Name: Linearisierung der Bradford Protein Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Linearisierung der Bradford-Protein-Assay für präzise Proteinquantifizierung in der Biochemie. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit um das Zehnfache und reduziert Detergenzstörungen signifikant.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Papier ist dem Andenken des verstorbenen Dr. Zvi Selinger, der das Original hier beschriebenen Untersuchungen gehostet gewidmet.

Linearisierung der Bradford Protein Eichkurve: Die Coomassie Brilliant Blue-Protein-Assay, die gemeinhin als Bradford-Assay 1 bekannt, ist weithin wegen seiner schnellen und komfortablen Protokoll sowie die relative Empfindlichkeit eingesetzt. Leider gibt es ein großes Maß an Krümmung über ein breites Spektrum von Protein-Konzentrationen (Abb. 1). Daher ist nur ein schmales Spektrum von relativ hohen Protein-Konzentrationen, 2-10 mg / ml BSA, für die Eichkurve, die dann besser passt lineare Regression (Abb. 1, grün) verwendet. Allerdings erfordert die Nichtlinearität Proteinkonzentration der unbekannten Proben innerhalb der begrenzten Reichweite der Eichkurve fallen, um einen großen Fehler zu vermeiden, und es reduziert auch die Genauigkeit innerhalb der begrenzten Reichweite. Die Nichtlinearität stellt ein ernstes Problem insbesondere bei Mikrogramm-Mengen des Proteins nicht zur Verfügung stehen, und es erfordert oft mehrere Verdünnungen der unbekannten Proben. Wie in der ursprünglichen Bradford Papier darauf hingewiesen, "die Quelle der Nichtlinearität ist im Reagens selbst, da gibt es eine Überschneidung in das Spektrum der beiden anderen Farbe Formen des Farbstoffs." 1. In der Tat sind drei Formen des Coomassie Brilliant Blue Farbstoff in Säure-Basen-Gleichgewicht bei den üblichen sauren pH-Wert des Tests 2. Die roten, blauen und grünen Formen haben Absorptionsmaxima bei 470, 590 und 650 nm (Abb. 2). Das Blau ist die Form, die das Protein bindet, einen Komplex bilden, die sich intensiv absorbiert Licht bei 594 nm 3, 4 (Abb. 2). Bradford auch darauf hingewiesen, dass "die Hintergrund-Wert für das Reagens kontinuierlich abnimmt, da mehr Farbstoff an Protein gebunden ist" 1 (Abb. 3). Deshalb haben wir versucht, die Reduzierung der 590 nm Hintergrund zu berechnen, als zunehmende Protein Mengen zugesetzt werden, durch Messung der Änderung der Absorption bei 450 nm, wobei die Protein-Farbstoff-Komplex nicht absorbiert. Wir fanden, dass die abnehmende Hintergrund teilweise, aber nicht vollständig, Konten für die Nichtlinearität (Abb. 4). Wir haben dann vermutet, dass die Abnahme der freien Farbstoffkonzentration weitere Verzerrung der linearen Antwort produziert, weil sie als Protein-Farbstoff-Bindung ist im Gleichgewicht 5, hängt Komplexbildung nicht nur von der Konzentration des freien Proteins, sondern auch auf, dass der freie Farbstoff (Abb. 5). Unter Berücksichtigung sowohl der Fragen im Zusammenhang mit der variablen Konzentration des freien Farbstoffes, entwickelten wir eine mathematische Gleichung, die eine lineare Beziehung zwischen Proteinkonzentration und das Verhältnis von Absorptionsmessungen, 590 nm auf 450 nm (Abb. 6) beschreibt. Eine detaillierte Beschreibung der theoretischen und experimentellen Studie finden Sie in unserem 1996 Publikation in Analytical Biochemistry 6 zu finden. Die mathematische Gleichung wurde experimentell getestet und eine lineare Eichkurve über den gesamten Protein-Konzentrationen Bereich (Abb. 7) ergeben. Darüber hinaus wurde die Gleichung auch durch eine unabhängige Ermittlung der richtigen pH-abhängige Wert der Y-Achsenabschnitt 6 validiert. Detaillierte Protokoll für die Verbesserung der Bradford Protein Assay, mit einem Mikrotiterplatten-Absorption Reader: <ol><li> Bereiten Sie eine 0,1 mg / ml Stammlösung von der Norm, Rinderserumalbumin. Jede andere Norm kann gewählt werden, aber beachten Sie, dass den gleichen Standard in allen Experimenten verwendet werden muss. </li><li> Verdünnen Sie die unbekannten Proben in deionisiertem Wasser. Aim auf 5-50 pg / ml. Dennoch sind höher oder niedriger Proteinkonzentrationen akzeptabel, da es anscheinend keine Begrenzung für