Optical Microscopy Scatter auf zweidimensionalen Gabor-Filtern

In diesem Video wird die optische Streumikroskopie verwendet, um die mitochondriale Fragmentierung während der Apoptose zu quantifizieren. Obwohl die optische Streumikroskopie in diesem Protokoll normalerweise keine Fluoreszenz erfordert, werden zu Validierungszwecken Fluoreszenzbilder aufgenommen. Nach dem Aufbau des Bildgebungssystems werden die Zellen mit MIT-Tracker grün markiert und mit Stor-Sporin behandelt, um Apoptose zu induzieren.

Optische Daten werden erfasst, um Veränderungen in der Ausrichtung von Zellorganellen innerhalb von zwei Stunden zu erkennen. Der Beginn der mitochondrialen Fragmentierung kann anhand der optisch gestreuten Daten gemessen werden, die eine Abnahme des Orientierungsgrades der subzellulären Partikel zeigen. Die Daten werden dann validiert, indem die optisch gestreuten Daten mit den fluoreszierenden Regionen korreliert werden, die Mitochondrien enthalten.

Hallo, ich bin Nada Bustani vom Bio Optics Laboratory am Department of Biomedical Engineering der Rutgers University. Ich bin Rob Pak vom Bio Optics Lab, und ich bin Deen, auch vom Bio Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Quantifizierung der subzellulären morphologischen Dynamik mit einer Methode, die nicht auf Fluoreszenzfarbstoffen basiert.

Wir verwenden diese Technik in unserem Labor, um dynamische Veränderungen der subzellulären Struktur während der Apoptose zu untersuchen oder den Zelltod zu programmieren. Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie behandschuhte Hände mit 70% Ethanol sterilisieren.

Geben Sie dann eine vorbereitete 100 Nanomolare Stammlösung aus miot tracker green und prewarm, BAEC-Zellkulturmedium bei ausgeschaltetem Licht in die Haube und sterilisieren Sie alle Oberflächen. Stellen Sie als Nächstes eine Kulturschale mit sechs Vertiefungen mit Zellen auf Deckglas unter die Haube. Mit einer Pastenpipette, die an eine Vakuumleitung angeschlossen ist.

Entnehmen Sie das Zellmedium aus den Vertiefungen. Geben Sie dann sofort zwei Milliliter des markierten Mediums in jede Vertiefung, um die Zellen zu markieren. Mitochondrien. Decken Sie die Gewebekulturplatte ab, um direkte Raumeinstrahlung zu vermeiden, und stellen Sie die Zellen schnell wieder in den Inkubator.

Inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, während die Zellen inkubieren. Bereiten Sie die optische Einrichtung vor und schalten Sie zuerst die Quecksilber-Lichtbogenklemme ein. Schalten Sie dann die Kameras des Computermikroskops ein und stecken Sie den Laser in das digitale Mikrospiegelgerät oder DMD in den sich drehenden Diffusor.

Schauen Sie anschließend durch das Mikroskopokular, um zu sehen, ob der optische Start ausgerichtet ist. Das Sichtfeld sollte durch Laserlicht hell beleuchtet werden. Um die Probe zu laden, geben Sie ein bis zwei kleine Tropfen Immersionsöl auf ein 63-fach-Öl-Immersionsobjektiv, während es ganz nach unten zeigt.

Montieren Sie dann auf dem Tisch eine Folie, die aus einem Gitter von Linien in regelmäßigen Abständen von 10 Mikrometern besteht, die Gradi genannt werden, und heben Sie das Objektiv an, so dass das Öl seinen Fokus aufnimmt. Fokussieren Sie als Nächstes die sechseckige Kante des Kondensatorfeldes. Stoppen Sie so, dass es in der zentralen Kohler-Beleuchtung ausgerichtet ist.

Der sechseckige Rand sollte im Okular zentriert und scharf fokussiert sein. Dann mit den Reglern für die Stoppposition des Kondensatorfelds zentrieren Sie das Kondensatorfeld und stoppen Sie über dem Sichtfeld. Starten Sie IP lab und geben Sie die Einstellungen ein, um die Kamera zu bedienen.

Vergewissern Sie sich, dass die Kamera auf den Frame-Übertragungsmodus eingestellt ist. Führen Sie den Befehl zum Abrufen des Fokus aus, um die Livevorschau zu starten. Legen Sie dann das Indexpräfix und den Dateispeicherort fest, an dem die Bilder gespeichert werden.

