Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

Hallo, mein Name ist Jay Harkins. Ich bin Wissenschaftler bei Protein Discovery. Heute werde ich zeigen, wie einfach es ist, das neue gelfreie 8,100-Fraktionierungssystem für eine fraktionierte Trennung nach molekularer Masse mit hoher Ausbeute zu verwenden.

Mit der gelfreien Methode können Sie bis zu ein Milligramm Gesamtprotein pro Kanal laden und bis zu acht Proben innerhalb von etwa 90 Minuten reproduzierbar fraktionieren. Das System umfasst daher ein Gerät, eine Einwegkartusche und alle Puffer, die Sie für das Experiment benötigen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie bis zu acht 500-Mikroliter-Röhrchen vorbereiten und beschriften. Geben Sie bis zu ein Milligramm der Proteinstichprobe in einem Volumen von bis zu 112 Mikrolitern in jedes Röhrchen. Die Menge an Protein in der Probe hängt von der Komplexität der Probe ab.

Für komplexere Proben, wie das für diese Demonstration verwendete Gewebelysat, erzielt man die besten Ergebnisse mit 150 bis 200 Mikrogramm pro Kanal. Als Nächstes geben Sie 30 Mikroliter des im gelbfreien Kartuschenkit enthaltenen 5×-Probepuffers zu jeder Probe hinzu. Zu jeder Proteinprobe geben Sie acht Mikroliter 1-molarem DTT hinzu.

Danach jedes Proben mit Wasser auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern einstellen. Anschließend die Vials fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen, um die Probe zu denaturieren. Die erhitzten Proben abkühlen lassen, bis sie Raumtemperatur erreichen, während die Proben abkühlen.

Entfernen Sie die gel-freie 8,100-Kartusche aus der Folienverpackung. Entfernen und entsorgen Sie den Plattenverschluss. Entfernen Sie den Lagerpuffer aus den Kartuschenkammern mithilfe einer Pipette.

Wenn alle acht Kammern der Kartusche verwendet werden, wird die Kartusche umgedreht, um den Lagerpuffer aus den Kammern ablaufen zu lassen. Anschließend werden je acht Milliliter gel-freies Laufpuffer in die Anodenpufferbehälter gegeben. Sechs Milliliter werden in jeden der Kathodenpufferbehälter gegeben, und jeweils 100 Mikroliter werden in jede der Sammelkammern pipettiert.

Entfernen und verwerfen Sie mithilfe eines achtkanaligen Pipettiergeräts mit einem Volumenbereich von 100 bis 200 Mikroliter jegliche Pufferlösung, die aus dem Kathodenpufferbehälter in die Probeladekammer geflossen ist, und laden Sie anschließend sofort die Proben in die Ladekammern. Nach dem Beladen der Proben setzen Sie die Kartusche in die Gel-freie 8,100-Fraktionierungsstation ein. Senken Sie danach die Elektrodenanordnungen ab und schließen Sie den Deckel, indem Sie über die einfach zu bedienende grafische Benutzeroberfläche auf dem Touchscreen-Display des Geräts zur Liste der verfügbaren vorprogrammierten Methoden navigieren.

Wählen Sie die geeignete Methode aus, indem Sie die Methodentaste drücken. Drücken Sie die Abruftaste und geben Sie die Nummer der gewünschten voreingestellten Methode über das Bildschirmtastenfeld ein. Bestätigen Sie mit „Okay“. Drücken Sie anschließend die Anwenden-Taste.

Die angewandte Methode wird am unteren Rand des Hauptbildschirms angezeigt. Jede der vorgegebenen Methoden besteht aus festgelegten Spannungen und zeitbasierten Pausen, die darauf ausgelegt sind, Proteine innerhalb eines bestimmten Bereichs an Molekulargewichten aufzutrennen. Sobald die geeignete Methode ausgewählt wurde, drücken Sie die Kanaltaste auf dem Hauptbildschirm.

Danach wählen Sie die Kanäle aus, die während des Durchlaufs verwendet werden sollen. Um alle acht Kanäle auszuwählen, drücken Sie „Alle auswählen“. Danach drücken Sie „Fertig“.

Um zum Hauptbildschirm zurückzukehren, stellen Sie sicher, dass der Sicherheitsdeckel geschlossen ist und die Anzeigelampe unten auf dem Bildschirm grün leuchtet. Drücken Sie nun auf „Start“, um das Experiment zu beginnen. Während das System läuft, zeigen die Kreise in dem Feld auf der linken Seite des Bildschirms den Status jedes Kanals an. Ein grüner Kreis bedeutet, dass der Kanal aktiv ist.