die lineare Bereich des Assays. Allerdings muss die Messung im linearen Bereich der Absorption Leser. </li><li> Verdünnen Sie die Bradford-Reagenz (Bio-Rad) 2,5-fach in deionisiertem Wasser. </li><li> Add 0 und 10-50 ul BSA-Stammlösung zu dreifachen Wells (Erstellen einer 0-5 pg BSA Eichkurve). Ergänzung mit deionisiertem Wasser auf 100 ul / well erreichen. </li><li> In verschiedenen Vertiefungen, 100 ul der unbekannten Probe in dreifacher Ausführung. Mehrere Konzentrationen der unbekannten Probe kann verwendet werden, um die Genauigkeit zu erhöhen. </li><li> 100 l der verdünnten Bradford-Reagenz in alle Vertiefungen. Das Gesamtvolumen beträgt 200 ul / well. </li><li> Warten Sie mindestens 5 min, aber nicht mehr als 60 min zur Farbentwicklung. </li><li> Der Blank muss 200 ul entionisiertem Wasser (und nicht die Null-Protein-Farbstoff gut) sein. </li><li> Die Absorption bei 590 nm und 450 nm. </li><li> Bereiten Sie eine Eichkurve, indem das Nettovermögen Absorptionswerte bei 590 nm und 450 nm. Beachten Sie, dass die Null-Protein (Farbstoff nur) Wert als einen Datenpunkt (Abb. 8) einbezogen werden sollten. </li><li> Berechnen Sie die Konzentration der unbekannten Probe auf der linearen Gleichung der Eichkurve (Abb. 9). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Anders als die Absorption bei einer Wellenlänge von 590 nm, das Verhältnis der Absorptionswerte, 590 nm auf 450 nm, ist linear wit-Protein-Konzentration (Abb. 10). Die Proteinkonzentration der unbekannten Probe kann einfach berechnet werden nach der linearen Gleichung der Eichkurve (Abb. 10, Gleichung). Allerdings ist eine höhere Genauigkeit durch Messung mehrere unbekannte Probenverdünnungen erhalten. Zu diesem Zweck bereiten zwei Graphen. Die erste ist eine Eichkurve für den Standard mit ug Protein auf der X-Achse (Abb. 11, rechts). Die zweite Grafik ist für die unbekannte Probe mit ul der ursprünglichen Probe unverdünnt auf die X-Achse (Abb. 11, links). Der Farbstoff nur Wert sollte in beiden Diagrammen aufgenommen werden (Abb. 11). Die Proteinkonzentration der unbekannten Probe wird ermittelt, indem die Hänge der unbekannten Probe und die Standard-(Abb. 11, Gleichung) abgeleitet. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Konventionelle Bradford Eichkurve. Der lineare Bereich ist von grünen Symbolen dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Spectra der Protein-Farbstoff-Komplexes und der Farbstoff allein. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Protein-Farbstoff-Gleichgewicht. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Reduktion der korrekten Berechnung Hintergrund teilweise abnimmt Nichtlinearität. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Protein-Farbstoff-Gleichgewicht. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Mathematische Grundlage für die Linearisierung des Bradford-Protein-Assay. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Linearisierung der Bradford Eichkurve. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Abbildung 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Berechnung der Absorption Ratio-Werte. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Abbildung 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. Eine lineare Bradford Eichkurve. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Abbildung 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 10"> Abbildung 10. Linearisierung der Bradford Eichkurve. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Abbildung 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 11"> Abbildung 11. Unknown Probe-Konzentration Berechnung.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Die Bradford-Protein-Assay ist beliebt wegen seiner einfachen Leistung und relative Empfindlichkeit. Die Linearisierung über den gesamten Protein-Konzentrationen Bereich durch das Protokoll erhalten hier vorgestellten weiter vereinfacht den Test, wie die unbekannten Proben müssen sich nicht innerhalb des Bereiches der Eichkurve fallen. Wichtig ist, dass die verbesserte Protokoll weiteren bietet die folgenden Vorteile gegenüber dem ursprünglichen Bradford-Protokoll: <ol><li> Erhöhte Genau...

