Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris

Das folgende Protokoll beschreibt die Proteingexpression unter Verwendung der methylotrophen Hefe opus. Es werden die Herstellung elektrokompetenter Hefezellen und die Transformation des Vektors mit dem Gen der Interesse in PPAs gezeigt, gefolgt von einem Schritt zur DNA-Reinigung aus Hefe, um die korrekte Integration des Gens der Interesse in das Hefe-Genom zu überprüfen. Am Ende werden wir die Expression des rekombinanten Proteins durchführen.

Hallo, ich bin Maria aus dem Labor von Steven Hallam am Department für Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Ich bin Marcus, ebenfalls aus dem Helm-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Expression rekombinanter Proteine in der TRO-Hefe PQ.Past stories.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Proteine aus unbeackerten Mikroorganismen zu untersuchen, bei denen Umwelt-DNA extrahiert und archiviert sowie meta-atomare Bibliotheken angelegt wurden. Beginnen wir also. Die Expression rekombinanter Proteine in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris erfordert, dass Ihr Gen von Interesse innerhalb eines offenen Leserasters in einen Pichia-Expression-Vektor kloniert wird.

In unserem Experiment verwenden wir den Vektor PPIC Z alpha A. Dieser Vektor enthält den AO X 1-Promotor für eine streng regulierte, methanolinduzierte Expression des Gens von Interesse, das Alpha-Faktor-Sekretionssignal für die Sekretion des rekombinanten Proteins, zaas sowie ein Resistenzgen zur Selektion sowohl in E. coli als auch in Pichia pastoris, und ein C-terminales Peptid, das ein HA-Epitop und einen Polyhistidin-Tag für Nachweis und Reinigung des rekombinanten Proteins enthält. Vor der Transformation linearisieren Sie den Vektor, der Ihr Gen von Interesse enthält, durch Restriktionsverdau. Wir verwenden das Enzym PME 1, aber andere Restriktionsstellen sind möglich, solange Ihr Insert diese Restriktionsstelle nicht enthält.

Um ausreichende Mengen an linearisierter Vektor-DNA zu erhalten, richten Sie drei bis vier 50-Mikroliter-Einschränkungsverdauungsreaktionen in separaten Röhrchen ein. Kombinieren Sie nach dem Verdau alle Lösungen und konzentrieren Sie Ihren Konstrukt. Unter Verwendung einer AmCon-Zentrifugalfiltereinheit und einer MicroCon-Zentrifugalfiltereinheit benötigen Sie fünf bis 20 Mikrogramm linearisierter DNA in fünf bis zehn Mikrolitern sterilem Wasser zur Transformation in PPA dous. Um elektrokompetente PPA dous vorzubereiten, streichen Sie Zellen zwei Tage vor der Transformation zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius auf eine A-Y-P-D-S-Platte ohne SN aus, bis sich einzelne Kolonien gebildet haben.

Züchten Sie fünf Milliliter des PPA oder Stammes in YPD-Medium in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie das Falcon-Röhrchen am Tag vor der Transformation zur Befestigung im Schüttler in einen Kolben. Verwenden Sie 0,25 Milliliter der Übernachtkultur, um 500 Milliliter frisches YPD-Medium in einem Zwei-Liter-Kolben anzusetzen.

Züchten Sie erneut über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius bis zu einem OD 600 von 1,3 bis 1,5. Am Tag der Transformation sollten Eis, kaltes steriles Wasser und einmolarer Sorbit bereitstehen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1500 Gs für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation suspendieren wir das Pellet in 500 Milliliter eiskaltem, sterilem Wasser. Abhängig von der Kapazität der Zentrifugenröhrchen müssen Sie das Volumen möglicherweise auf zwei separate Röhrchen aufteilen oder mehrere Durchgänge durchführen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 250 Milliliter eiskaltem, sterilem Wasser.