Initiieren Sie als Nächstes das RS-Image. Legen Sie die Einstellungen fest, um die coole Snap-Kamera zu bedienen. Der Taktmodus sollte auf normal gestellt sein.

Starten Sie die DMD-Software. Platzieren Sie die Dunkelfeld-Iris im Skriptmenü. Klicken Sie dann auf Laden und zurücksetzen.

Um das Skript manuell auszuführen, legen Sie die Optivleiste des Mikroskops im Ansichtsfenster auf LSM fest. Dadurch wird das Bild durch das DMD in der ausgerichteten Optik gesendet. Projizieren des Dunkelfeldbildes auf den CCD der Cascade five 12 Kamera.

Das Dunkelfeldbild sollte in der Live-Vorschau in IP lab angezeigt werden. Fokussieren Sie das Bild bei Bedarf auf die Live-Vorschau. Stellen Sie die Belichtungszeit hoch genug ein, um sicherzustellen, dass mindestens 10.000 Zählungen Signal im Bild vorhanden sind.

Machen Sie dann nach der Erfassung einen Schnappschuss des Sichtfelds mit dem Befehl acquire single. Verwenden Sie den Befehl "Als indiziert speichern", um das Image auf der Disc zu speichern. Das Bild des GTI misst die Größe des Sichtfeldes.

Verschieben Sie nun das GTI-Sample so, dass es sich außerhalb des Sichtfeldes befindet und nur der Hintergrund zu sehen ist. Nehmen Sie ein Hintergrundbild des Feldes mit einer Belichtungszeit auf, die ausreicht, um mindestens 5.000 Zählungen zu erfassen. Dieses Bild hilft bei der Hintergrundsubtraktion der ungefilterten Bilder.

Um nun von Gabor gefilterte Bilder des Hintergrunds zu erhalten, laden Sie das Skript der Gabor Filter Bank in die DMD-Steuerungssoftware. Führen Sie das gesamte Skript aus, um die Filter im integrierten Speicher des DMD zu puffern. Dies kann einige Minuten dauern, nachdem das gesamte Skript gepuffert wurde.

Verwenden Sie die Start- und Stopp-Marker in der DMD-Software, um sicherzustellen, dass jeweils nur ein Satz Filter, der einem Gabor Like Filter entspricht, geladen wird. Führen Sie das Skript aus, um gefilterte Bilder des Hintergrunds abzurufen. Die Livebildvorschau sollte vom Dunkelfeld zum gefilterten Bild wechseln.

Öffnen Sie für diesen Filter das Erfassungsskript in IP lab von der Disc. Passen Sie die Belichtungszeit an, um sicherzustellen, dass mindestens 2000 Zählungen erfasst werden. Während das DMD-Skript ausgeführt wird, brechen Sie die Livevorschau in IP Lab ab, und führen Sie das Erfassungsskript aus.

Dadurch wird das gefilterte Bild automatisch indiziert und auf der Disc gespeichert. Nachdem das erste Image abgerufen wurde, beenden Sie die Ausführung des Skripts in DMD. Löschen Sie die verwendeten Befehle aus dem Skript.

Ersetzen Sie dann die Start- und Stoppmarkierungen am Anfang und Ende des nächsten Filtersatzes. Wiederholen Sie die Erfassung in IP Lab, bis die gesamte Filterbank verwendet und alle gefilterten Bilder erfasst und gespeichert wurden. Bereiten Sie die Beschichtung der Zellen vor, indem Sie einen Lötkolben an die Labortischplatte anschließen und das Medium L 15 auf 37 Grad Celsius erhitzen.

Richten Sie einen Arbeitsplatz mit einem Papiertuch und einem Kim-Tuch ein, um verschüttetes Medium aufzusaugen und den Bereich sauber zu halten. Bereiten Sie mehrere Dochte vor, indem Sie Kimm-Tücher zerreißen und schwenken. Die Dochte werden verwendet, um die Flüssigkeit durch die Zellplatte zu ziehen.

Verwenden Sie anschließend den Probenhalter aus Metall, um ein Zellsandwich zu erstellen. Tragen Sie mit einer Spritze eine dünne Kugel Vakuumfett um den oberen Umfang des Lochs in der bearbeiteten Metallplatte auf, die sich etwa auf halber Höhe bis zu den Enden der Rillen auf jeder Seite erstreckt. Führen Sie vorsichtig einen sauberen Deckzettel Nummer eins auf das Fett.

