Name: Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Organizer- und Animal-Pole-Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen für Zelladhäsionsassays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmigration und Adhäsionseigenschaften.

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Vorbereitung Adhesion Chambers (der Tag vor der Injektion / Dissektion) Adhesion Assay Chambers Wenn Sie eine herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop (optisch lokalisiert über der Bühne) haben, ist es ncecessary um eine niedrige Bauhöhe Haftung Kammer wie folgt. Bei Verwendung des invertierten-Optik Mikroskop, dann &quot;NUNC Lab-Tek Chambered Deckglas&quot; kann nur verwendet werden, und überspringen Sie die Schritte # 1 bis 2. <ol><li> Bringen Sie eine der &quot;Press-to-Siegel Silizium-Isolator&quot; auf einem 40 x 24mm Deckglas. Drücken Sie das Isolator das Deckglas auf sauberen Tisch-und schaue von der anderen Seite, um sicherzustellen, dass der Isolator vollständig ohne Luftblasen befestigt. </li><li> Optional: Legen Sie die Haftung Kammern in einer Glas-Petrischale mit Whatman-Filterpapier und Autoklaven in Trocken-Zyklus zu sterilisieren. Coole sie auf RT. </li></ol> Die Beschichtung der Kammer <ol><li> Legen Sie eine 200ml Tropfen funktionierende Lösung von Cadherin (10mg/ml) oder Fibronektin (20mg/ml) auf die Mitte eines autoklaviert Haftung Kammer mit sigmacoated gelben Spitzen. Inkubation bei RT für 4 Stunden. </li><li> Nehmen Sie die Cadherin oder Fibronektin-Lösung und Überführung in ein 1,5 ml Tube. Diese Lösung kann für die nächsten 2 Wochen wieder verwendet werden. </li><li> Dispense 500ml von 4% BSA in 1x MBS-H, um die Kammer zu blockieren. Inkubation bei RT für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie die BSA-Lösung. Waschen Sie die Kammer mit 500 ml 1x MBS-H zweimal. Nach dem zweiten waschen, saugen die meisten von MBS-H (nicht vollständig), und speichern Sie in einem verschlossenen Behälter bei 4 º C. Diese Haftung Kammer ist gut für die nächsten 2 bis 3 Tagen. </li></ol> Dissection und Dissoziation von Animal Cap Explantate <ol><li> Inkubieren Sie die injizierten Embryonen in 0,1 x MBS-H, aus dem autoklaviert 1x MBS-H verdünnt, als nicht autoklavierten Medium irgendwann trägt wenig Keime, die dissoziierten Tier Kappe Zellen stören kann. </li><li> Machen 1x Barths Agaroseplatten und CMF-MBS-Agarose-Platten mit 60mm Geschirr, mindestens so viele wie die Anzahl Ihrer Proben. Gießen autoklaviert 1x MBS-H auf 1x Barths Platten. Für CMF-MBS-Platten, pour 10ml CMF-MBS. </li><li> Wenn die Embryonen Bühne 8,5 werden, beginnen Sezieren der Tiere Kappen in einem 1x Barths Platte. 10 bis 15 Explantate pro Proben sind in der Regel genug für ein Experiment. </li><li> Übertragen Sie die Tier-cap Explantate zu einer CMF-MBS Platte. Inkubieren Sie die Explantate für 45 bis 60 Minuten, bis die Explantate vollständig dissoziiert sind. Sanfte Agitationen in alle 15 Minuten wird dazu beitragen, die Dissoziation. </li></ol> Cell Adhesion Assay <ol><li> Aussaat der Zellen: Dispense 500ml 1x MBS-H, um die Haftung Kammer in die Schritte in den vorstehenden Abschnitten, Adhesion Assay Chambers und Beschichtung der Kammer vorbereitet. Übertragen Sie die dissoziierten Tier Kappe Zellen aus dem CMF-MBS Platte, um die Haftung Kammer mit P200 mit einem sigmacoated und abgehackten gelben Spitzen. </li><li> Optional: Wenn möglich, sorgfältig saugen das Medium bis zu ca. 2 / 3 auf halbem Weg, ohne dass Zellen in die Luft. Fügen Sie etwa die gleiche Menge an frischem MBS-H, um sicherzustellen, dass das Medium ausreichend Ca 2 + und Mg 2 +. </li><li> Inkubation bei RT für 45 bis 90 Minuten. Überprüfen