Je nach Kapazität der Zentrifugenröhrchen können Sie die separaten Zellpellets in einem Röhrchen vereinen. Beim erneuten Aufschwemmen nach der Zentrifugation lösen Sie das Pellet diesmal wieder auf. Überführen Sie die aufgeschwemmten Zellen in 20 Milliliter eiskaltem einmolarem Sorbitol in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie.

Nach einer abschließenden Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter eiskaltem, einmolarem Sorbitol auf ein Endvolumen von etwa 1,5 Millilitern resuspendieren. Die resuspendierten Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis oder bei vier Grad Celsius lagern, bis sie für die Transformation verwendet werden. Vor der Transformation des konzentrierten, linearisierten Konstrukts in PPA-stor-Zellen folgende Reagenzien und Geräte vorbereiten.

Füllen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter einmolarer Sorbitollösung und stellen Sie es auf Eis. Legen Sie eine 0,2-Zentimeter-Elektroporationskammer auf Eis.

Etikettieren Sie ein steriles 15-Milliliter-Glasröhrchen und halten Sie eine sterile Glas-Pasteurpipette bereit. Überführen Sie 80 Mikroliter der zuvor hergestellten elektrokompententen Zellen in das eiskalte 0,2-Zentimeter-Elektroporationsküvettenröhrchen.

Fügen Sie die Plasmid-DNA-Lösung zu den Zellen hinzu und mischen Sie, indem Sie die Pipettenspitze von einer Seite zur anderen bewegen. Im Elektroporationsgefäß. Inkubieren Sie das Gefäß mit den Zellen fünf Minuten lang auf Eis.

Als Nächstes wischen Sie die Außenseite der Küvette mit dem Tuch ab und pulsieren die Zellen gemäß den Parametern für Sprosspilze, wie sie vom Hersteller Ihres spezifischen Elektroporationsgeräts empfohlen werden. In dieser Demonstration wird ein BioRad Gene Pulser mit folgenden Bedingungen verwendet: Ladespannung von 1500 Volt, Kapazität von 25 Mikrofarad und Widerstand von 200 Ohm unmittelbar nach dem Pulsieren.

Geben Sie ein Milliliter eiskaltes, einmolar Sorbitol zum Vetus hinzu. Überführen Sie den Inhalt des Vetuses mit einer sterilen Glas-Pasteur-Pipette in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen 1,5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius ohne Schütteln.

Nach 1,5 Stunden sind die elektroporierten Zellen bereit zum Ausplattieren. Geben Sie fünf bis zehn sterilisierte Glasperlen zu jeder der vier beschrifteten YPTS-Platten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Zain. Verteilen Sie 250 Mikroliter der Elektroporation.

Mischen Sie auf jeder Platte und schütteln Sie die Platte horizontal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Lassen Sie die Platten 15 Minuten trocknen und entfernen Sie dann die Perlen von der Agarose, indem Sie die Platten umdrehen. Wickeln Sie die Platten in schwarzen Kunststoff ein, um den Abbau des lichtempfindlichen Zains zu verhindern, und inkubieren Sie die Platten zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius im umgekehrten Zustand, bis Kolonien gebildet wurden, nachdem die Kolonien entstanden sind.

Wählen Sie 12 Kolonien aus. Reinigen Sie diese, indem Sie die Klone auf frischen YPDS-Platten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Zein ausstreichen. Um PPA-Zellen für die Proteinexpression vorzubereiten, entnehmen Sie eine einzelne Kolonie aus den gereinigten Pichia-Kolonien und impfen sie in 25 Milliliter VMGY-Medium in einem sterilen 250-Milliliter-Kolben an. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator, bis die Kultur einen OD 600 von zwei bis sechs erreicht hat.

Wenn die Zellen den geeigneten OD 600 erreicht haben, bereiten Sie eine Glycerinlagerprobe der Zellen zur Aufbewahrung vor. Überführen Sie 800 Mikroliter der Zellkultur in ein zwei Milliliter fassendes kryogenes Gefäß und geben Sie 200 Mikroliter sterilisiertes Glycerin hinzu. Lagern Sie die Glycerinlagerprobe bei minus 80 Grad Celsius.