Drehen Sie die Platte um und tragen Sie das Fett um das Loch herum auf. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, indem Sie mit Ethanol sterilisierte NI-Untersuchungshandschuhe tragen. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator.

Entfernen Sie den Deckglas, der für das Experiment verwendet wird, von der Sechs-Well-Platte. Trocknen Sie den Deckglas sorgfältig ab. Drücken Sie dann die Abdeckung mit der Schiebezelle nach unten in die gefettete Metallplatte über dem Sichtloch.

Sandwichieren Sie die Zellen in der Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Luftspalte zurückbleiben und dass das Fett eine wasserdichte Abdichtung gebildet hat, damit das Medium geladen werden kann. Drehen Sie nun die Platte zurück und pipettieren Sie jeweils 200 Mikroliter.

Geben Sie vorwärmtes L 15 medium durch die Nut zwischen dem oberen Deckglas und der Metallplatte in das Sandwich, bis die Flüssigkeit auf der anderen Seite fast die Nut erreicht. Waschen Sie anschließend die Zellen, indem Sie einen Docht an die gegenüberliegende Rille halten und weitere 200 Mikroliter Medium in das Sandwich pipettieren. Das Medium fließt von einer Seite zur anderen, da der Docht altes Medium entfernt.

Achten Sie darauf, dass sich während dieses Schritts keine Blasen in der Flüssigkeit bilden. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal mit einem neuen Docht für jede Spülung. Drehen Sie nun die Platte wieder um und stützen Sie die Platte von den Rändern ab, um die Flüssigkeit im Zellreservoir einzuschließen.

Tauchen Sie den Lötkolben in den Becherglas, um schnell einen Teil des Lötkolbens zu schmelzen, der dann an der Lötkolbenspitze haftet. Tragen Sie die Häutung vorsichtig mit der Lötkolbenspitze um die Ränder des unteren Deckglases auf. Tauchen Sie weiter und tragen Sie es vollständig um den Deckglasumfang herum auf und versiegeln Sie ihn mit der Metallplatte.

Dadurch entsteht eine gute Gleitringdichtung, so dass sich der Deckglas beim Betrachten nicht von der Platte löst. Reinigen Sie alle Rückstände von der Unterseite. Schieben Sie die Oberfläche des Bezuges auf, indem Sie ein Kim-Tuch aufblasen und den Bezug reinigen.

Gleiten Sie mit einer einzigen Gleitbewegung, um sicherzustellen, dass der Deckglas in der Mitte, wo er angezeigt wird, am saubersten ist. Setzen Sie die sechswandige Platte wieder in den Inkubator ein. Bringen Sie die plattierten Zellen ins Optiklabor und montieren Sie sie auf das Objektiv.

Suchen Sie wie zuvor ein Feld mit gesund aussehenden Zellen und erfassen Sie ein Dunkelfeldbild des Sichtfelds. Richten Sie dann das Mikroskop auf DIC aus und stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeiten angemessen sind. Erfassen Sie ein DIC-Bild mit einer Kaskadenkamera.

Bei diesem Aufbau werden Fluoreszenzbilder mit der kühlen SNAP-Kamera aufgenommen, während das Mikroskop noch im DIC ausgerichtet ist. Stellen Sie den VAR des Mikroskops auf ein x und das Ansichtsfenster auf 100 % binokular ein und lenken Sie das Bild vom Okular auf die Kamera. Platzieren Sie eine blaue LED über dem Kondensor, um das Feld zu beleuchten.

Zeigen Sie dann eine Vorschau des Sichtfelds im RSS-Bild an und stellen Sie den Feinfokus ein. Rufen Sie bei Bedarf ein DIC-Image auf und speichern Sie es auf Disc. Beachten Sie, wie sich das Sichtfeld von dem der Kaskadenkamera unterscheidet.

Diese Bilder müssen während der Analysephase des Experiments registriert werden. Bringen Sie als Nächstes den Fluoreszenzfilterwürfel in Position und nehmen Sie ein Fluoreszenzbild auf, indem Sie die Fluoreszenzanregung mit dem Mikroskopverschluss kurz einschalten und dann ausschalten, sobald die Aufnahme abgeschlossen ist. Um Photobleaching zu minimieren, speichern Sie das Fluoreszenzbild auf Disc.

