Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

Als MSCs abgekürzte mesenchymale Stammzellen werden aus einer sechs bis acht Wochen alten, weiblichen Rattenpuppe isoliert und in einer 10 cm Petrischale kultiviert, bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Zur Anreicherung der MSCs werden die Zellen mit biotinylierten primären Antikörpern markiert, gefolgt von streptavidinkonjugierten magnetischen Mikrokügelchen. Die markierten Zellen werden anschließend mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung in zwei Fraktionen getrennt, die negative und die positive Fraktion.

Anschließend wird die Oberflächenmarkerdarstellung mittels Durchflusszytometrie bestätigt. Abschließend werden Klonierungszylinder verwendet, um aus einzelnen Kolonien stammende MSCs zu gewinnen. Hallo, ich bin Lee aus dem Labor von Christina Chang am Department für Chemieingenieurwesen und Materialwissenschaften der Michigan State University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Anreicherung von Chy-Stammzellen sowie zur Gewinnung von Einzelkolonie-abstammenden Zellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das Proliferations- und Differenzierungsverhalten von roten Stammzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Mesenchymale Stammzellen oder MSCs werden aus einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen SPRD-Dolly-Ratte isoliert. Um dieses Verfahren zu beginnen, schneiden Sie die Femora und Tibiae aus den Hintergliedmaßen des euthanasierten Tieres heraus. Entfernen Sie die Haut und Muskulatur, geben Sie die präparierten Femora und Tibiae für einige Sekunden in 70 % Isopropanol und überführen Sie sie anschließend in ein X-D-P-B-S.

Die folgenden Schritte sollten in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Zuerst überführen Sie den Femur und die Tibia in eine 10 cm große Petrischale, die DMEM enthält. Halten Sie dann jeden Knochen mit einer Pinzette und schneiden Sie die beiden Enden mit einer Schere auf.

Befestigen Sie eine 22-Gauge-Nadel an einer 3-Milliliter-Spritze und füllen Sie diese mit DMEM. Führen Sie die Nadel in ein offenes Ende des Knochens ein und spülen Sie das Mark in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei bis drei Mal pro Knochen, nachdem das gesamte Mark gewonnen wurde.

Suspendieren Sie die Zellen erneut und filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb, um Knochenreste und Blutaggregate zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 ×g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach dem Absaugen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in 25 Milliliter MSC-Medium zum Ansaen.

10 Milliliter Zellsuspension in jeweils eine von zwei 10-Zentimeter-Kulturschalen geben. Die Kulturschalen in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für ein bis zwei Wochen inkubieren. Sobald die zuvor isolierten rat-MSCs eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, das Medium abpipettieren und vier bis fünf Milliliter Trypsin-EDTA zu jeder Schale hinzufügen.

Bringen Sie die Schalen zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie etwa fünf Minuten lang. Um die Zellablösung zu ermöglichen, geben Sie eine gleiche Menge an Kulturmedium hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Sammeln Sie die Zellsuspensionen in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 ×g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang.

Nun demonstrieren wir die Anreicherung von MSCs mittels zweier Oberflächenmarker, CD 54 und CD 90. Verwenden Sie dazu das BD I-Magneten, einen Zellseparationsmagneten von BD Biosciences. Beginnen Sie damit, das Zellpellet in Zellfärbepuffer bei 20 Millionen Zellen pro Milliliter erneut aufzuschwemmen.

Fügen Sie anschließend biotinylierten CD54-Antikörper und einen biotinylierten CD90-Antikörper zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie vorsichtig. Nach einer Inkubation auf Eis für 15 Minuten waschen Sie die markierten Zellen mit einem überschüssigen Volumen an 1× BD IMAG-Puffer. Zentrifugieren Sie die markierten Zellen bei 200 × g und 4 °C für fünf Minuten. Bereiten Sie die BD IMAG-Streptavidin-Partikel durch gründliches Wirbelmischen vor und geben Sie anschließend 40 Mikroliter Partikel pro 10 Millionen Zellen hinzu.

Mischen Sie die Partikel gründlich mit den markierten Zellen und inkubieren Sie die Zellen bei sechs bis 12 Grad Celsius für 30 Minuten. Kennzeichnen Sie während dieser Inkubationszeit ein Rundbodentestgefäß zur Sammlung der positiven Fraktion. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, stellen Sie das Markierungsvolumen auf 20 Millionen Zellen pro Milliliter ein.

Mit einem Expedia I mag-Puffer. Überführen Sie die markierten Zellen in das Sammelröhrchen für die positive Fraktion. Stellen Sie das Röhrchen mit der positiven Fraktion auf den BDI-Magneten und lassen Sie es sechs Minuten lang stehen.

