Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen

Hier wird die Darstellung zweier Stopped-Flow-Methoden zur Messung der Reaktionskinetik des DNA-Mismatch-Reparaturproteins MutSα (msh2-msh6). MutSα erkennt Basenpaar-Mismatches in der DNA und leitet die Reparatur über eine durch ATP angetriebene Reaktion ein. Die erste Methode misst die Bindung von MutSα an DNA durch die Zunahme der Fluoreszenz einer 2-Aminopurin-Base, die benachbart zu einem GT-Mismatch-Paar in der DNA positioniert ist. Die Reaktanten werden in einem Stopped-Flow-Instrument gemischt und über die Zeit überwacht, um die Geschwindigkeitskonstante zu bestimmen.

Die zweite Methode misst die TPA-Aktivität von Mush zwei Mush sechs unter Verwendung eines fluoreszierenden Phosphat-Bindungsproteins als Reporter. Die Reaktanten werden in einem gestoppten Durchfluss gemischt und über die Zeit verfolgt. Um die Geschwindigkeitskonstanten für die TP-Hydrolyse und die Phosphatfreisetzung zu bestimmen, verdeutlichen die resultierenden kinetischen Daten den Wirkmechanismus von Mush zwei Mush sechs bei der DNA-Mismatch-Reparatur.

Hallo, ich bin Noah Biro aus dem Labor von MONI in der Abteilung für Molekularbiologie und Biochemie an der Wesleyan University. Hey, ich bin DJ J, ebenfalls aus dem Labor von Man an der Wesleyan University. Und ich bin Chris Dset, ebenfalls aus dem Labor von JI'S.

Heute zeigen wir Ihnen zwei fluoreszenzbasierte Assays, mit denen die Kinetik einer Reaktion im Millisekunden-Zeitraum verfolgt werden kann. In unserem Labor verwenden wir diese Methoden, um zu untersuchen, wie das DA-Reparaturprotein Match2, MutS6, falsch gepaarte Basenpaare in der DNA erkennt und die Reparatur einleitet. Beginnen wir also.

Bevor dieses Verfahren beginnen kann, müssen die erforderlichen Protein- und DNA-Reagenzien leicht verfügbar sein. Beschaffen Sie das Visier-Mush-Two-Mush-Sechs-Protein, das zuvor in *E. coli* überexprimiert und mittels Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie gereinigt wurde. Um die DNA-Reagenzien herzustellen, kaufen Sie einzelsträngige DNA, die mit dem fluoreszenten Nukleotid-Analogon Aminopurin modifiziert ist, reinigen die Stränge durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese und hybridisieren sie, um fehlerhafte Doppelstrang-DNA mit zwei benachbarten Aminopurin-Basen neben einer GT-Fehlpaarung zu erzeugen.

Bereiten Sie auf ähnliche Weise unmarkierte DNA aus nicht modifizierter einzelsträngiger DNA vor. Die hier verwendeten DNA-Sequenzen finden sich im schriftlichen Teil dieses Protokolls. Stellen Sie während des gesamten Verfahrens eine hohe experimentelle Integrität sicher, indem Sie hochwertige Chemikalien verwenden, um fluoreszierende Verunreinigungen zu minimieren.

Filtern Sie außerdem alle Stammlösungen durch eine 0,2-Mikrometer-Membran, um Partikel zu entfernen, die das Stopped-Flow-Instrument verstopfen könnten. Bereiten Sie für die DNA-Bindungsversuche Proben mit einem Endvolumen von 400 Mikrolitern pro Probe vor, was für etwa 10 kinetische Spuren ausreicht. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

Um die Proteintätigkeit zu erhalten, bereiten Sie die DNA-Probe bei 0,12 Mikromolar und die Mush-Zwei-Mush-Sechs-Probe bei 0,8 Mikromolar Konzentration im DNA-Bindungspuffer vor. Dies führt nach der 1:1-Mischung im Stopped-Flow zu Endkonzentrationen von 0,06 Mikromolar DNA und 0,4 Mikromolar Mush-Zwei-Mush-Sechs.

Ein Stopped-Flow-Gerät verwendet einen Antriebsmotor, um die Reaktionslösungen gleichzeitig und schnell aus den Antriebsspritzen in eine Mischvorrichtung zu drücken. Die gemischte Lösung strömt anschließend in eine Beobachtungszelle, um die Datensammlung vorzubereiten und das Instrument einzurichten. Zunächst sicherstellen, dass der Computer und die Steuerung ausgeschaltet sind.

Schalten Sie dann das zirkulierende Wasserbad ein, um die Lampe abzukühlen, und zünden Sie die Lampe an. Stellen Sie das Monochronometer auf die gewünschte Anregungswellenlänge ein, die 315 Nanometer beträgt. Stellen Sie für zwei Aminopurin die SL-Bandbreite auf den gewünschten Wert ein.