Sie die Zellen gelegentlich zu sehen, ob sie an der Bodenfläche Befestigung sind. </li><li> Jetzt können Sie das Bild der Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Legen Sie die Haftung Kammer auf einem Raster Objektträger. Richten Sie eine der Ecken der Haftung Kammer in eine Ecke des Rasters gleiten. Graf und notieren Sie die Nummer des anhaftenden Zellen in verschiedene Netze. </li><li> Gießen Sie 1 Liter MBS-H in einem großen Plastikeimer (zB Tupperware, etc.). Sanft legte die Haftung schieben Kammer auf den Boden des Eimers. Drehen Sie es auf dem Schüttler für 5 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit (50 - 60rpm). </li><li> Legen Sie die Haftung Kammer wieder am Netz schieben, Ausrichten der gleichen Ecke der Kammer auf die gleiche Ecke des Rasters schieben, wie in Schritt 5 dieses Abschnitts, Cell Adhesion Assay durchgeführt wurde. Zählt die Anzahl der Zellen, die auf dem gleichen Raster, das Sie vor dem Waschen gezählt verbunden bleiben. Berechnen Sie den Prozentsatz an Zellen, die nach dem Waschen verbunden bleiben. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>Modifizierter Barth&amp;rsquo;s Medium: Rezeptur für 1 L: 5,14 g NaCl, 75 mg KCl, 0,2 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g HEPES, freie Säure. Den pH mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>Dies ist Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-freie Version von MBS-H. Rezeptur für 500 mL: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3/Unterabschnitt&gt; 1,19 g HEPES, freie Säure. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.</td></tr><tr><td>1 % Agarose/1x Barth&amp;rsquo;s-Platten</td><td></td><td></td><td></td><td>so viele wie die Anzahl der Proben</td></tr><tr><td>1 % Agarose/CMF-MBS-Platten</td><td></td><td></td><td></td><td>so viele wie die Anzahl der Proben</td></tr><tr><td>E-Cadherin/Fc-Chimäre </td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Lösen Sie 0,1 mg festes E-Cadherin in 100 µl 1x MBS-H, das 40 % Glycerin enthält, um einen 100x Stammpuffer (1,0 mg/ml) herzustellen. Lagern Sie ihn in &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Stellen Sie kurz vor der Verwendung eine 1:100-Verdünnung mit 1x MBS-H her, um eine Arbeitslösung mit 10 µg/ml zu erhalten. Pro Probe benötigen Sie 200 µl dieser Arbeitslösung.</td></tr><tr><td>Fibronectin, 0,1%-Lösung </td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Diese Fertiglösung kann als 50x-Stammlösung verwendet werden. Verdünnen Sie 1:50 mit 1x MBS-H, um 20 &amp;mu;g/mL Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung. Sie benötigen 200 &amp;mu;L pro Probe dieser Arbeitslösung. Ich empfehle ausdrücklich nicht die Verwendung von festem Fibronectin, da es schwierig ist, es in einer Konzentration von 0,1 % zur Herstellung der Stammlösung aufzulösen. Obwohl diese vorgefertigte 0,1-%-Lösung teurer ist, führt sie zu konsistenteren Ergebnissen.</td></tr><tr><td>4 % BSA / MBS-H</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>BSA: Fraktion V, molekularbiologische Qualität</td></tr><tr><td>gelbe Spitzen mit Sigmacote-Beschichtung </td><td>Werkzeug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser Nr. 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm oder 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Druckdichter Silikonisolator</td><td>Werkzeug</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm Tiefe x 20 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Kammerobjektträger</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 Vertiefungen/Objektträger</td></tr><tr><td>Rasterobjektträger</td><td>Werkzeug</td><td></td><td></td><td>oder Finder-Teilung für die Zellzählung</td></tr></tbody></table>