Danach, während sich das Röhrchen mit der positiven Fraktion weiterhin auf dem BDI-Magneten befindet, entfernen Sie den Überstand mit einer Glas-Pasteur-Pipette. Danach nehmen Sie das Röhrchen mit der positiven Fraktion vom BDI-Magneten und stellen es auf Eis. Geben Sie ein Milliliter eiskaltes 1×BDI-Mag-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Mischen.

Stellen Sie das Röhrchen erneut auf den BDI-Magneten und lassen Sie es zwei bis vier Minuten lang stehen. Entfernen Sie den Überstand mit einer neuen Glas-Pasteurpipette. Wiederholen Sie die Waschung wie zuvor beschrieben.

Ein letztes Mal. Entfernen Sie schließlich den Überstand mit einer neuen Glas-Pasteurpipette. Anschließend nehmen Sie das Gefäß vom BDI-Magneten wieder heraus.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Kulturmedium und überführen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das 25 Milliliter Saatmedium enthält. 1 75 cm²-Flasche zur Kultivierung der Zellen und eine 10 cm-Schale für die Durchflusszytometrie.

Um mit dem Verfahren zur Isolierung von Einzelkolonie-abstammenden MSCs zu beginnen, plattieren Sie die Zellen mit etwa 50 bis 100 Zellen pro 10-Zentimeter-Platte und inkubieren sie für eine bis zwei Wochen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Während dieser ein- bis zweiwöchigen Periode untersuchen Sie gut isolierte Kolonien mit einem umgekehrten Mikroskop. Sobald die Kolonien eine ausreichende Größe von mehr als 100 Zellen pro Kolonie erreicht haben, markieren Sie sie mit einem Permanentstift an der Unterseite der Platte.

Wenn Sie eine Kolonie zum Markieren auswählen, stellen Sie sicher, dass sich keine benachbarten Kolonien in der Nähe befinden. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Petrischale einmal mit einem X-D-P-B-S unter Verwendung einer Pinzette. Nehmen Sie einen sterilen Klonierzylinder auf und platzieren Sie ihn vorsichtig um die markierte Kolonie.

Wiederholen Sie dies, bis über jeder markierten Kolonie ein Klonierungszylinder platziert ist. Geben Sie 100 Mikroliter Trypsin-EDTA in jeden Klonierungszylinder und stellen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator. Überprüfen Sie nach fünf Minuten die Zellen unter dem Mikroskop, um festzustellen, ob sie sich abrunden.

Wenn sich die Zellen gelöst haben, eine gleiche Menge an Kulturmedium hinzufügen, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Die Zellsuspension mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette mischen und die Zellsuspension in eine 60-Millimeter-Schale überführen, die drei Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium enthält. Die Schalen beschriften und nach der Isolierung erneut in den Inkubator zurückstellen, da sie aus plastikadhärenten Zellen stammen.

Die MSCs sollten am Tag nach der Aussaat sichtbar sein. Während die Zellen weiter proliferieren, sollten konfluente Zellen wie in diesem Phasenkontrastbild gezeigt aussehen, wobei die Mehrheit sternförmig oder spindelförmig ist. Eine Kultivierung ist geeignet, wenn die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreicht haben.

Nach der Trypsinierung sollten die Zellen rund erscheinen und im Medium schweben. Sobald die MSCs durch magnetische Zellsortierung angereichert sind, wird die Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Expression der Oberflächenmarker zu überprüfen. Bei einer guten Anreicherung sollten die Zellen eine positive Färbung gegenüber den MSC-Markern CD 54 und CD 90 aufweisen, jedoch eine negative Färbung gegenüber dem HSC-Marker CD 45; Isotypkontrollen IgG zwei A und IgG eins werden als negative Kontrollen verwendet.

Wenn die Zellen in einer geeigneten klonalen Dichte angesiedelt sind, sollten Kolonien aus einzelnen Zellen hervorgehen, wie in diesem Beispiel gezeigt. Klonierungszylinder können dann verwendet werden, um die Kolonien zu trennen, und die aus den Kolonien stammenden Zellen können separat kultiviert werden. In diesen beiden Beispielen sind die Zellen, die von einer Kolonie abstammen, spindelförmig, während die Zellen, die von einer anderen Kolonie abstammen, rund sind.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie man zufällige und gemeinsame Stammzellen isolieren und anreichern sowie Zellen aus einzelnen Kolonien gewinnen kann. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Blutgerinnsel und Knochenreste während der Isolierung zu entfernen. Verwenden Sie die optimale Menge Antikörper während der Anreicherung und markieren Sie gut isolierte Kolonien während der Kolonientrennung.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.