Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, sich entwickelnde Embryonen zu gewinnen, die von in Kultur manipulierten OO-Stellen stammen. Dies wird erreicht, indem zunächst Donator-Oo-Stellen von einem Weibchen isoliert und in Kultur nach Wunsch manipuliert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Zellen durch Progesteron zur Reifung anzuregen und potenzielle Wirtstiere mit Gonadotropin zu injizieren, um die Eiablage zu stimulieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Donorzellen mit Vitalfarbstoffen zu färben und ein Weibchen als Wirt vorzubereiten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die chirurgische Übertragung der Donorzellen in die Körperhöhle des Wirts sowie die Gewinnung und Befruchtung der übertragenen Eizellen einige Stunden später. Letztendlich entstehen normal teilende Embryonen aus den experimentell manipulierten Donorzellen.

Zellen können genauso gewonnen und analysiert werden wie normale Embryonen. Hallo, ich bin Doug Houston von der University of Iowa. Heute befinden wir uns im Cold Spring Harbor Xap-Kurs, um Ihnen zu zeigen, wie man das Wirtstransferverfahren durchführt.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktionen mütterlicher Genprodukte zu untersuchen und deren Rolle in der frühen Zap-Entwicklung zu bestimmen. Beginnen wir also. Stellen Sie vor Beginn der Operation sicher, dass der Operationsbereich desinfiziert ist und frische Medien sowie sterile Instrumente bereitliegen.

Halten Sie eine Nahtnadel mit der Nadelhaltezange in der gewünschten Ausrichtung fest. Legen Sie einen anästhesierten weiblichen Frosch auf den Rücken auf ein feuchtes chirurgisches Tuch. Machen Sie mit kleinen Iris-Scheren einen ein Zentimeter langen Schnitt in die Haut im unteren Bauchbereich, seitlich zur Mittellinie.

Schneiden Sie nicht in den Bauchmuskel hinein. Heben Sie mit einer Pinzette die Muskelschicht und die umgebende, weißlich gefärbte Faszie an. Führen Sie mit der Iris-Schere einen einzigen, schnellen Schnitt senkrecht durch den Muskel.

Verlängern Sie den Schnitt auf einen Zentimeter, um den Eierstock freizulegen. Greifen Sie mit einer Pinzette den Eierstock und ziehen Sie einen Lappen heraus. Schneiden Sie den Lappen mit einer Schere auf Höhe der Körperwand ab.

Legen Sie das Gewebe sofort in eine 90-Millimeter-Schale, die Oozytenkulturmedium oder OCM enthält, und beurteilen Sie die Eierstockqualität unter einem Stereomikroskop. Einige Zellen können mit einer Pinzette entblättert werden. Wenn die Zellen fest sind und eine einheitliche Größe sowie Färbung aufweisen, entnehmen Sie die gewünschte Menge an Eierstockgewebe vom Frosch und legen Sie sie in eine 90-Millimeter-Petri-Schale mit OCM.

Schließen Sie den Schnitt. Führen Sie die Nadel einige Millimeter lateral zum Schnitt ein und achten Sie darauf, dass sowohl Muskel als auch Faszie durchstoßen werden. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nadel zu manipulieren, und achten Sie darauf, das Ende des Fadens nicht vollständig durchzuziehen.

Schließen Sie die Wunde mit einer einfachen unterbrochenen Nahttechnik und chirurgischen Quadratknoten. Die Technik ist im begleitenden Text ausführlich beschrieben. Wiederholen Sie die Nahttechnik für die Hautschicht.

Spülen Sie das Weibchen mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie es in einen Wiederherstellungsbehälter mit kaltem Wasser. Unmittelbar nach Beendigung der Operation unterteilen Sie mit einer Schere den Eierstock. Schneiden Sie einzelne Lappen auf, glätten Sie sie und schneiden Sie sie in zwei Zentimeter große quadratische Stücke.

Spülen Sie mit sauberem Medium und verwenden Sie Pinzette. Überführen Sie fünf bis sechs Stücke in eine frische 90-Millimeter-Schale mit OCM, um einzelne Zellen zu isolieren. Beginnen Sie damit, eines der Stücke in eine kleine Schale mit Medium zu überführen und unter ein Stereomikroskop zu bringen.

Verwenden Sie eine Uhrmacherpinzette, um manuell drei bis 500 Oozyten zu entnehmen. Fassen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten die das voll entwickelte Stadium-sechs-Oozyt umgebende Bindegewebsschicht nahe dem Stiel. Greifen Sie mit dem ersten Paar Pinzetten den neben dem Oozyt liegenden Eierstock an.

Ziehen Sie vorsichtig über die Oozyte, um die Follikelschicht zu öffnen. Lösen Sie die Zelle vorsichtig aus dem Gewebe heraus. Entfollikulierte Zellen weisen keine sichtbaren Blutgefäße auf und sind schlaffer als Zellen mit intakten Follikeln.

Verwenden Sie eine mit Watte verstopfte, feuerpolierte Pipette, um Gruppen von 100 bis 150 Zellen in 60 Millimeter große Kulturschalen mit acht Millilitern OCM zu überführen. Lagern Sie die Oozyten in ihren Schalen bei 18 Grad Celsius. Die Oozyten können nun nach Belieben mit Antisense-Oligonukleotiden oder mRNA gemäß einer Vielzahl von Protokollen mikroinjiziert und anschließend in OCM in einem Inkubator bei 18 Grad Celsius kultiviert werden.