Um gefilterte Bilder aufzunehmen, setzen Sie das Mikroskop auf Feld zurück und senden Sie das Licht durch den LSM-Anschluss. Führen Sie wie zuvor das gesamte Skript der Gabor-Filterbank wie zuvor aus, um die Datenerfassung für einen Zeitpunkt abzuschließen, während sich die Zellen noch auf der Bühne befinden und ohne das Sichtfeld zu stören. Verwenden Sie die Dochtmethode, um das normale L 15-Medium gegen dasselbe auszutauschen, das eine mikromolare STS-Lösung enthält.

Fügen Sie im Verlauf des Experiments zusätzliches Medium hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern, indem Sie das Medium in die Rille der Zellplatte pipettieren, ohne es vom Tisch zu entfernen oder das Sichtfeld zu stören. Wiederholen Sie diese Schritte nun für nachfolgende Zeitpunkte, bis das Experiment abgeschlossen ist. Die gesammelten Daten werden eine große Anzahl von gefilterten Bildern enthalten, die verarbeitet werden müssen, um die subzellulären Strukturdaten zu extrahieren.

Hier werden zwei Beispielversuche gezeigt. Diese Abbildung zeigt sequenzielle Bilder einer Probe von Kieselalgen im Meer. Die orientierten Merkmale sind deutlich sichtbar.

In der Dunkelfeld-Bildgebung. Die optisch gefilterten Bilder, die mit fünf gleich null Grad bis fünf gleich 160 Grad gekennzeichnet sind, werden neben dem ungefilterten Bild der Probe angezeigt. Zum Vergleich wurden die neun Gabor-gefilterten Bilder der Kieselalge Pixel für Pixel für die Objektorientierung verarbeitet.

Bei jedem Pixel wurde das maximale Signal durch das durchschnittliche Signal in Abhängigkeit von der Filterausrichtung dividiert, um einen Wert für das Seitenverhältnis zu erhalten. Hier liegt in Bereichen, in denen es keinen bevorzugten Ansprechwinkel gibt, ein Seitenverhältnis nahe dem durch Blau angezeigten Verhältnis vor. Größere Werte, die durch Rot gekennzeichnet sind, weisen auf Bereiche hin, in denen ein höherer bevorzugter Winkelverlauf vorhanden ist.

Die Helligkeit und Codebedeutung der gesamten GABOR-Filterreaktion, die Filterausrichtung, die das maximale Signal an jedem Pixel liefert, entspricht der Richtung senkrecht zur zugrunde liegenden Objektausrichtung. Die Partikelausrichtung der Unterstruktur wird in einem Köcherdiagramm kodiert, bei dem jede Linie eng mit der zugrunde liegenden lokalen Objektausrichtung übereinstimmt, die im ungefilterten Dunkelfeld sichtbar ist. Das Köcherdiagramm zeigt die Ausrichtung von Objekten mit einer Reaktionsintensität von mehr als 10 % des Maximums.

Diese Dunkelfeld- und optisch gefilterten Bilder eines Feldes enthielten lebende Rinderendothelzellen, gefilterte Bilder wurden anschließend alle 20 Minuten über einen Zeitraum von drei Stunden nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Stor Sporin aufgenommen. Hier werden die Seitenverhältniskarte im oberen Bereich und die Fluoreszenzbildgebung der Mitochondrien im unteren Bereich als Funktion der Zeit dargestellt. Der Farbton stellt den Orientierungsgrad dar, da vor diesen Zeitdiagrammen die Abnahme des Orientierungsgrades des Partikel-Seitenverhältnisses in Endothelzellen, die mit s thoro sporin behandelt wurden, verglichen wurde, die einzelnen Spuren stellen Zeitdiagramme innerhalb einzelner Zellen dar.

Die Drop-in-Orientierung ist auf die Bereiche der Zellen beschränkt, die sich mit fluoreszierenden Bereichen registrieren. Nun ist die Validierung gegen Fluoreszenz erreicht. Es wird archivarisch.

So können in den nächsten Experimenten die mitochondrialen Messungen unter Weglassen der Fluoreszenzbildgebungsschritte und direkt unter Verwendung der optischen Streumethode durchgeführt werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die mitochondriale Fragmentierung während der Apoptose mithilfe von Lichtstreusignaturen auf Basis von Gabor-Filtern überwachen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich gut auf den Lebensstil vorzubereiten und sicherzustellen, dass der optische Aufbau gut ausgerichtet und kalibriert ist.

Nehmen wir also Sinn für das Anschauen und CoLab mit UI-Experimenten.