<table><tbody><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Absorptionsreader</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linearisierung der bradford protein assay

Linearization of the Bradford Protein Assay

Bestimmung von Mikrogramm-Mengen des Proteins in der Bradford Coomassie Brilliant Blue Assay wird durch Messung der Absorption bei 590 nm erreicht. Das häufigste Assay ermöglicht die schnelle und einfache Proteinquantifizierung in Zelllysaten, Zellfraktionen oder rekombinantes Protein-Proben, zum Zweck der Normalisierung der biochemischen Messungen. Doch Kompromisse eine intrinsische Nichtlinearität der Empfindlichkeit und Genauigkeit dieser Methode. Es wird gezeigt, dass unter normalen Testbedingungen, das Verhältnis der Absorptionsmessungen bei 590 nm und 450 nm streng linear mit Protein-Konzentration ist. Dieses einfache Verfahren erhöht die Genauigkeit und verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, erlauben die Quantifizierung bis zu 50 ng Rinderserumalbumin. Darüber hinaus ist die Störung häufig von Reinigungsmitteln verwendet werden, um den Zelllysaten erstellen eingeführt stark durch das neue Protokoll reduziert. Eine lineare Gleichung auf der Basis von Massenaktionen und Beer-Gesetz entwickelt passt perfekt zu den experimentellen Daten.

Die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Protein-Bestimmung durch die schnelle und bequeme Bradford Assay wird durch intrinsische Nichtlinearität beeinträchtigt. Wir zeigen eine einfache Linearisierung Verfahren, das erhöht die Genauigkeit, verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, und reduziert Störungen durch Reinigungsmittel.

Linearisierung der Bradford Protein Assay

Die Bestimmung von Proteinmengen im Mikrogrammbereich im Bradford-Assay mit Coomassie-Brillant-Blau erfolgt durch die Messung der Extinktion bei 590 nm.