Setzen Sie einen 350 Nanometer Sperrfilter an der Fotomultiplierröhre oder PMT ein, um das Fluoreszenssignal der beiden Aminopurine zu sammeln. Schalten Sie die Steuerung und den Computer ein. Schalten Sie anschließend das zirkulierende Wasserbad ein.

Dadurch wird die Wasserjacke um die Antriebsspritzen gefüllt, um die Reaktanz auf der gewünschten Temperatur während des Experiments zu halten. Führen Sie abschließend das Stop-Flow-Programm über das Menü zur P-M-T-H-V-Steuerung aus. Stellen Sie die PMT-Spannung ein, die anfangs variabel sein kann, um die PMT-Empfindlichkeit anzupassen, danach jedoch konstant gehalten werden muss.

Messen Sie während des Experiments den Dunkelstrom, um elektrisches Hintergrundrauschen zu korrigieren. Spülen Sie anschließend die Syringen der gestoppten Fluss-Antriebseinheit und die Beobachtungszelle. Stellen Sie das Probenzuführungsventil auf die Lade-Position.

Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit deionisiertem, filtriertem Wasser. Befestigen Sie die Spritze am Ladeanschluss unterhalb der Antriebsspritze und drücken Sie Wasser zwischen die beiden Spritzen. Wiederholen Sie den Vorgang jeweils zweimal für jede Spritze.

Füllen Sie die Spritze, die im Experiment verwendet werden soll. Danach spülen Sie die Beobachtungszelle, indem Sie die Antriebsspritzen mit Wasser füllen. Schalten Sie das Probenzuführungsventil in die Feuerposition.

Verwenden Sie den Befehl zur Einstellung des Spritzenantriebs, um die Antriebsplatte abzusenken und Wasser durch die Beobachtungszelle und in die Ablaufleitung zu drücken. Achten Sie darauf, den Kolben nicht bis zum Ende der Antriebsspritze vorzuschieben. Heben Sie abschließend die Antriebsplatte an und schalten Sie das Ventil in die Ladeposition.

Einmal mit Reaktionspuffer waschen und die Spritzen entleeren. Um die DNA-Bindungsversuche zu beginnen, überführen Sie jede Probe aus dem Röhrchen in eine frische Ein-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie jede Spritze an einer Ladeöffnung und drücken Sie die Lösung in die Antriebsspritze.

Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Lösung manuell mit intermittierenden Pausen zwischen den beiden Spritzen hin und her drücken. Senken Sie dann die Antriebsplatte, bis sie die Oberseite der Antriebsspritzen berührt. Öffnen Sie zum Datensammeln das Fenster zur Zeiteinstellung der Kanäle.

Wählen Sie den Daten­erfassungs­kanal­modus für die Daten­analyse und die Anzahl der aufzuzeichnenden Spuren aus. Geben Sie die Dauer der Daten­erfassung ein, während der 1000 Datenpunkte erfasst werden. Stellen Sie anschließend das Ventil auf die Brandposition und klicken Sie auf die Schaltfläche „Daten sammeln“.

Dieser Schritt startet das Mischen von mush zwei, mush sechs und DNA, gefolgt vom Beginn der Beobachtung der Reaktion. Die fluoreszierende Emission der Zelle von zwei Aminopurin wird überwacht. Sammeln Sie mindestens fünf kinetische Spuren, um einen Datensatz hoher Qualität zu erhalten, und speichern Sie die Datei, sobald das Experiment abgeschlossen ist.

Öffnen Sie jede Datendatei und mitteln Sie mehrere kinetische Kurven. Speichern Sie anschließend die gemittelten Daten und exportieren Sie sie in ein Diagrammprogramm zur Analyse. Schalten Sie schließlich die Lampe aus und spülen Sie die Spritzen und die Messzelle gründlich mit Wasser aus.

Dann schalten Sie die restliche Ausrüstung aus, mit Ausnahme des zirkulierenden Wasserbades. Dieses bleibt noch weitere 15 Minuten eingeschaltet, um die Lampe abzukühlen. Die kinetischen Daten für die Bindung von MutSα an fehlgepaartes DNA lassen sich am besten durch eine einfache exponentielle Funktion beschreiben, was eine schnelle Assoziationsrate in der Größenordnung von 10⁷ M⁻¹s⁻¹ ergibt. Analog dazu liefern gestoppte Fluss-Experimente die Dissoziationsrate des MutSα–fehlgepaarte DNA-Komplexes, die sehr langsam bei 0,01 bis 0,02 s⁻¹ liegt.

Diese Ergebnisse liefern eine direkte Messung der Geschwindigkeit und Affinität, mit der Mush zwei Mush sechs ein falsch gepaartes Basenpaar während der DNA-Reparaturreaktion bindet. Als Nächstes wird ein Stopped-Flow-Experiment durchgeführt, um die ATPase-Aktivität von Mush zwei Mush sechs zu messen.

