Name: Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Transplantation von GFP-markierten Blastomeren in Zebrafischembryonen für Live-Imaging. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Netzhaut- und Gehirnentwicklung in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH Grant R01EY016099 und Forschung zur Erblindung Career Development Award Prevent: Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) und die folgenden Mittel zur XW unterstützt. Wir bedanken uns bei Kira Lathrop um Hilfe bei der konfokalen Bildgebung.

Tag 1. Vorbereitung 1. Set up Fisch Kreuze Set up paarweise Kreuze Zebrafisch in den Abend. Um zu verhindern, zufällige Paarung vor der gewünschten Zeit nutzen, um so zu den weiblichen und männlichen Fischen in der Paarung Kassetten zu trennen. GFP-exprimierenden transgenen Fische sind als eine Quelle der Spender Blastomeren verwendet. Die pt104 transgene Linie (Zou et al., 2008), hier verwendet wird, drückt GFP ubiquitär unter der Kontrolle des EF1-Promotor. GFP-Expression ermöglicht die Visualisierung von Spenderzellen mit Live-Bildgebung. Andere transgene Fische Linien, die geeignete fluoreszierende Proteine ​​exprimieren können für spezielle Bedürfnisse verwendet werden. 2. Bereiten keilförmige Agarose Brunnen für die Aufbewahrung des Embryos Gießen geschmolzen 1% Agarose in E3 Ei Wasser (Westerfield, 2007) vorbereitet, in eine Petrischale. Float eine plastische Form, die keilförmigen Vorsprünge auf dem Agarose-Lösung und lassen Sie die Agarose-Lösung vollständig erstarren. Entfernen Sie den Schimmel vorsichtig und tauchen die Agarose Bett mit E3 Wasser. 3. Bereiten Transplantation Nadeln Verwenden Sie eine vertikale Needle Puller (David Kopf Instruments) bei Leistungsstufe 11,5 auf Nadeln, indem Glaskapillare Pipetten (World Precision Instruments) zu machen. Gute Nadelspitzen sollte Kegel mit langen Wellen. Grind die Nadelspitzen in einem 45-Grad-Winkel mit einer Micro Grinder (Marishige) bis abgeschrägten Öffnungen der 40-45μm Innendurchmesser erhalten (Abb. 1A). So bereinigen Sie die Nadelspitzen, legen einen Schlauch an das stumpfe Ende der Nadel, verbinden Sie den Schlauch mit einer Spritze, und dann saugen und lassen Sie eine 10% ige Flusssäure-Lösung, bis alle sichtbaren Verschmutzungen entfernt. Anschließend waschen Sie sie mit destilliertem Wasser, um 100% Ethanol gefolgt. Der Luft trocknen die Nadeln, bis alle Ethanol verdunstet. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spitzen trocken sind: Restethanol werden die Nadeln während der Hochtemperatur-Polierschritt ruinieren. Zu erweichen und zu polieren die Ecken und Kanten der Nadelspitzen, backen die Nadelspitzen mit der Wärme, die durch das Filament eines Micro Forger (Marishige) generiert. Lassen Sie sich nicht die Nadelspitzen berühren den Faden beim Polieren. Die Menge an Strom vorbei wenn der Faden und der Abstand zwischen dem Filament und die Nadelspitzen können angepasst werden, um gewünschte Erwärmung Bedingungen zu erreichen sein. Die Temperatur sollte nicht zu hoch sein: Dies wird schmelzen und verformen die Nadelspitzen. Nach der Ecken und Kanten geglättet sind, sorgfältig berühren Glühfaden mit der Nadelspitze und ziehen Sie dann vorsichtig den Faden von der Nadel zu einem spitzen Ende (Abb. 1B) zu generieren. Eine scharfe, glatte und saubere Nadel ist entscheidend für den Erhalt intakter Spender Blastomeren und nicht zu beschädigen den Host-Embryonen. 4. Bereiten Sie ein Embryo-Positionierung Sonde Ziehen Sie eine Glaspipette über einer Gasflamme, um ein gutes Glas-Sonde mit einer geglätteten Ende erhalten. Diese Sonde wird verwendet, um die Embryonen in der richtigen Orientierung vor der Transplantation zu positionieren. Tag 2. Blastomere Transplantation 1. Sammeln und dechorionate Embryonen Am nächsten Tag, entfernen Sie die Trennwände in der cross-Kassetten für Fische zu paaren können. Legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 Wasser gefüllt. Dann dechorionate Embryonen, die durch manuelle Abreißen der Chorion aus den Embryonen mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie eine Glaspipette mit gebogenem Schaft sorgfältig übertragen dechorionated Embryonen in Agarose Brunnen. Vermeiden Sie jeden Kontakt des Embryos mit der Luft, Ursache, welche die Embryonen zu platzen. Lassen Sie die Embryonen bei 28,5 ° C zu entwickeln in der Agarose Brunnen bis 3 Stunden nach der Befruchtung, oder hpf. 2. Einrichten einer Transplantation Apparat Während die Embryonen entwickeln, die Einrichtung eines Transplantation Gerät durch den Anschluss der Transplantation Nadel auf die Mineralöl gefüllten Mikro-Pumpen-System. Stellen Sie sicher, dass das System nicht auslaufen und keine Luftblasen im System gefangen. Zurück füllen den gesamten Transplantation Nadel mit Mineralöl, mit Ausnahme der 0,5 bis 1 pl Platz an der Spitze öffnen. 