Name: Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Organizer- und Animal-Pole-Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen für Zelladhäsionsassays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmigration und Adhäsionseigenschaften.

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Vorbereitung Adhesion Chambers (der Tag vor der Injektion / Dissektion) Adhesion Assay Chambers Wenn Sie eine herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop (optisch lokalisiert über der Bühne) haben, ist es ncecessary um eine niedrige Bauhöhe Haftung Kammer wie folgt. Bei Verwendung des invertierten-Optik Mikroskop, dann &quot;NUNC Lab-Tek Chambered Deckglas&quot; kann nur verwendet werden, und überspringen Sie die Schritte # 1 bis 2. <ol><li> Bringen Sie eine der &quot;Press-to-Siegel Silizium-Isolator&quot; auf einem 40 x 24mm Deckglas. Drücken Sie das Isolator das Deckglas auf sauberen Tisch-und schaue von der anderen Seite, um sicherzustellen, dass der Isolator vollständig ohne Luftblasen befestigt. </li><li> Optional: Legen Sie die Haftung Kammern in einer Glas-Petrischale mit Whatman-Filterpapier und Autoklaven in Trocken-Zyklus zu sterilisieren. Coole sie auf RT. </li></ol> Die Beschichtung der Kammer <ol><li> Legen Sie eine 200ml Tropfen funktionierende Lösung von Cadherin (10mg/ml) oder Fibronektin (20mg/ml) auf die Mitte eines autoklaviert Haftung Kammer mit sigmacoated gelben Spitzen. Inkubation bei RT für 4 Stunden. </li><li> Nehmen Sie die Cadherin oder Fibronektin-Lösung und Überführung in ein 1,5 ml Tube. Diese Lösung kann für die nächsten 2 Wochen wieder verwendet werden. </li><li> Dispense 500ml von 4% BSA in 1x MBS-H, um die Kammer zu blockieren. Inkubation bei RT für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie die BSA-Lösung. Waschen Sie die Kammer mit 500 ml 1x MBS-H zweimal. Nach dem zweiten waschen, saugen die meisten von MBS-H (nicht vollständig), und speichern Sie in einem verschlossenen Behälter bei 4 º C. Diese Haftung Kammer ist gut für die nächsten 2 bis 3 Tagen. </li></ol> Dissection und Dissoziation von Animal Cap Explantate <ol><li> Inkubieren Sie die injizierten Embryonen in 0,1 x MBS-H, aus dem autoklaviert 1x MBS-H verdünnt, als nicht autoklavierten Medium irgendwann trägt wenig Keime, die dissoziierten Tier Kappe Zellen stören kann. </li><li> Machen 1x Barths Agaroseplatten und CMF-MBS-Agarose-Platten mit 60mm Geschirr, mindestens so viele wie die Anzahl Ihrer Proben. Gießen autoklaviert 1x MBS-H auf 1x Barths Platten. Für CMF-MBS-Platten, pour 10ml CMF-MBS. </li><li> Wenn die Embryonen Bühne 8,5 werden, beginnen Sezieren der Tiere Kappen in einem 1x Barths Platte. 10 bis 15 Explantate pro Proben sind in der Regel genug für ein Experiment. </li><li> Übertragen Sie die Tier-cap Explantate zu einer CMF-MBS Platte. Inkubieren Sie die Explantate für 45 bis 60 Minuten, bis die Explantate vollständig dissoziiert sind. Sanfte Agitationen in alle 15 Minuten wird dazu beitragen, die Dissoziation. </li></ol> Cell Adhesion Assay <ol><li> Aussaat der Zellen: Dispense 500ml 1x MBS-H, um die Haftung Kammer in die Schritte in den vorstehenden Abschnitten, Adhesion Assay Chambers und Beschichtung der Kammer vorbereitet. Übertragen Sie die dissoziierten Tier Kappe Zellen aus dem CMF-MBS Platte, um die Haftung Kammer mit P200 mit einem sigmacoated und abgehackten gelben Spitzen. </li><li> Optional: Wenn möglich, sorgfältig saugen das Medium bis zu ca. 2 / 3 auf halbem Weg, ohne dass Zellen in die Luft. Fügen Sie etwa die gleiche Menge an frischem MBS-H, um sicherzustellen, dass das Medium ausreichend Ca 2 + und Mg 2 +. </li><li> Inkubation bei RT für 45 bis 90 Minuten. Überprüfen Sie die Zellen gelegentlich zu sehen, ob sie an der Bodenfläche Befestigung sind. </li><li> Jetzt können Sie das Bild der Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Legen Sie die Haftung Kammer auf einem Raster Objektträger. Richten Sie eine der Ecken der Haftung Kammer in eine Ecke des Rasters gleiten. Graf und notieren Sie die Nummer des anhaftenden Zellen in verschiedene Netze. </li><li> Gießen Sie 1 Liter MBS-H in einem großen Plastikeimer (zB Tupperware, etc.). Sanft legte die Haftung schieben Kammer auf den Boden des Eimers. Drehen Sie es auf dem Schüttler für 5 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit (50 - 60rpm). </li><li> Legen Sie die Haftung Kammer wieder am Netz schieben, Ausrichten der gleichen Ecke der Kammer auf die gleiche Ecke des Rasters schieben, wie in Schritt 5 dieses Abschnitts, Cell Adhesion Assay durchgeführt wurde. Zählt die Anzahl der Zellen, die auf dem gleichen Raster, das Sie vor dem Waschen gezählt verbunden bleiben. Berechnen Sie den Prozentsatz an Zellen, die nach dem Waschen verbunden bleiben. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>Modifizierter Barth&amp;rsquo;s Medium: Rezeptur für 1 L: 5,14 g NaCl, 75 mg KCl, 0,2 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g HEPES, freie Säure. Den pH mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>Dies ist Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-freie Version von MBS-H. Rezeptur für 500 mL: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3/Unterabschnitt&gt; 1,19 g HEPES, freie Säure. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen. Autoklavieren.</td></tr><tr><td>1 % Agarose/1x Barth&amp;rsquo;s-Platten</td><td></td><td></td><td></td><td>so viele wie die Anzahl der Proben</td></tr><tr><td>1 % Agarose/CMF-MBS-Platten</td><td></td><td></td><td></td><td>so viele wie die Anzahl der Proben</td></tr><tr><td>E-Cadherin/Fc-Chimäre </td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Lösen Sie 0,1 mg festes E-Cadherin in 100 µl 1x MBS-H, das 40 % Glycerin enthält, um einen 100x Stammpuffer (1,0 mg/ml) herzustellen. Lagern Sie ihn in &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Stellen Sie kurz vor der Verwendung eine 1:100-Verdünnung mit 1x MBS-H her, um eine Arbeitslösung mit 10 µg/ml zu erhalten. Pro Probe benötigen Sie 200 µl dieser Arbeitslösung.</td></tr><tr><td>Fibronectin, 0,1%-Lösung </td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Diese Fertiglösung kann als 50x-Stammlösung verwendet werden. Verdünnen Sie 1:50 mit 1x MBS-H, um 20 &amp;mu;g/mL Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung. Sie benötigen 200 &amp;mu;L pro Probe dieser Arbeitslösung. Ich empfehle ausdrücklich nicht die Verwendung von festem Fibronectin, da es schwierig ist, es in einer Konzentration von 0,1 % zur Herstellung der Stammlösung aufzulösen. Obwohl diese vorgefertigte 0,1-%-Lösung teurer ist, führt sie zu konsistenteren Ergebnissen.</td></tr><tr><td>4 % BSA / MBS-H</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>BSA: Fraktion V, molekularbiologische Qualität</td></tr><tr><td>gelbe Spitzen mit Sigmacote-Beschichtung </td><td>Werkzeug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser Nr. 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm oder 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Druckdichter Silikonisolator</td><td>Werkzeug</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm Tiefe x 20 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Kammerobjektträger</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 Vertiefungen/Objektträger</td></tr><tr><td>Rasterobjektträger</td><td>Werkzeug</td><td></td><td></td><td>oder Finder-Teilung für die Zellzählung</td></tr></tbody></table>