Die angelegten Spannungen und Ströme werden rechts neben den Kanalstatuskreisen angezeigt. Der gel-freie 8, 100 unterbricht automatisch zur Fraktionssammlung in dem im Methode festgelegten Intervall. Wenn das Gerät angehalten wird, um Fraktionen zu sammeln, erscheint ein Textfeld, das darüber informiert, dass eine Pause eingetreten ist, und die Statuskreise färben sich gelb.

Im Inneren der Kartusche wird eine konstante Spannung zwischen den Reservoiren für Anode und Kathode angelegt. Unter diesem Potential wird das Protein-Gemisch elektrophoretisch aus der Ladekammer heraus und in das speziell konstruierte Präzisionsgel transportiert. Die Proteine stapeln sich zunächst in einer scharfen Bande im Stapelgel und werden anschließend im Trenngel entsprechend ihrem jeweiligen Molekulargewicht aufgetrennt.

Während die Proteine aus dem Gel eluieren, werden sie in der flüssigen Phase festgehalten und angereichert. In der Sammelkammer ist das Gel frei. Anschließend wird das Gerät angehalten.

Basierend auf vordefinierten Zeitintervallen und Fraktionen werden diese mithilfe einer Pipette gesammelt. Anschließend wird das Potential erneut angelegt, um das Ende zu signalisieren und die zweite gewünschte Fraktion nach Molekulargewicht einzufangen. Dieser Prozess wird dann wiederholt, bis alle gewünschten Fraktionen gesammelt wurden.

Jede Kartusche enthält acht unabhängige elektrophoretische Kanäle, sodass der Benutzer so viele Kanäle nutzen kann, wie erforderlich sind, und die nicht verwendeten Kanäle für einen späteren Zeitpunkt aufbewahren kann. Um die Fraktionen zu entnehmen, öffnen Sie den Deckel des Geräts und verwenden dann die integrierte Kanülenpipette. Überführen Sie die 150 Mikroliter Flüssigkeit aus jeder Sammelkammer in Sammelröhrchen oder eine Mehrfach-Well-Platte.

Nachdem die Fraktionen entfernt wurden, spülen Sie die Sammelkammer zweimal mit gelfreiem Laufpuffer, indem Sie pro Kanal 100 Mikroliter hinzufügen und zweimal auf- und abpipettieren. Nach dem Spülen fügen Sie 100 Mikroliter gelfreien Laufpuffer erneut in die Sammelkammern hinzu. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie die Fortsetzen-Taste.

Das gelfreie 8,100 läuft bis zum nächsten Zeitintervall. Die verbleibende Gesamtzeit des Experiments wird auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt. Drücken Sie die Schaltfläche über dem Feld, das die Zeit anzeigt, um zwischen verbleibender Zeit, vergangener Zeit und Zeit bis zur Pause umzuschalten.

Nachdem alle Fraktionen gesammelt wurden, können sie unmittelbar für weitere nachgeschaltete Aufarbeitungsschritte verwendet werden, wie beispielsweise die isoelektrische Fokussierung oder Gelelektrophorese, oder zur Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie oder Immunoaffinität. In dieser Demonstration wurden acht Proteininproben mit jeweils 200 Mikrogramm in jeweils 12 Fraktionen aufgeteilt, was insgesamt 96 Fraktionen ergab. Um die Ergebnisse der Fraktionierung zu visualisieren, wurde von jeder der 12 Fraktionen aus der Rinderleber-Homogenatprobe eine Aliquotprobe auf einem standardmäßigen eindimensionalen Gel aufgetragen und mit Silber gefärbt.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurde die Proteinprobe in 12 unterschiedliche Fraktionen aufgeteilt, die den Molekulargewichtsbereich von 3,5 Kilodalton bis 150 Kilodalton abdecken. Das hier dargestellte Gel verdeutlicht die Fähigkeit des gel-freien 8,100-Systems, eine große Menge an Protein in klar definierte Fraktionen nach Molekulargewicht aufzutrennen. Dieses System stellt ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für die top-down- und bottom-up-Proteomik mittels Massenspektrometrie sowie für Immunoaffinitätsversuche dar, bei denen eine einzige, gereinigte, intakte Proteinfraktion bestimmten Molekulargewichts benötigt wird.

Es war eine Freude, Ihnen zu zeigen, wie einfach es ist, das gel-freie 8,100-Fraktionierungssystem zu verwenden, um Ihre Probe reproduzierbar in diskrete Molekulargewichtsfraktionen aufzuteilen und eine hohe Rückgewinnung in der flüssigen Phase zu erzielen. Damit ist alles gesagt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.