3. Die Transplantation von Blastomeren Um Transplantation Blastomeren, verwenden Sie ein Glas Positionierung Sonde in die Blastomeren Seite des 3-4-hpf Embryonen nach oben zu orientieren. Dann schieben Sie die Nadel in die Transplantation eines Spenders Embryo und langsam aufsaugen 5-20 Blastomeren in die Nadel. Legen Sie die Blastomeren gefüllte Nadel in eine Host-Embryo und lassen Sie die Blastomeren langsam. Der Ort, an dem die Blastomeren freigesetzt werden, beeinflussen, wo ihre Nachkommen in späteren Entwicklungsstadien zu lokalisieren. Um Netzhaut und der Entwicklung des Gehirns, Release-Zellen am animalen Pole zu analysieren. Während der Transplantation, stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze nicht in Kontakt mit Luft. Zur Minimierung von mechanischen Schäden tragen die Aufnahmestaaten Embryonen in die Agarose Brunnen bei 28,5 ° C bis zum nächsten Tag verlassen. Dann, transfer das Mosaik Embryonen bis 24-Well-Platten vorbeschichtet mit 0,5 ml 1% Agarose mit einem Embryo in jede Vertiefung. 1 ml der E3 Ei Wasser in jede Vertiefung gegeben. Um zu verhindern, bakterielle Infektionen, fügen Sie 10 ul 100X Penicillin und Streptomycin auf die E3 Ei Wasser. Tag 3. Embedding und Live-Darstellung von Mosaik Embryonen 1. Embedding Embryonen Bereiten Sie 1,5% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (LMP) in E3 Ei Wasser und halten Sie die Lösung in einem 30 ° C Wasserbad. Transfer-Mosaik Embryo zu einem FluoroDish Gewebe Kulturschale mit einem Glasboden der 0,17 mm in der Dicke (World Precision Instruments). Entfernen Sie überschüssiges Wasser E3 auf den Embryo nur durch eine minimale Menge an E3 bedeckt verlassen. Add 30-50 ul geschmolzen 1,5% LMP auf den Embryo. Schnell Position des Auges oder des Gehirns zu den Glasboden nah wie möglich vor dem Agarose-Lösung erstarrt. Nachdem die Lösung abgekühlt ist, fügen Sie zusätzliche Agarose-Lösung zur weiteren Sicherung der Embryonen statt. Dann tauchen die erstarrte Agarose-Block mit 2-3 ml E3 Ei Wasser. 2. Konfokale Bildgebung Für die konfokale Mikroskopie, ist eine Wasser-Immersions-invertierten Ziel (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japan) mit großer Tiefenschärfe verwendet. Ein Tropfen Wasser auf die objektive hinzugefügt und dann einen FluoroDish Gewebekulturschale auf das Ziel. Um Bild-Entwicklung, Durchführung Zeitraffer-Bildgebung durch Fotografieren der Embryonen alle 5 Minuten. Je nach Art von Experimenten sollte die Zeitintervalle zwischen den Aufnahmen eingestellt werden. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt eine repräsentative 24-hpf Mosaik Zebrafisch. GFP-Expression Highlights der Spenderzellen in grün. Die Netzhaut Neuroepithelzellen deckt dabei die gesamte Dicke der Netzhaut Wand. Der Film zeigt die Bewegungen der Spenderzellen in den Host Gehirn bei 24 hpf. Unsere Zellen Morphologien Laufe der Zeit ändern. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Shapes der Transplantation Nadelspitzen. A. Die abgeschrägte Öffnung der Spitze einer Nadel war frei von Schmutz nach Flusssäure wäscht. B. Ein spitzes Ende war an der Nadelspitze erzeugt. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Visualisierung von GFP-exprimierenden Spenderzellen in einem chimären Zebrafischembryonen bei 24 hpf. Die linke Tafel zeigt die GFP-Signale im Gehirn und Netzhaut. Das mittlere Feld ist ein helles Feld Bild des Embryos. Das rechte Bild zeigt das zusammengefügte Bild. Movie 1. Live Darstellung von GFP positive Spenderzellen zeigten die umfangreichen Änderungen in der Morphologie des Gehirns Neuroepithelzellen während der Entwicklung. Die Einzelbilder des Films wurden alle 5 Minuten zwischen 24 und 25 hpf gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Klicken Sie hier um den Film zu sehen</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Blastomere Transplantation der Retina und die Entwicklung des Gehirns beim Zebrafisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Geweben und Organen durch einfaches Loslassen der Spender Blastomeren zu entsprechenden Stellen in den Host-Embryonen zu analysieren. Die Markierung mit GFP-Moleküle führt zu einem saubereren Hintergrund als Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Dextran (Ho und Kane 1990). Dies liegt daran, ...

