Brustepithelzellen Transplantation

Dieses Video zeigt die Verfahren zur Gewinnung von Speicher. Epithel, Entfernen des Speicherfettpolsters und Transplantation von exogenem Epithel zur Untersuchung der Speicherentwicklung bei drei Wochen alten Mäusen. Das Wachstum des speicherepithelialen Baums ist auf die Umgebung der Brustwarze beschränkt, und das Fettpolster enthält weitgehend kein Speicher-Epithel. Während die Maus heranreift, wächst der epitheliale Baum durch das Fettpolster hindurch.

Bis zum siebten Lebenswochenalter erstreckt sich der epitheliale ductale Baum über das gesamte Fettgewebe. Wird der kleine Teil des Fettgewebes, der Epithel enthält, im Alter von drei Wochen entfernt, wird das endogene Epithel das Gedächtnis-Fettgewebe niemals besiedeln, und das Fettgewebe wird als geräumt beschrieben und bliebe auch im ausgereiften Zustand geräumt. Transplantiertes Spender-Gedächtnis, Epithel oder epitheliale Zellen hingegen haben das Potenzial, ductale Bäume im gesamten geräumten Wirtsgewebe auszubilden.

Fettgewebe. Anschließend kann die Histologie verwendet werden, um die Entwicklung des Gedächtnisses in transplantiertem Gewebe von transgenen oder Versuchstieren zu überwachen. Hallo, mein Name ist Joseph Jerry, und ich arbeite am Fachbereich Veterinär- und Tierwissenschaften der University of Massachusetts.

Hallo, mein Name ist Karen Dunphy. Ich arbeite im Jerry-Labor. Heute werden wir eine Transplantation von Brustdrüsenepithel durchführen.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die molekularen und zellulären Grundlagen der Memory-Tumor-Entstehung und ein Modell für Brustkrebs zu untersuchen. Beginnen wir also. Der erste Schritt des Transplantationsverfahrens besteht darin, Memory-Epithelgewebe von der Spendermaus zu gewinnen.

Beginnen Sie damit, eine kürzlich euthanasierte weibliche Maus mit 70 % Ethanol zu waschen, wobei die SRU-Membranen der Bauchhöhle nicht durchstochen werden dürfen. Führen Sie einen medianen sagittalen Schnitt durch die Haut von der Schamgegend bis zum Brustbein. Anschließend führen Sie je einen schrägen Schnitt von dem ursprünglichen Einschnitt an der Schamgegend in Richtung jedes Hinterbeins durch.

Greifen Sie mit gebogenen Pinzetten die SRU-Membranen. Anschließend greifen Sie mit geraden, gezahnten Pinzetten die Schnittkante der Haut und lösen vorsichtig die Körperwand von den S cs-Membranen ab.

Um die vierte inguinale Milzdrüse, die an der Unterseite der Körperwand befestigt ist, freizulegen, wird der Lymphknoten innerhalb der Milzdrüse am Schnittpunkt dreier hervorstehender Blutgefäße in der Milzdrüse lokalisiert und kann als dichter Knoten im Fettgewebe ertastet werden. Mit der Spitze eines Augenscherenpaares schneiden Sie das umgebende Fettgewebe um den Lymphknoten herum ab. Anschließend üben Sie mit einem Zeigefinger auf der epidermalen Seite der Haut Druck aus, um den Knoten aus dem Fettgewebe herauszuheben, und zwicken Sie ihn ab.

Verwerfen Sie mit einer gebogenen Pinzette den Lymphknoten. Halten Sie nun die Hautränder fest und greifen Sie mit der gebogenen Kante einer gebogenen Pinzette auf das Fettpolster zu. Lösen Sie das Fettpolster allmählich von der Körperwand ab und entfernen Sie unter Verfolgung der Richtung des Fettpolsters zur dorsalen Fläche der Maus die gesamte Milz in einem Stück.