Überführen Sie außerdem 1,5 Milliliter der Zellkultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1300 ×g für eine Minute bei Raumtemperatur. Lagern Sie das Pellet bei vier Grad Celsius.

Diese Zellen werden für die Hefe-DNA-Reinigung verwendet, um die Pichia-Irans nach PCR mit insertspezifischen Primern an einem groben Gel zu analysieren, um zu bestätigen, dass das Gen der Interesse in das Pichia-Genom integriert wurde. Überführen Sie den Rest der 25-Milliliter-Kultur in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie das Überstand und stellen Sie das Röhrchen kopfüber auf ein Papier, um restliche Medien zu entfernen, um das Zellpellet zu waschen. Suspendieren Sie es durch Vortexen oder mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 20 Milliliter BMMY-Medium und zentrifugieren Sie erneut.

Suspendieren Sie die Zellsuspension erneut, nachdem das Überstand entfernt wurde, indem Sie den Zellpellet durch Vortexen oder mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in BMMY auf einen OD 600 von 1,0 einstellen. Medium, um die Expression zu induzieren. Überführen Sie die Kultur in einen einliterigen baffelten Kolben und bedecken Sie den Kolben mit einem 200-Milliliter-Peaker.

Wir empfehlen dringend die Verwendung von Schüttelkolben mit Baffeln, da sie mehr Sauerstoff in die Kultur einbringen. Um eine effiziente Proteingexpression während der Methanolinduktion zu erreichen, inkubieren Sie den Kolben im Inkubator, um das Wachstum bei 30 Grad Celsius fortzusetzen. Es ist wichtig, dass die Temperatur 30 Grad Celsius nicht überschreitet, falls die Temperatur Ihres Inkubators schwankt.

Stellen Sie die Temperatur auf 28 Grad Celsius ein. Geben Sie sterilisiertes reines Methanol alle 24 Stunden in einer Endkonzentration von 0,5 % Methanol hinzu, um die Induktion zu bestimmten Zeitpunkten nach Beginn der Expression aufrechtzuerhalten. Überführen Sie ein Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 2,5 Minuten lang mit 1300 × g. Überführen Sie bei Raumtemperatur den Überstand in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Lagern Sie das Überstand und die Zellpellets bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Analyse. Die Proben aus verschiedenen Zeitpunkten werden analysiert, um den optimalen Zeitraum für die Proteinexpression nach Induktion zu bestimmen. Nun zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse zur erfolgreichen Expression rekombinanter Proteine unter Verwendung von PIA Pastis als Wirtssystem.

Dieses Western-Blot-Bild zeigt vier exprimierte Proteine nach 24 Stunden Expression. Für das Immunoblotting wurde ein akemisches HRP-Antikörper verwendet. Die zweite Spur ist eine negative Kontrolle und enthielt Überstand von Zellen, die kein rekombinantes Protein exprimieren, da sie mit dem Elternvektor transformiert wurden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man rekombinante Proteine mithilfe des eukaryotischen Wirts PQ.Plus exprimiert. Bei dieser Methode ist es wichtig, Ihren Konstrukt absequenzieren zu lassen, um zu bestätigen, dass Ihr Gen von Interesse korrekt kloniert und in der richtigen Leserichtung vorliegt, und sicherzustellen, dass alle Platten und Reagenzien bereitstehen, bevor Sie beginnen. Ebenso wichtig ist es, eine ausreichende Menge an linearisiertem Plasmid vorzubereiten, um eine hohe Anzahl an Transformanten vor der Proteinexpression durch Methanolinduktion zu erhalten. Achten Sie darauf, Ihre Zellen gründlich zu waschen, um alle Restspuren von Glycerin zu entfernen, die Ihre Proteinexpression hemmen könnten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei den Experimenten.