetiere der Gattung Peromyscus (Reh-Mäuse) sind die am weitesten verbreitete Muttersprache in Nordamerika Säugetiere. Peromyscus Arten sind in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Toxikologie, Epidemiologie, Ökologie, Verhaltens-und genetischen Studien verwendet. Hier sind sie ein nützliches Modell für die Demonstrationen der künstlichen Besamung. Methoden ähnlich denen hier angezeigten zuvor in mehrere Hirsche Maus-Studien verwendet wurde, noch keine detaillierten Protokoll veröffentlicht worden. Hier zeigen wir die grundlegende Methode der künstlichen Befruchtung. Dieses Verfahren beinhaltet das Extrahieren der Hoden aus dem Nagetier, dann Isolierung der Spermien aus dem Nebenhoden und Samenleiter. Die reifen Spermien, jetzt in einem Milch-Gemisch, werden in den weiblichen Genitaltrakt auf die Zeit des Eisprungs platziert. Die Befruchtung wird als Tag 0 für Timing der Entwicklung des Embryos gezählt. Embryonen können dann zur gewünschten Zeit-Punkt abgerufen und manipuliert werden. Künstliche Befruchtung kann in einer Vielzahl von Nagetieren, wo genau Embryo Timing ist entscheidend, oder schwer zu bekommen verwendet werden. Diese Technik ist von entscheidender Bedeutung für Arten oder Stämme (darunter die meisten Peromyscus), die sich nicht paaren können sofort und / oder wo Paarung ist schwer zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die künstliche Besamung genaue Zeitpunkt für die Entwicklung des Embryos entweder in Abbildung Entwicklungsfortschritte und / oder transgene Arbeit. Reduzierte Anzahl von Tieren verwendet werden, da die Befruchtung gewährleistet ist. Diese Methode wurde entscheidend für die Förderung der Peromyscus System, und wird hoffentlich profitieren auch andere.

Dieses Protokoll zeigt Methoden zur Gewinnung von Spermien aus den Hoden der Männchen und dann Besamung weiblichen Mäusen. Dieses Verfahren ist nützlich, wenn die genaue Zeit in entwicklungspsychologischen Studien sowie transgene Arbeit benötigt wird.

Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice

Nagetiere der Gattung Peromyscus (Waldmäuse) sind die am weitesten verbreiteten heimischen nordamerikanischen Säugetiere. Peromyscus-Arten werden in einem breiten Spektrum der Forschung eingesetzt ...