Verwenden Sie Oozyten für die Übertragung innerhalb von 96 Stunden nach der Isolierung am Abend vor Durchführung der Übertragung. Inkubieren Sie die erforderlichen Zellen mit Progesteron, um sie zu reifen, indem Sie 16 Mikroliter einer einmillimolaren Progesteronlösung in das die Zellen enthaltende Medium geben, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen. Inkubieren Sie für 10 bis 12 Stunden bei 18 Grad Celsius am selben Abend und injizieren Sie drei bis fünf Weibchen mit je 1000 Einheiten humanem Choriongonadotropin pro Frosch, um die Eiablage auszulösen.

Lassen Sie die Weibchen am Morgen des Transfers über Nacht bei Raumtemperatur oder 18 Grad Celsius. Überprüfen Sie unter dem Stereomikroskop, ob die kultivierten Zellen die Reifung durchlaufen haben. Zentrifugieren Sie die Vitalfarbstoffe mit mehr als 10.000 ×g für fünf Minuten.

Um die Hintergrundfärbung durch Trümmermaterial zu verringern, geben Sie 80 Mikroliter des geeigneten vitalen Farbstoffs zu jeder experimentellen Gruppe von Oozyten hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Überführen Sie die gefärbten Eier in eine 90 Millimeter große Schale mit frischem o cm und schwenken Sie kurz, um sie zu waschen.

Stellen Sie eine Pipette zum Übertragen der Zellen her. Verwenden Sie einen Diamantschreiber, um eine Markierung etwa zwei Zentimeter unterhalb des konischen Bereichs an Ihrer Pipette anzubringen, und brechen Sie diese sauber ab. Dadurch entsteht eine Pipette mit einer Bohrung von 1,5 Millimeter Durchmesser, die gerade groß genug ist, um eine Oozyte aufzunehmen.

Poliere die Spitze, bis die Kanten glatt sind, ohne die Spitze zu schließen. Oozytentransplantation. Die Operation sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.

Führen Sie wie zuvor bei einer anesthetisierten Weibchen, das Eier von guter Qualität legt, einen Einschnitt durch. Dieser Einschnitt sollte die minimale Länge aufweisen, die gerade ausreicht, um die Bohrung der Übertragungspipette aufzunehmen. Pipettieren Sie weniger als einen Zentimeter.

Drehen Sie die Schale mit den experimentellen Oozyten, um sie in der Mitte der Schale zu sammeln. Saugen Sie mit der vorbereiteten Pasteurpipette so viele wie möglich auf. Lassen Sie die Oozyten sich am Ende der Pipette absetzen, um die Menge der Flüssigkeit, die der Frosch übertragen wird, zu minimieren.

Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Muskel- und Faszienschlappe zu greifen und anzuheben. Führen Sie die Spitze der Pipette in den Schnitt ein und lassen Sie die Zellen langsam in die Körperhöhle tröpfeln. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Oozyten übertragen wurden.

Lösen Sie die Muskelschicht nicht, um zu verhindern, dass die Oozyten aus dem Schnitt austreten. Greifen Sie mit einer Pinzette beide Seiten des Schnitts und führen Sie sie zusammen, sodass sich die Zellen in der Körperhöhle absetzen können. Nähen Sie die Muskelschicht und die Faszienschicht wie zuvor, wobei Sie darauf achten, bis zum Binden der ersten Schlinge eine nach oben gerichtete Spannung aufrechtzuerhalten.

Nähen Sie die Haut. Spülen Sie den Frosch mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie ihn wie zuvor auskurieren. Der Frosch sollte normalerweise zwei bis drei Stunden nach der Operation mit der Eiablage beginnen.

Eier durch normales Auspressen alle halbe Stunde sammeln, bis das Weibchen mit dem Ablaichen aufhört, in eine Schale mit gesammelten Eiern. Vier Milliliter einer Suspension frisch gesammelter Spermien in einem XMMR hinzufügen und vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Eier umfassend mit Raumtemperatur-Flüssigkeit überspülen und spülen.

Punkt eins XMMR bei Raumtemperatur inkubieren, um die Aktivierung und Spaltung zu ermöglichen. Cystein jederzeit verwenden, um die Gelatine-Codes zu entfernen. Die übertragenen Embryonen können dann je nach Farbe in separate Schalen sortiert und wie normale Embryonen kultiviert werden.

In der Regel aktivieren sich mehr als zwei Drittel der übertragenen Eizellen innerhalb weniger Minuten nach der Befruchtung, was sich durch eine starke kortikale Kontraktion am Animalpol zeigt. In den meisten Experimenten erfolgt bei über der Hälfte der übertragenen Eizellen eine normale erste Furchung. Manchmal verzögert sich die Furchung um etwa 20 Minuten im Vergleich zu den Wirtseizellen.

30 bis 60 % der übertragenen Embryonen entwickeln sich normal zum Gastrula-Stadium und überleben die neurale Phase. Die übertragenen Embryonen behalten ihre Vitalfarbstofffärbung über mehrere Entwicklungstage hinweg. Embryonen, die aus unbehandelten Kontrollzyten stammen, erscheinen wie erwartet normal.

Im Gegensatz dazu weisen Embryonen, die aus Oozyten stammen, die mit Beta-Catin und Antisense-Oligos injiziert wurden, beispielsweise ein zentrales Erscheinungsbild auf. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Embryonen aus in Kultur manipulierten Zellen erhält.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mit gesunden, voll ausgewachsenen Donatoreizellen zu beginnen und Wirtstiere mit Eizellen hoher Qualität zu verwenden. Außerdem hängt der Erfolg der Methode in der Regel von der Schnelligkeit ab, mit der die Eizellen isoliert und die Operationen durchgeführt werden. Daher kann es einige Übung erfordern, bis konsistente Ergebnisse erzielt werden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.