Der Bradford-Proteintest beginnt mit der Zugabe einer BSA-Standardlösung in zunehmenden Mengen sowie Verdünnungen einer unbekannten Probe in eine 96-Loch-Platte; destilliertes Wasser wird hinzugefügt, um das variable Volumen aufzufüllen. Anschließend wird das Bradford-Reagenz in alle Vertiefungen außer in die Blindprobe gegeben, die nach fünf Minuten nur Wasser enthalten darf. Die Absorption wird bei 590 Nanometern zur Detektion des Protein-Farbstoff-Komplexes sowie bei 450 Nanometern gemessen.Für die Linearisierung des Graphen ist das Verhältnis der Absorptionswerte bei 590 Nanometern und bei 450 Nanometern streng linear zur Proteinmenge. Hallo, ich komme aus dem Fachbereich Biochemie der Universität Tel Aviv, Israel, ich bin O. T. aus dem Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Bestimmung der Proteinmenge unter Verwendung eines verbesserten linearisierten Bradford-Protokolls.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Proteinmenge in SZaS zu normalisieren, beispielsweise bevor wir Gele beladen. Beginnen wir also. Bei dem Bradford-Assay befinden sich drei Formen des Kumasi-Brilliantblau-Farbstoffs bei dem üblichen sauren pH-Wert des Assays in einem Säure-Base-Gleichgewicht.Die rote, blaue und grüne Form weisen Absorptionsmaxima bei 470, 590 und 650 Nanometern auf. Die blaue Form bindet das Protein und bildet einen Komplex, der Licht bei 594 Nanometern intensiv absorbiert. Dieser weit verbreitete Nachweis weist über einen weiten Bereich an Protein-Konzentrationen einen hohen Grad an Krümmung auf.Daher wird für die Kalibrierungskurve nur ein enger Bereich relativ hoher Protein-Konzentrationen verwendet, wodurch die lineare Regression besser passt. Eine Quelle der Nichtlinearität ist die Absorption bei 590 Nanometern des freien Farbstoffs, die abnimmt, wenn zunehmende Proteinmengen zugegeben werden. Die Nichtlinearität wird teilweise verringert, indem die Änderung der Absorption bei 450 Nanometern gemessen wird, wo der Farbstoff selbst, nicht jedoch der Protein-Farbstoff-Komplex, absorbiert.Und durch die Subtraktion des korrekt berechneten Blindwertes verursacht die Abnahme der freien Farbstoffkonzentration eine weitere Verzerrung der linearen Antwort, da die Komplexbildung aufgrund des Gleichgewichts zwischen Protein und Farbstoff nicht nur von der Konzentration des freien Proteins, sondern auch von der des freien Farbstoffs abhängt. Unter Berücksichtigung beider Aspekte, die mit der variablen Konzentration des freien Farbstoffs zusammenhängen, wurde eine mathematische Gleichung entwickelt, die eine lineare Beziehung zwischen der Protein-Konzentration und dem Verhältnis der Absorptionsmessungen bei 590 Nanometern zu 450 Nanometern beschreibt.Die mathematische Gleichung wurde experimentell überprüft und ergab eine lineare Kalibrierungskurve über den gesamten Bereich der Protein-Konzentration. Bereiten Sie zunächst eine Stammösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin vor. Es kann ein anderer Standard gewählt werden, beachten Sie jedoch, dass derselbe Standard in allen Experimenten verwendet werden muss.Verdünnen Sie die unbekannten Proben in entionisiertem Wasser. Streben Sie fünf bis 50 Mikrogramm pro Milliliter an, jedoch sind höhere oder niedrigere Protein-Konzentrationen akzeptabel, da keine offensichtliche Grenze für den linearen Bereich des Assays besteht. Beachten Sie jedoch, dass die Messung innerhalb des linearen Bereichs des Absorptionsmessgeräts liegen muss.Verdünnen Sie außerdem das Bradford-Reagenz 2,5-fach in entionisiertem Wasser. Geben Sie anschließend null sowie fünf bis 50 Mikroliter der BSA-Stammlösung in jeweils drei Wiederholungen in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte, um eine Kalibrierkurve von null bis fünf Mikrogramm BSA zu erstellen, und ergänzen Sie mit entionisiertem Wasser auf 100 Mikroliter pro Vertiefung in verschiedenen Vertiefungen. Bei 100 Mikrolitern unbekannter Probe in dreifacher Ausführung können mehrere Konzentrationen der unbekannten Probe verwendet werden, um die Genauigkeit zu erhöhen.Schließlich 100 Mikroliter des verdünnten Bradford-Reagens zu allen Vertiefungen hinzufügen. Das Gesamtvolumen beträgt 200 Mikroliter pro Vertiefung. Bereiten Sie außerdem eine Blindprobe zur Messung der Extinktion vor.Dies muss 200 Mikroliter entionisiertes Wasser und nicht die Null-Protein-Färbung sein. Lassen Sie mindestens fünf Minuten, jedoch nicht länger als 60 Minuten, für die Farbentwicklung verstreichen.Messen Sie die Absorption bei 590 Nanometern und bei 450 Nanometern. Verwenden Sie Wasser für die Blindmessung. Erstellen Sie ein Kalibrierungsdiagramm, indem Sie die Nettoabsorptionswerte bei 590 Nanometern und bei 450 Nanometern dividieren.Beachten Sie, dass der Wert für null Protein als Datenpunkt einbezogen werden sollte. Berechnen Sie die Konzentration der unbekannten Probe anhand der linearen Gleichung der Kalibrierungskurve. Im Gegensatz zur Extinktion bei einer einzelnen Wellenlänge von 590 Nanometern ist das Verhältnis der Extinktionswerte von 590 Nanometern zu 450 Nanometern linear zur Protein-Konzentration. Die Proteinkonzentration der unbekannten Probe kann einfach anhand der linearen Gleichung der Kalibrierkurve berechnet werden. Eine höhere Genauigkeit wird jedoch erreicht, indem mehrere Verdünnungen der unbekannten Probe gemessen werden. Zu diesem Zweck erstellen Sie zwei Diagramme.Die erste ist eine Kalibrierungskurve für den Standard mit Mikrogramm Protein auf der x-Achse. Die zweite Grafik betrifft die unbekannte Probe mit Mikrolitern der ursprünglichen, unverdünnten Probe auf der x-Achse. Der Wert für das Farbstoff-allein sollte in beide Grafiken einbezogen werden.Die Proteinkonzentration der unbekannten Probe wird durch Division der Steigungen der unbekannten Probe und des Standards ermittelt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Proteinkonzentration mithilfe eines verbesserten, linearisierten Bradford-Verfahrens bestimmt. Die Anwendung dieses Verfahrens erhöht die Genauigkeit des Nachweises erheblich, verbessert die Empfindlichkeit um etwa das 10-Fache und verringert Störungen durch Detergenzien signifikant.Es ist wichtig, daran zu denken, das geeignete Blindpräparat zu verwenden, das Wasser ist, anstelle der Protein-freien Farbstoffprobe. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