Mein Name ist Amanda Dli aus dem Labor von Dr. Paul Verana an der University of California Irvine. Heute werde ich das Verfahren der künstlichen Befruchtung demonstrieren. Dabei wird das Sperma vom Männchen entnommen und anschließend in ein ovulierendes Weibchen eingeführt.Der Grund dafür, dass Sie dies tun möchten, könnte darin liegen, dass das Männchen und das Weibchen möglicherweise nicht zu dem Zeitpunkt paaren, zu dem Sie dies benötigen, oder dass sie überhaupt nicht paaren. Auch hier kann dies mit gefrorenem Sperma verwendet werden, falls eine Mauslinie von großer Bedeutung ist. Dieses Verfahren ist sehr wichtig, um es demonstriert zu sehen, da viele Handbücher und Fachzeitschriften die korrekte Vorgehensweise beim Umgang mit der Maus nicht zeigen.Die Maus kann von einer Person gehandhabt und injiziert werden, ohne dass bei dem Weibchen ein Anästhetikum verwendet wird. Dies bedeutet, dass das Weibchen in keiner Weise verletzt wird, und stellt sicher, dass die Befruchtung auf dem bestmöglichen Weg verlaufen kann. Die verwendeten chirurgischen Instrumente sind zwei Paar scharfe Pinzetten und ein Paar scharfe Scheren.Diese werden verwendet, um die beste Differenzierung im gesamten Hoden- und Fettgewebe zu isolieren. Danach werden wir die Pinzette verwenden, um den Nebenhoden zu isolieren. 9% Milch wird verwendet, um die Spermien in das Weibchen zu befördern.Es besteht aus einem XPBS, das in Milchpulver aus dem örtlichen Lebensmittelgeschäft enthalten ist. Dieses wird in eine kleine Petrischale in isolierter Form gegeben, sodass sich die Spermien in einem begrenzten Bereich befinden. Mit Nadeln der Größe 18 gauge wird das Nebenhoden gewebe aufgeschnitten, damit die Spermien in die 9%-Milchlösung der Petrischale hinausschwimmen können.Ein Präparat, bei dem die in einer 9 %igen Milchlösung gefundenen Spermien mit einer stumpfen Nadel mit 22 Gauge und einem Winkel von 120 Grad aufgenommen werden. Diese ist an eine Ein-Milliliter-Spritze angebracht, woraufhin 0,025 Milliliter in das Weibchen der Erdnussmaus, beziehungsweise das Nagetier Polyus rodentis, injiziert werden. Para cus sind tatsächlich das häufigste endemische nordamerikanische Säugetier; Polyus ist in der südöstlichen Region Floridas der Vereinigten Staaten verbreitet.Wie Sie sehen können, sind die Augen etwas größer als bei Mus musculus. Außerdem weist es ein helleres Fell auf, was ebenfalls dazu beiträgt, sich in die Sanddünen der Region Florida einzufügen.Ich werde nun die gesamte Hodenregion dieser Maus isolieren. Sie ist hier ein Jahr alt, da bekannt ist, dass sie in Gefangenschaft bis zu vier Jahre alt werden kann. Die Lebensdauer ist in Gefangenschaft tatsächlich unbekannt, da sie bis zu sieben Jahre lang überlebt haben.Der erste Schritt besteht darin, den unteren Bereich dieses Männchens mit 70 % Ethanol zu benetzen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Haare nicht im Weg liegen. Wie Sie sehen können, sind die hier sichtbaren Ausbuchtungen die Hoden.Ich werde einen Schnitt durch die äußere Hautschicht führen, einen kleinen Schnitt an der inneren Wand vornehmen und sehr große horizontale Schnitte ausführen. Eigentlich empfinde ich es an dieser Stelle als einfacher, die Hoden einfach herauszudrücken, da das Fettgewebe sehr groß und gut sichtbar ist. Sobald die Hoden herausragen, sollten zwei Schnitte gesetzt werden: einer nahe dem Fettgewebe, um dieses abzutrennen, und ein weiterer unterhalb des Nebenhodens, der die Verbindung zur gegenüberliegenden Wand darstellt; dabei sollte tief genug angeschnitten werden, um den Nebenhoden nicht zu verletzen.Die Hoden bestehen aus diesem großen Geflecht hier. Zusätzlich findet man den Nebenhoden, der sich hier entlangzieht und den Hoden bis zu dieser Stelle hier begleitet. Der Nebenhoden sieht ebenfalls aus wie eine Spaghetti-Schlinge am unteren Ende, und oben befindet sich die Fettgewebsschicht.Als Erstes schneide ich das Epidermis vom Hoden ab. Danach erfolgt eine leichte Zugabe, um das Fettgewebe im Epidermis zu trennen. Sobald dies erledigt ist, drehe ich die Hoden um und versuche, so viel wie möglich vom Nebenhoden vom Fettgewebe zu isolieren.Wenn dies erledigt ist, lässt sich der Nebenhoden leicht von den Hoden abreißen und so vollständig von diesen isolieren. Der Nebenhoden ist dabei entlang der Seite der Hoden aufgebrochen.Es gibt hier also zwei verschiedene Abschnitte, die isoliert werden müssen. Einer unten, der noch verbunden ist, und dann der obere Teil, den ich erneut umdrehe, damit er in meiner linken Hand isoliert ist und ich mit der rechten schneiden kann, um das Fett sofort zu entfernen. So haben Sie die beiden verschiedenen