Legen Sie die Speicheldrüse auf einen sterilen Kunststoffschneideblock mit einer kleinen Menge Medium, etwa 200 µL, auf die Oberfläche der Drüse, um sie feucht zu halten. Zerkleinern Sie dann die Drüse mit einer frischen Rasierklinge in etwa ein Millimeter große Stücke. Teilen Sie die zerkleinerte Drüse in vier Portionen auf.

Verwenden Sie dann Pinzette, um die Probe auf vier Kryoröhrchen mit Gefriermittel zu verteilen. Stellen Sie die Kryoröhrchen in einen Nalgene-Zellgefrierschrank mit 250 Milliliter Isopropanol im äußeren Fach. Stellen Sie anschließend den Zellgefrierschrank für 24 Stunden auf minus 70 Grad Celsius.

Nach 24 Stunden die gefrorenen Röhrchen mit Gedächtnisfragmenten in flüssigen Stickstoff überführen und dort aufbewahren, bis sie für die Transplantation benötigt werden. Jedes Kryoröhrchen enthält ausreichend Fragmente von Gedächtnisdrüsen, um sie in die freigeräumten Fettpolster von vier bis acht Wirtsmäusen zu transplantieren. Nach Überprüfung der Narkosetiefe einer dreiwöchigen Wirtmaus mittels Zehenquetschung die Maus festhalten, wobei sie mit der Bauchseite nach oben auf einem Operationsständer liegt und ihre Gliedmaßen gestreckt sind, sodass ihr Abdomen straff ist.

Präoperatives Analgetikum, Bupivacain oder Buprenorphin, sollte subkutan verabreicht werden. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Alkohol und einer jodhaltigen Lösung unter Verwendung einer Pinzette. Greifen Sie die Haut einige Millimeter oberhalb des Beckens an und heben Sie sie vom Bauchraum ab.

Die Haut vorsichtig anfassen, wobei sichergestellt werden muss, dass der erste Schnitt nicht zu nahe an der Harnröhre liegt, da die Platzierung von Wundclips die Fähigkeit der Maus zu urinieren beeinträchtigen könnte. Danach, unter besonderer Vorsicht, um die SRU-Membranen nicht zu durchbohren, einen mittelsagittalen Schnitt durch die Haut von der Schambeinfuge bis zum Brustbein führen.

Von der ursprünglichen Inzision ausgehend, führen Sie nun schräge Schnitte durch die Haut von der Mittellinie über das Becken hinweg in Richtung jedes Hinterbeins durch. Greifen Sie mit gebogenen Pinzetten vorsichtig die Serösenmembranen der ventralen Körperwand. Verwenden Sie dann Gewebepinzetten, um den Schnittrand der Haut zu fassen, und ziehen Sie die Körperwand von den Serösenmembranen weg.

Um die vierte inguinale Milzdrüse freizulegen, identifizieren Sie zunächst die vierte Milzdrüse. Identifizieren Sie anschließend die fünfte Milzdrüse, koagulieren Sie den Warzenknoten und die zwei Arterien, die zum Knoten führen. Trennen Sie die vierte und fünfte Drüse voneinander und koagulieren Sie dann den Rand der fünften Drüse.

Danach mit einer Schere quer über das Fettgewebe direkt ventral des Lymphknotens schneiden, um das Fettgewebe der vierten Milzdrüse zu trennen. Mit einer gebogenen Pinzette den ventralen Teil des Fettgewebes festhalten und vom Körperwall abziehen. Es empfiehlt sich, das entfernte Gewebe in einem Stück zwischen zwei beschriftete Objektträger zu pressen und in Car-noischem Fixansatz zu fixieren.

Anschließend kann das Gewebe angefärbt, eingebettet und auf freie Ränder überprüft werden. Mit einer Pinzette werden alle Reste der Speicherdrüse im Bereich des entfernten Fettpolsters entfernt. Das Tier ist nun bereit für eine Gewebe- oder Zelltransplantation.