präparation organizer und animal pole explantate aus xenopus laevis embryos und montage eines cell adhesion assay

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt - ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden sind.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Hallo, mein Name ist Sochi Agata. Ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Ken Cho am Fachbereich für Entwicklungszellbiologie der University of California, Irvine. Heute werde ich die Dissektion und Adhäsionsprobe von Animal-Cap-Explanten oder Organisator-Explanten aus dem Frosch-XUS-Embryo zeigen.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Zelladhärenzeigenschaften und die Zellmorphologie von Zellen zu untersuchen, die aus disseziertem Gewebe stammen. Das Verfahren beinhaltet die Dissektion eines bestimmten Gewebes aus dem Xenopus-Froschembryo, wobei die Zellen in einem kalzium- und magnesiumfreien Medium dissoziiert werden. Anschließend werden die dissoziierten Zellen auf eine Objektträgerplatte überführt, die mit einem Zelladhärensmolekül beschichtet ist und ein Medium enthält, das Kalzium und Magnesium aufweist. Mithilfe dieses Verfahrens können wir das Zellverhalten, die Zellmigration und die Adhärenzeigenschaften des dissezierten X one untersuchen.Okay, bei diesem gesamten Verfahren der Embryodissektion und Adhäsionsprobe verwende ich zunächst spezielle Werkzeuge aus Fremdmaterial. Dies ist ein calcium- und magnesiumfreies Einmalküvettenobjektträger, mit 1 % Agarose besch

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Test bewertet die Fähigkeit eines Signalmolekül, hier Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), um kommissuralen Axone neu zu orientieren. Eine Explantation von embryonalen Rückenmark kultiviert wird neben einem Aggregat von COS-Zellen sekretieren der Kandidat Wachstumsfaktoren. Umorientiert kommissuralen Axone wachsen innerhalb der Explantation werden visualisiert durch Immunhistochemie.

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Lernen Sie die Präparation von Organizer- und Animal-Pole-Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen für Zelladhäsionsassays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmigration und Adhäsionseigenschaften.

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