Anteile der EPIs.Ich werde die EPIs aufnehmen und sie dann einfach in die 9 %ige Milch geben, wo ich diesen Sperma gewinnen werde. Im Moment organisiere ich sie einfach nach Isolation, sodass ich alle einzeln bearbeiten kann. Grundsätzlich möchte man das meiste Fett entfernen, und hier ist der entscheidende Punkt.Sie sollten lange Striche machen, damit die Spermien in die Milchmischung schwimmen können. Das besteht hauptsächlich aus Fett. Dieser hier ist schön lang, zermatscht das Gewebe praktisch vollständig.Ich versuche, genügend Schnitte hier durchzuführen, um Zugang zu allen verschiedenen Taschen zu erhalten, in denen die Spermien gespeichert sind. Etwas anderes, das Sie vermeiden sollten, ist, die Stücke zu klein zu schneiden, da die Spermien später beim Aufsaugen die Kanüle der 22-Gauge-Nadel verstopfen könnten. Ich werde sie eine Minute lang ruhen lassen, um sicherzustellen, dass alle Spermien den Nebenhoden verlassen haben.Die wellenförmigen Linien, die Sie sehen und die sich bewegen, wodurch sich die Flüssigkeit in Bewegung setzt, sind die eigentlichen Spermien. Die Klumpen sind die Milchdepot-Granula, weshalb das Bild etwas dunkler erscheint, da es sich in einer Milchsuspension befindet. Wie Sie sehen können, sind die Spermien noch aktiv, wobei sich ihre Schwänze bewegen.Der nächste Schritt besteht darin, die 9%-Spermienlösung in die Spritze aufzuziehen. Sie sollten die Spritze zur Seite neigen, da von vornherein nicht viel Flüssigkeit vorhanden ist. Ziehen Sie die Lösung einfach auf.Falls sich ein Gerinnsel bildet, lässt es sich sehr leicht entfernen. Verwenden Sie einfach ein Chemolumineszenzröhrchen, um das Ende Ihrer Pipettenspitze abzuwischen. Nachdem Sie etwas der Lösung aufgenommen haben, je nach Anzahl der Mäuse, sollten Sie so viel Luft wie möglich aus der Spritze entfernen.Dies geschieht einfach dadurch, dass man die Spritze anstößt, um die Luftblase an die Oberseite zu bringen. Diese Weibchen werden in keiner Weise anästhesiert, und man kann daher sehen, dass die Injektion ohne Verwendung eines Schlangenanästhetikums durchgeführt werden kann. Sie sollten die Spitze des Injektionspunkts vertikal einführen.Die Vagina hat tatsächlich eine J-Form, daher, wenn Sie injizieren und die Spritze dann zurückziehen, sollten Sie höchstens 0,05 injizieren, was ich getan habe. Wie Sie sehen, ist das ausreichend, da es bereits wieder austritt. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Weibchen künstlich besamt.Wir haben Spermien aus dem männlichen Para-Mucus-Polyon isoliert und diese in ein ovulierendes Weibchen injiziert. Sobald dies erfolgt ist, sollte die Befruchtung in der OV-Weibchen entweder während oder kurz nach der künstlichen Besamung stattfinden. 12 Stunden danach sollte sich ein T-Zell-Embryo entwickelt haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Viele Nagetiermodelle der Endometriose sind durch technische Komplexität, Reproduzierbarkeit und/oder den Bedarf an immungeschwächten Tieren oder speziellen Reportermäusen begrenzt. Wir präsentieren ein vereinfachtes System der Läsionsinduktion mit jeder experimentellen Maus mit einem unabhängig überprüfbaren, objektiven Scoring-System und ohne Notwendigkeit für Ovariektomie oder Überlebensoperation.

Ein syngenes Murinmodell der Endometriose mit natürlich radfahrenden Mäusen

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Die vorgestellte Methode zur Manipulation des Gebärmutterhalses kann bei Mäusen eine Pseudoschwangerschaft induzieren, ohne dass Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart werden müssen. Die Induktion einer Pseudoschwangerschaft ist Voraussetzung für den Erfolg des nicht-chirurgischen Embryotransfers und der nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung, die beide ebenfalls vorgestellt werden.

Induktion einer Pseudoschwangerschaft bei weiblichen Mäusen, ohne dass vasektomierte Männchen vor einem nicht-chirurgischen Embryotransfer oder einer künstlichen Befruchtung erforderlich sind

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) vor, das es uns ermöglicht, altersbedingte Veränderungen im Glukosestoffwechsel zu beobachten, die auf ICSI zurückzuführen sind, und Einblicke in ihre potenziellen langfristigen Auswirkungen auf die menschliche Entwicklung zu geben.

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Lernen Sie die künstliche Besamung bei Mäusen zur Reproduktionsbiologie und Transgenforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Zeitplanung bei der Zucht und den Einsatz von gefrorenem Sperma.

Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice

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