präparation organizer und animal pole explantate aus xenopus laevis embryos und montage eines cell adhesion assay

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt - ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden sind.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Hallo, mein Name ist Sochi Agata. Ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Ken Cho am Fachbereich für Entwicklungszellbiologie der University of California, Irvine. Heute werde ich die Dissektion und Adhäsionsprobe von Animal-Cap-Explanten oder Organisator-Explanten aus dem Frosch-XUS-Embryo zeigen.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Zelladhärenzeigenschaften und die Zellmorphologie von Zellen zu untersuchen, die aus disseziertem Gewebe stammen. Das Verfahren beinhaltet die Dissektion eines bestimmten Gewebes aus dem Xenopus-Froschembryo, wobei die Zellen in einem kalzium- und magnesiumfreien Medium dissoziiert werden. Anschließend werden die dissoziierten Zellen auf eine Objektträgerplatte überführt, die mit einem Zelladhärensmolekül beschichtet ist und ein Medium enthält, das Kalzium und Magnesium aufweist. Mithilfe dieses Verfahrens können wir das Zellverhalten, die Zellmigration und die Adhärenzeigenschaften des dissezierten X one untersuchen.Okay, bei diesem gesamten Verfahren der Embryodissektion und Adhäsionsprobe verwende ich zunächst spezielle Werkzeuge aus Fremdmaterial. Dies ist ein calcium- und magnesiumfreies Einmalküvettenobjektträger, mit 1 % Agarose beschichtet. Und dies hier ist ein normales Einmalküvettenobjektträger, ebenfalls mit 1 % Agarose beschichtet, auf dem Sie den Embryo dissezieren.Dann ist dies eine Dissektion, ein spezielles Dissektionswerkzeug, das keine Pinzette ist. Dies wird Augenbrauenmesser genannt, was ein seltsamer Name ist, aber es besteht tatsächlich buchstäblich aus einer Augenbraue, die von Ihrem Gesicht abgezogen wurde. Anschließend wird sie an der Spitze einer Pasteurpipette befestigt.Und dieses andere Werkzeug hier wird Haarschleife genannt, bei der erneut ein Haar eine Schleife an der Spitze einer Pasteurpipette bildet. Ich habe dieses Werkzeug diesmal nicht verwendet, aber manche bevorzugen die Haarschleife gegenüber dem Augapfel-Messer und daher den Adhäsionsassay. Ich verwende den Silikonkautschuk-Isolator, den man auf die Oberseite des Objektträgers klebt, um eine Kammer für den Adhäsionsassay herzustellen.Entnehmen Sie zuerst die Samenhülle aus dem Embryo. Dieses Stück ist die Samenhülle. Danach dissezieren Sie die Animalpole-Ader.Dies ist ein Tierprojekt, das Sie nicht benötigen. Drehen Sie das Embryo um, und Sie werden hier die klare dorsale Lippe sehen. Es ist wunderschön.Danach nehmen Sie das Augenmesser, führen es an der Seite der Dorsallippe entlang, führen es auch an der anderen Seite entlang und schneiden dieses Stück direkt unterhalb der Dorsallippe ab. Dieses Stück enthält den Embryonalkeim und das umgebende Derm. Sie drehen es um und lösen den Bauchteil vom inneren Keimbildner ab.Me. Okay, ich zerstöre gewissermaßen den dermalen Teil, aber das ist nicht wichtig. Das ist also in Ordnung. Und dieses Stück auf der rechten Seite ist das Organisator-Maß.Ich habe mich gerade auf die sauberere Seite der Schale bewegt. Das Stück auf der rechten Seite ist das Organisator-Meridian-Stück, und dies ist der gesamte Embryo. Und nun sehen Sie, wie groß das Organisator-Stück aussieht.Und dies kann verwendet werden, um einen Faktor zu extrahieren, der die Organisatorregion exprimiert, oder um einen Organisator-CD in der Bibliothek herzustellen oder die Thermatologie im wandernden Romen-Gewebe zu untersuchen. Bevor Sie