Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

Hallo, mein Name ist Jay Harkins. Ich bin Forschungswissenschaftler bei Protein Discovery. Heute werde ich zeigen, wie einfach es ist, das neue gelfreie 8, 100-Fraktionierungssystem zu verwenden, um eine molekulargewichtsbasierte Fraktionierung mit hoher Rückgewinnung zu erreichen.

Mit gelfrei können Sie bis zu einem Milligramm Gesamtprotein pro Kanal laden und bis zu acht Proben in etwa 90 Minuten reproduzierbar fraktionieren. Das System enthält also ein Instrument, eine Einwegkartusche und alle Puffer, die Sie für die Durchführung des Experiments benötigen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie bis zu acht 500-Mikroliter-Röhrchen einrichten und auf jedem Röhrchen beschriften. Geben Sie bis zu einem Milligramm der Proteinprobe in einem Volumen von bis zu 112 Mikrolitern hinzu. Die Menge an Protein in der Probe hängt von der Komplexität der Probe ab.

Bei komplexeren Proben, wie dem für diese Demonstration verwendeten Gewebehomogenat, erzielen 150 bis 200 Mikrogramm pro Kanal die besten Ergebnisse. Fügen Sie anschließend 30 Mikroliter mit fünf x Probenpuffer hinzu, der im gelfreien Kartuschen-Kit enthalten ist. Zu jeder Proteinprobe fügen Sie acht Mikroliter eines molaren DTT hinzu.

Stellen Sie dann jede Probe mit Wasser auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern ein. Erhitzen Sie dann die Fläschchen fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um die Probe zu denaturieren. Lassen Sie die erhitzten Proben auf Raumtemperatur abkühlen, während die Probe abkühlt.

Nehmen Sie die gelfreie 8, 100er Patrone aus dem Folienbeutel. Entfernen Sie das Plattenversiegelungsmittel und entsorgen Sie es. Entfernen Sie den Aufbewahrungspuffer mit einer Pipette aus den Kartuschenfächern.

Wenn alle acht Kammern der Patrone verwendet werden, drehen Sie die Patrone um, um den Aufbewahrungspuffer aus den Fächern zu entleeren. Als nächstes werden acht Milliliter freilaufender Gelpuffer zu jedem der Anodenpufferreservoirs hinzugefügt. Sechs Milliliter werden in jedes der Kathodenpufferreservoirs gegeben, und 100 Mikroliter werden in jede der Sammelkammern pipettiert.

Entfernen und entsorgen Sie mit einer Achtkanalpipette für 100 bis 200 Mikroliter den Puffer, der aus dem Kathodenpufferreservoir in die Probenladekammer geflossen ist, und laden Sie die Proben sofort in die Ladekammern. Sobald die Proben geladen wurden, setzen Sie die Kartusche in die gelfreie 8.100-Fraktionierungsstation ein. Senken Sie dann die Elektrodenarrays ab und schließen Sie den Deckel über die einfach zu programmierende grafische Benutzeroberfläche auf dem Touchscreen-Display des Geräts, um zur Liste der verfügbaren vorprogrammierten Methoden zu gelangen.

Wählen Sie die entsprechende Methode aus, indem Sie die Methodentaste drücken. Drücken Sie die Abruftaste und geben Sie die Nummer der gewünschten vorprogrammierten Methode ein. Drücken Sie auf der Bildschirmtastatur auf OK. Drücken Sie dann die Apply-Taste.

Die angewendete Methode wird am unteren Rand des Hauptbildschirms angezeigt. Jede der vorprogrammierten Methoden besteht aus eingestellten Spannungen und zeitbasierten Pausen, die darauf ausgelegt sind, Proteine innerhalb eines bestimmten Bereichs von Molekulargewichten aufzulösen. Sobald Sie die entsprechende Methode ausgewählt haben, drücken Sie die Kanaltaste auf dem Hauptbildschirm.

Wählen Sie dann die Kanäle aus, die in der Ausführung verwendet werden sollen. Um alle acht Kanäle auszuwählen, drücken Sie Alle auswählen. Drücken Sie dann auf Fertig.

Um zum Hauptbildschirm zurückzukehren, stellen Sie sicher, dass die Sicherheitsklappe geschlossen ist und die Kontrollleuchte am unteren Bildschirmrand grün leuchtet. Drücken Sie nun Start, um das Experiment zu starten, während das System läuft. Die Kreise, die im Feld auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt werden, zeigen den Status jedes Kanals an. Ein grüner Kreis zeigt an, dass der Kanal aktiv ist.