linearization-of-the-bradford-protein-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mikrovolumen Proben werden mit einem Spektrophotometer, das natürliche Oberflächenspannung verwendet, um Proben ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren behalten quantifiziert. Der dynamische Bereich des Protein-Konzentrationen und die Geschwindigkeit, mit denen sie gemessen werden können, sind stark mit dieser Methode erhöht.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Das Video zeigt eine auf der Normalisierung von Gesamtproteinen basierende Western-Blotting-Technik zur Quantifizierung der Zielproteinexpression in einer Probe. Unter Verwendung der Gesamtproteinfärbung der Probe wird eine ratiometrische Analyse durchgeführt, um das relative Expressionsniveau des Zielproteins zu bestimmen.

Quantitatives Western Blot zur Abschätzung der Proteinexpressionsniveaus

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Eine Kapillare-basierte Immunoassay mit einer kommerziellen Plattform zu Zielproteine von Gesamtprotein Vorbereitungen messen wird demonstriert. Darüber hinaus sind Assay Parametern Belichtungszeit, Proteinkonzentration und Antikörper-Verdünnung für ein Zellkultursystem Modell optimiert.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aktinkometen auf den Oberflächen von Perlen mit kommerziell erhältlichen Proteinbestandteilen hergestellt werden können. Solche Systeme ahmen die hervorstehenden Strukturen in Zellen nach und können verwendet werden, um physiologische Mechanismen der Kraftproduktion auf vereinfachte Weise zu untersuchen.

Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Proteinquantifizierung mit dem Bradford-Assay und einem Smartphone als Analysegerät. Der Proteingehalt in Proben kann anhand von Farbdaten quantifiziert werden, die aus einem mit einem Smartphone aufgenommenen Bild einer Mikrotiterplatte extrahiert werden.

RGBradford: Proteinquantifizierung mit einer Smartphone-Kamera

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind.  Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Erfahren Sie die Linearisierung der Bradford-Protein-Assay für präzise Proteinquantifizierung in der Biochemie. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit um das Zehnfache und reduziert Detergenzstörungen signifikant.

Linearisierung der Bradford Protein Assay

Weitere Videos entdecken