den Animal-Cap-Ome präparieren, müssen Sie den richtigen Entwicklungsstadium finden. Wir verwenden das Blastula-Embryo im Stadium acht.Und nun sehen wir hier im Überblick das Embryo in drei verschiedenen Stadien. Die beiden Embryonen auf der linken Seite befinden sich im Stadium sieben, dem Blastostadium, und die beiden Embryonen in der Mitte sind im Stadium acht. Die beiden Embryonen auf der rechten Seite haben fast Stadium neun, das späte Blastostadium, erreicht.Und wir möchten Stufe acht auch deshalb gerne verwenden, weil man zunächst einmal den deutlichen Unterschied zwischen den einzelnen Blastomeren am Animalpol erkennen kann. Dieses Embryo der Stufe acht bietet eine gute Kombination aus gut sichtbaren Zellstrukturen und einer einfachen Zerlegbarkeit im Vergleich zu Stufe sieben. Bei der Stufe acht sind die Zellen am Animalpol jedoch zu groß und ihre Anzahl zu gering, während beim Embryo der Stufe neun die einzelnen Zellen zu klein sind und das animaläre Ektodermgewebe zudem dünner als bei Stufe acht geworden ist.Damit Sie nicht so viele Zellen erhalten, wie Sie möglicherweise wünschen. Zuerst befestigen Sie die Pinzette an der Seite des Embryos und entfernen die Hülle vom Embryo. Dies ist die Hülle.Dann dissezieren Sie die Mitte des Animalpols aus dem Embryo heraus. Gut, das ist ein wunderbares Präparat. Die linke Seite ist das dissezierte Animalcap-Explantat und dies ist der Rest des Embryos.Und dieses Gewebestück kann beispielsweise verwendet werden, wenn man etwas in den Animalpol des Embryos in einem frühen Stadium injiziert, wie beispielsweise einen Porto-Gen-Konstrukt, dann dieses Stück in einem späteren Stadium herausschneidet und für einen Porto-Assay verwendet, etwa einen Reziprozitäts-Assay. Jetzt werde ich eine Transplantation durchführen und den Organizer-X-Explanten übertragen, um den Zelladhäsionsassay zu untersuchen. Dazu muss ich den Organizer-X-Explanten in einem Kalziumarmen Medium lösen.Ich übertrage also den Organisator-Explanten von dieser normalen Brutplatte auf eine Scheibe mit kalzium- und magnesiumfreiem Medium. Dazu können Sie, wenn Sie sehr geschickt mit der Hand sind, die normale Transferpipette verwenden, aber dabei besteht eine gewisse Gefahr, das Embryo zu beschädigen. Deshalb verwende ich normalerweise eine P200 mit gelber Spitze.Und diese gelbe Spitze ist vorher mit diesem chemischen Einzelcode codiert, um zu verhindern, dass die Zelle an der Seite der gelben Spitze haftet. Außerdem habe ich die Spitze mit einer Schere an der Öffnung der gelben Spitze abgeschnitten, sodass die Spitze nun stumpf und großkalibrig ist, um die Gefahr einer Beschädigung des DX-Explantats zu minimieren. In Ordnung, was Sie jetzt im Blickfeld sehen, sind die beiden Organisator-Explantate, und ich werde diese beiden Stücke von dieser einen gewöhnlichen Kulturschale in eine kalziumfreie Mediumschale überführen.Saugen Sie diese Stücke langsam auf und überführen Sie sie in kalzium- und magnesiumfreies Medium. So sehen sie am Anfang aus, und so sehen sie jetzt aus, nachdem sie nahezu auf Einzelzellniveau dissoziiert sind. Die organisierten Explantate befinden sich nun in kalzium- und magnesiumfreiem Medium, und ich werde sie eine Stunde lang in diesem Medium inkubieren, damit sie sich für den nächsten Schritt auf Einzelzellniveau dissoziieren können, um anschließend die Zellmorphologie oder das Zellverhalten zu untersuchen. Nach einer Stunde Inkubation sollten die organisierten Explantate vollständig dissoziiert sein.Sie sind ziemlich gut. Und nun werfen Sie einen Blick auf die Mikroskope und das Mikroskop. Sie sind, ja, sie wirken ziemlich aktiv.Okay, jetzt untersuche ich das Zellverhalten in der