Frisches oder schockgefrorenes Spender-Epithelgewebe kann in die präparierte Fettgewebepartie transplantiert werden. Alternativ können immortaleisierte Gedächtnis-Epithelzelllinien, Gedächtnistumorzelllinien oder primäre Zellen transplantiert werden. Für Einzelheiten zur Zellpräparation siehe bitte das begleitende schriftliche Protokoll zur Transplantation von Epithelfragmenten. Präpariert.

Dieses Video beginnt damit, eine Kryoröhre mit Epithel aufzutauen und die Fragmente in eine Petrischale mit frischem Medium zu überführen. Um das DMSO zu verdünnen, wird mit einer Schere eine Tasche im entfetteten Epithel des Empfänger-Mäuses angelegt. Anschließend wird mit einer Nadelzange ein ein Millimeter großes Stück des Spender-Epithels in die Tasche eingebracht.

Falls erforderlich, halten Sie die Tasche mit Gewebekräusen geschlossen und ziehen Sie die Nadelkrause zurück, sodass das Gewebe an Ort und Stelle bleibt. Fassen Sie gegenüberliegende Hautränder und halten Sie diese mit der Pinzette zusammen.

Heben Sie sie von den Zerebralmembranen der Bauchhöhle ab und verschließen Sie mit Wundclips. Verwenden Sie zwei Clips, um den mittelsagittalen Einschnitt zu schließen, und jeweils einen Clip für die schrägen Einschnitte. Vermeiden Sie, falls nötig, eine Obstruktion der Harnröhre.

Schließen Sie die Hautlücken an der Kreuzung der mittelsagittalen und der schrägen Inzisionen mit einer Naht. Stellen Sie die Maus in ihren Käfig und halten Sie den Käfig unter einer Wärmelampe, bis die Maus wieder zu sich gekommen ist. Die Wundklammern sollten nach zwei Wochen entfernt werden.

Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Bilder dessen, was man in der Speicheldrüse des Wirts nach dem Freilegen des Futterpolsters und der Transplantation des Epithels erwarten kann. Dieses Bild zeigt das endogene Speicheldrüsene­pithel, das von einer dreiwöchigen Maus entfernt wurde. Beachten Sie beim Freilegungsverfahren der Drüse die scharfen Ränder an der Schnittkante. Nach jedem Eingriff sollte eine derartige Ganzpräparation angefertigt werden, um die Vollständigkeit der Freilegung zu überprüfen.

Dieses Bild zeigt das aufgehellte Fettgewebe der Maus sieben Wochen nach dem Aufhellungsverfahren. Beachten Sie, dass das gesamte Fettgewebe frei von Speicher-, Epithel-, Hämatingewebe und Asin ist. Die Färbung eines aufgehellten Fettgewebes sieben Wochen nach dem Aufhellungsverfahren zeigt ebenfalls, dass die Drüse frei von Speicher-Epithel ist.

Ein repräsentatives Ganzpräparat eines freigelegten Fettgewebes, das mit donoralem Gedächtnis-Epithel von einem 10 Wochen alten Maus transplantiert wurde, ist dargestellt. Beachten Sie, dass das transplantierte Epithel normale epitheliale Gangbäume, Hämatine und Asinus gebildet hat. Färbung eines freigelegten Fettgewebes und Gedächtnis.

Die epitheliale Transplantation im gleichen Alter zeigt die normale Bildung epithelialer Gangsysteme aus dem exogenen Epithel. Hier zeigen Hämatin- und Asin-Färbungen eines geklärten Fettgewebes ein epitheliales Transplantat, das sich zu einem Erinnerungstumor entwickelt hat. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man das Brustdrüsenepithel gewinnt und eine Transplantation des Brustdrüsenepithels durchführt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Verbindungen zwischen der vierten und fünften Drüse zu durchtrennen, um den Lymphknoten und die Brustwarze zu koagulieren, und sämtliche Spuren des endogenen Epithels zu entfernen. Es muss sichergestellt werden, dass kein endogenes Epithel in das freigemachte Fettgewebe nachwachsen kann. Zusätzlich empfiehlt es sich, die gesamte entfernte Brustdrüsenportion zur Überprüfung auf freie Ränder zu untersuchen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.