E3 Ei Wasser: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mm CaCl 2 </li><li> 0,33 mm MgSO 4 </li><li> 0,1% Methylenblau </li></ul>

die transplantation von gfp-exprimierenden blastomeren für live imaging von retinal und entwicklung des gehirns in chimäre zebrafischembryonen

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells ändern ausgiebig in ihren Standorten und Immobilien während der Embryogenese. Diese Veränderungen werden durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und ihrer Umgebung reguliert wird. Chimäre Embryonen, die aus Zellen verschiedener genetischer Hintergrund bestehen, sind großartige Werkzeuge, um die Zell-Zell-Interaktionen von Genen von Interesse vermittelt zu studieren. Die embryonale Transparenz der Zebrafisch am frühen Entwicklungsstadien ermöglicht die direkte Visualisierung der Morphogenese von Geweben und Organen auf der zellulären Ebene. Hier zeigen wir, ein Protokoll zu chimären Netzhaut und Gehirn in Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen und zu leben Bildgebung des Spenders Zellen durchzuführen. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung auf die Transplantation Nadeln, die Transplantation von GFP-exprimierenden Spender Blastomeren zu GFP-negative Hosts und die Prüfung der Spender das Verhalten der Zelle unter Live-konfokale Mikroskopie. Mit leichten Modifikationen kann dieses Protokoll auch verwendet, um die embryonale Entwicklung von anderen Geweben und Organen im Zebrafisch zu untersuchen. Die Vorteile der Verwendung von GFP zu markieren Spenderzellen werden ebenfalls diskutiert.

Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Zellen verändern während der Embryogenese ihre Position und ihre Eigenschaften in erheblichem Maße. Diese Veränderungen werden durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und ihrer ...

Blästozysten sind die embryonalen Zellen, die während des Furchungsstadiums der Entwicklung entstehen. Hier werden mit GFP markierte Blästozysten mithilfe einer Transplantationsnadel von einem Zebrafischembryo in einen anderen übertragen. Diese Methode ermöglicht es, das Verhalten und die Entwicklung von Zellen mit verändertem genetischem Hintergrund in einem ansonsten normalen Embryo zu verfolgen – oder umgekehrt – durch lebende mikroskopische Bildgebung.Hallo, ich bin Dr. Zoran vom Labor von Dr. Shawe an der Abteilung für Augenheilkunde der Universität Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Brust-Mial-Transportierung bei Zebrafisch-Embryonen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Entwicklung der Netzhaut und des Gehirns zu untersuchen.Beginnen wir also. Richten Sie am Abend Paarungen von Zebrafischen ein, um eine zufällige Fortpflanzung zu verhindern. Verwenden Sie vor dem gewünschten Zeitpunkt Trennwände, um die weiblichen und männlichen Fische voneinander zu trennen. Hier.Transgene Fische, die GFP exprimieren, werden als Quelle für donore Blastomere verwendet. Die transgene Linie PT 1 0 4 exprimiert GFP ubiquitär unter der Kontrolle des EF one-Pr

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Hier stellen wir ein Protokoll zur Transplantation von Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in Zebrafischembryonen und -larven in jedem Stadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung vor.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Erfahren Sie die Transplantation von GFP-markierten Blastomeren in Zebrafischembryonen für Live-Imaging. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Netzhaut- und Gehirnentwicklung in vivo.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Weitere Videos entdecken