Objektträger-Abbildungsanordnung, bei der Zellen mittels Cadherin oder INE oder einem anderen Typ von Zelladhäsionsmolekül festgehalten werden, um eine Zelladhäsions-Abbildungsanordnung herzustellen. Ich nehme diesen Objektträger und den Silikon-Gummi-Isolator und lege den Silikon-Gummi-Isolator einfach auf die Oberfläche des Objektträgers, drücke ihn fest an, um sicherzustellen, dass er ringsum vollständig haftet. Danach schaue ich von der anderen Seite, um zu überprüfen, ob er vollständig anhaftet, sodass die Flüssigkeit oben nicht austritt.Auf diese Sandkammer gebe ich einen 200 µL-Tropfen der Zell-DHE, der Suspension, die Zelladhäsionsproteine wie Cohärin oder Fibronectin enthält. Danach blockiere ich diese Kammer mit 500 µL 4 % BSA. Anschließend ersetzen wir das BSA durch reguläres 1×-Bus, ein Fian-Medium.Und jetzt sieht es so aus, als wäre hier eine Kammer bereit, die Zelle zu transportieren. Ich nehme diese Kammer erneut und befestige eine P-200 mit abgeschnittener, gelber Spitze, die mit Sigma-Cod beschichtet ist, um die Zelle aus dem kalzium- und magnesiumfreien Medium in diese Kammer aufzusaugen, die das Medium enthält, das auch Kalzium und Magnesium enthält. Nun übertrage ich diesen dissoziierten Organizer X-Punkt mittels P-200.Zuerst nehmen Sie diese P-200 und saugen langsam die Zelle auf; dabei können Sie sie ganz vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Ich verteile die Zelle zwar etwas überall, aber um sicherzustellen, dass sie einzeln vorliegen, bringen Sie nun die Bildgebungskammer in die Mitte Ihres Blickfelds und verteilen die Zellen gleichmäßig in der Bildgebungskammer. Nun liegen die Zellen auf der beschichteten Oberfläche verteilt. Und mal sehen, in der oberen Kammer sehen die Zellen folgendermaßen aus. Gut, nach zwei bis drei Stunden, in denen die Zellen in der Adhäsionskammer ausgebreitet wurden, zähle ich die Zellen in dieser Kammer mithilfe dieses Mikroskops. Üblicherweise, wenn man die Adhäsion von Organzellen aus einem Organisator-Explantat untersuchen möchte, lässt man die Zellen zwei bis drei Stunden lang auf der beschichteten Objektträgerplatte.Und danach können Sie die Anzahl der Zellen auf dem Objektträger unter dem Mikroskop quantifizieren, um sie zu waschen. Um die nicht gebundenen oder ungefährten DO3-Zellen zu entfernen, geben Sie einfach die Beschichtung in die Hession-Kammer und dann in den Pufferbehälter, der eine große Menge Puffer enthält. Anschließend beginnen Sie die Schütteln bei sehr geringer Geschwindigkeit, etwa 50 U/min, was ungefähr dieser Geschwindigkeit entspricht, und warten Sie fünf Minuten.Nach fünf Minuten nehmen Sie diese Adhärenzkammer vorsichtig heraus, ohne die Zellen innerhalb der Adhärenzkammer freizulegen. Sie nehmen sie also vorsichtig auf diese Weise heraus, wischen überschüssiges Pufferlösung ab und untersuchen erneut unter dem Mikroskop, um zu zählen, wie viel Prozent der Zellen an der beschichteten Oberfläche haften geblieben sind. Nach dem Waschen stellen Sie die Adhärenzkammer nun an dieselbe Stelle zurück, um sicherzustellen, dass Sie denselben genauen Bereich der Adhärenzkammer beobachten.Und jetzt beginnen Sie mit der Zählung. Auf diesem Bildschirm sehen Sie zwei verschiedene Zelltypen mit demselben Typ von Zelladhäsionsmolekül. Diese beiden Zelltypen weisen völlig unterschiedliche Adhäsionseigenschaften auf demselben Substrat auf.Auf der Oberseite des gleichen klebenden zellulären Adhäsionsproteins. Wir könnten auch diese dissoziierten Zellen aus dem Explantat für ihr Aggregations- oder Migrationsverhalten in der Zeitrafferaufnahme verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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