Die angelegten Spannungen und Ströme werden rechts neben den Statuskreisen des Kanals angezeigt. Das gelfreie 8, 100 pausiert automatisch für die Fraktionsentnahme in dem in der Methode angegebenen Intervall. Wenn das Instrument angehalten wird, um Brüche zu erfassen, wird ein Textfeld angezeigt, das Sie darüber informiert, dass eine Pause stattgefunden hat, und die Statuskreise werden gelb.

Im Inneren der Kartusche wird eine konstante Spannung zwischen dem Anoden- und dem Kathodenbehälter angelegt. Unter diesem Potenzial wird das Proteingemisch elektrophoretisch aus der Ladekammer in den speziell konstruierten Präzisionsguss getrieben. Gelproteine stapeln sich zunächst in einer scharfen Bande im Stapelgel und lösen sich dann basierend auf ihren jeweiligen Molekulargewichten im auflösenden Gel auf.

Wenn Proteine aus dem Gel austreten, werden sie eingefangen und in flüssiger Phase konzentriert. In der Auffangkammer gelfrei. Anschließend wird das Instrument pausiert.

Basierend auf vorgewählten Zeitintervallen werden Intervalle und Fraktionen mit einer Pipette gesammelt. Dann wird das Potential erneut angewendet, um anzudeuten, dass die zweite Molekulargewichtsfraktion von Interesse eingeschlossen wird. Dieser Vorgang wird dann so lange wiederholt, bis alle gewünschten Fraktionen gesammelt sind.

Jede Kartusche enthält acht unabhängige elektrophoretische Kanäle, so dass der Benutzer so viele Kanäle betreiben kann, wie er benötigt, und die ungenutzten Kanäle für die spätere Verwendung aufbewahren kann. Um die Fraktionen zu entfernen, öffnen Sie den Deckel des Instruments und verwenden Sie dann die Pipette des angeborenen Kanals. Füllen Sie die 150 Mikroliter Flüssigkeit in jeder der Sammelkammern in Sammelröhrchen oder eine Multi-Well-Platte um.

Sobald die Fraktionen entfernt wurden, waschen Sie die Auffangkammer zweimal mit einem freilaufenden Gelpuffer, indem Sie 100 Mikroliter pro Kanal hinzufügen und zweimal auf und ab pipettieren. Geben Sie nach dem Waschen 100 Mikroliter freilaufenden Gelpuffer zurück in die Auffangkammern. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie die Fortsetzen-Taste.

Die gelfreie 8, 100 läuft bis zum nächsten Zeitintervall. Die verbleibende Gesamtzeit des Experiments wird auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt. Drücken Sie die Taste über dem Feld mit der Zeitanzeige, um zwischen der verbleibenden Zeit und der Zeit zum Anhalten umzuschalten.

Sind alle Fraktionen gesammelt, können sie sofort für die weitere Aufbereitung verwendet werden, z. B. für die isoelektrische Fokussierung oder Gelelektrophorese oder für die Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie oder Immunaffinität. In dieser Demonstration wurden acht Proteinproben mit je 200 Mikrogramm in 12 Fraktionen aufgeteilt, was insgesamt 96 Fraktionen ergibt. Um die Ergebnisse der Fraktionierung und des Aliquots jeder der 12 Fraktionen aus dem Rinderleberhomogenat zu visualisieren, wurde die Probe dann auf ein Standard-1D-Gel laufen lassen und mit Silber gefärbt.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurde die Proteinprobe in 12 verschiedene Fraktionen fraktioniert, die den Molekulargewichtsbereich von 3,5 Kilodalton bis 150 Kilodalton abdecken. Das hier gezeigte Gel unterstreicht die Fähigkeit des gelfreien 8, 100-Systems, eine große Menge an Protein in unterschiedliche Molekulargewichtsfraktionen zu fraktionieren. Dies ist ein unglaublich leistungsfähiges Werkzeug für die Top-down- und Bottom-up-Proteomik unter Verwendung von Massenspektrometrie sowie für Immunaffinitätsexperimente, bei denen eine einzelne gereinigte Molekulargewichtsfraktion des intakten Proteins erforderlich ist.

Es war mir ein Vergnügen, Ihnen zu zeigen, wie einfach es ist, das gelfreie 8, 100-Fraktionierungssystem zu verwenden, um Ihre Probe reproduzierbar in diskrete Molekulargewichtsfraktionen zu unterteilen und eine hohe Flüssigphasenrückgewinnung zu erzielen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.