Unter Vorstudienzustandsbedingungen für diesen Assay ist es unbedingt erforderlich, die Verwendung von Glas in allen Schritten der Reagenzherstellung zu vermeiden, einschließlich der Protein- und DNA-Reinigung, um den Hintergrundgehalt an Phosphat zu minimieren. Das aus e coli gereinigte und mit dem MDCC-Fluorophor markierte Phosphatbindungsprotein (PBP) wird als Reporter zur Messung der Phosphatfreisetzung nach ATP-Hydrolyse verwendet. M-D-C-C-P-B-P ist ein robuster Reporter für die Kinetik der Vorstudienzustands-ATP-Hydrolyse und der Phosphatfreisetzung. Es bindet Phosphat schnell und mit hoher Affinität, was zu einer starken Zunahme der MDCC-Fluoreszenz führt.

Stellen Sie eine Probe mit vier Mikromolar Mush, zwei Mush sechs Protein mit oder ohne sechs Mikromolar fehlgepaßter DNA her. Bereiten Sie eine weitere Probe mit einem Millimolar frisch gelöstem HEP und 20 Mikromolar M-D-C-C-P-V-P vor, um eventuell vorhandenes kontaminierendes Phosphat zu binden. Geben Sie Purin, Nukleosid, Phosphorylase und sieben Methylguanin zu den Proben hinzu und inkubieren Sie sie mindestens 20 Minuten auf Eis.

Bereiten Sie das Durchfluss-Stopp-Gerät wie zuvor beschrieben vor. Des Weiteren entfernen Sie eventuelle Phosphatkontaminationen aus den Treiberspritzen mit Purin, Nukleosid, Phosphoryl und sieben Methylguanin. Inkubieren Sie 20 Minuten lang. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 425 Nanometer ein und verwenden Sie einen 450-Nanometer-Filter mit einer Abschneidekante zusammen mit dem PMT zur Detektion der M-D-C-C-P-B-P-Fluoreszenz.

Befüllen Sie die Antriebsspritzen mit den Proben, wie zuvor beschrieben. Stellen Sie die Datenerfassungsparameter ein und klicken Sie auf „Daten sammeln“, um Mush Two Mush Six mit einem TP zu mischen, und überwachen Sie die Phosphatfreisetzung durch Mush Two Mush Six sowie den gekoppelten Anstieg der M-D-C-C-P-P-P-Fluoreszenz. Sammeln Sie im Laufe der Zeit mindestens fünf kinetische Spuren, um einen Datensatz hoher Qualität zu erhalten, und speichern Sie die Datei. Mitteln Sie mehrere kinetische Spuren und exportieren Sie die Datendatei zur Analyse, wie zuvor beschrieben. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, um den linearen Zusammenhang zwischen Phosphatkonzentration und M-D-C-C-P-P-P-Fluoreszenz zu bestimmen. Mischen Sie zunächst M-D-C-C-P-P-P mit unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen unter denselben experimentellen Bedingungen im Stopped-Flow.

Tragen Sie dann die maximale M-D-C-C-P-P-P-Fluoreszenz in Abhängigkeit von jeder Phosphatkonzentration für die Kalibrierungskurve auf und verwenden Sie die Steigung, um die Phosphatkonzentration in den Mush-zwei-Mush-sechs-Reaktionen zu bestimmen. Tragen Sie die Phosphatkonzentration über der Zeit auf und passen Sie die Daten an eine exponentielle und lineare Funktion an. Diese Funktion beschreibt einen Burst der A TP-Hydrolyse und Phosphatfreisetzung im prästationären Zustand, gefolgt von der linearen stationären Phase der Reaktion. Die kinetischen Daten zeigen, dass Mush zwei Mush sechs A TP hydrolysiert und Phosphat im ersten katalytischen Umsatz mit einer Geschwindigkeit von 1,4 pro Sekunde freisetzt.

Darauf folgt ein langsamer Schritt in der Reaktion, der nachfolgende Umsätze auf eine siebenfach langsamere, stationäre katalytische Konstante von 0,2 pro Sekunde begrenzt. Wenn jedoch MutS zu einer fehlgepaarten DNA bindet, wird der Burst an ATP-Hydrolyse und Phosphatfreisetzung unterdrückt. Diese Ergebnisse zeigen direkt, dass MutS nach Bindung eines fehlgepaarten Basenpaars in einen ATP-gebundenen Zustand wechselt.

Dieser Schalter ist ein entscheidender Schritt in der DNA-Reparaturreaktion. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Stopp-Fluss-Gerät verwendet, um die Abläufe einer Reaktion in Echtzeit zu messen. Solche Messungen haben unser Verständnis des Wirkmechanismus von MASH zwei, MASH sechs und der DNA-Fehlpaarungsreparatur vorangebracht.

Bei der Durchführung dieser Art von Experimenten ist es wichtig, qualitativ hochwertige Reagenzien zu verwenden, darunter sehr reine DNA und Proteine, und besondere Sorgfalt darauf zu legen, Phosphatkontamination im ATP-Assay auszuschließen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.