Proboscis Erweiterung Response (PER) Assay in Drosophila

Hallo. In dieser Präsentation möchten wir Ihnen zeigen, wie man den Proboscis-Verlängerungsreaktions-Test (PER) in der Speiseröhre durchführt. Die Proboscis-Verlängerungsreaktion, auch PER genannt, ist ein Verhaltensassay zur Geschmacksprüfung, der sowohl bei Fliegen als auch bei Honigbienen angewendet wurde. Wenn die Proboscis mit einer attraktiven Substanz in Kontakt kommt, streckt die Fliege ihre Proboscis aus, um die Substanz aufzunehmen.

Lösungen verschiedener Zucker wie Saccharose, Glukose und Fructose sind für die Fliege sehr attraktiv. PR kann auch durch Berührung am Bein ausgelöst werden, aber in dieser Darstellung möchten wir uns auf den Kontakt mit dem Rüssel konzentrieren. Der erste Schritt für den PR-Test besteht daher darin, die Fliege zu entbehren.

Die Optimierung der Hungerbedingung ist einer der wichtigsten Faktoren für diesen Assay. Dabei sind zwei wesentliche Aspekte von Bedeutung: die Dauer der Nahrungsentzug und die Körperlänge der Fliege vor dem Nahrungsentzug.

Und es scheint eine positive Korrelation zwischen diesen beiden Faktoren zu geben. Und wenn die Fliege groß und fett ist, muss man sie stärker hungern. Die Körperlänge hängt nun von der Ernährung des Fliegenfutters und der Dichte der Fliegen im Gefäß ab.

Lassen Sie mich Ihnen ein gutes Beispiel zeigen. Wie Sie in diesem Reagenzglas sehen können, sind die Fliegen nicht überbesiedelt. Es befinden sich etwa, mal sehen, etwa hundert bis 150 PPE im Reagenzglas.

Sobald die Fliege hier eingeschlossen ist, sollten sie für weitere drei bis fünf Tage in einem frischen Nahrungsmittel gehalten werden, bevor sie in ein leeres Gefäß überführt werden, das ein Stück Papier enthält. Dieses wird ständig feucht gehalten, und die Verhungernszeit kann zwischen 24 und 96 Stunden variieren. Wir werden später noch näher auf die Verhungernszeit eingehen.

So fixieren Sie eine Fliege für die PER. Zunächst nehmen Sie eine Fliege und einen Aspirator. Dann platzieren Sie eine 200-Mikroliter-Gelbspitze über der Öffnung.

Jetzt gleichzeitig umdrehen und darauf blasen. Sie können die Fliege sanft in die gelbe Spitze hineinquetschen und etwas Luft zuführen, um die Fliege an einen Punkt zu bringen, an dem sie sich nicht mehr bewegen kann. Mit einem Rasiermesser eine Markierung etwa auf Höhe der Fliege setzen, dann die Fliege wieder aufsaugen und die Spitze abschneiden. Nun vorsichtig zurückblasen, um die Fliege wieder in Position zu bringen.

Bevor Sie jedoch das Ende ganz erreichen, führen Sie einen SL-Schnitt an der Stelle durch, an der sich der Rüssel befinden soll. Man kann auf den SL-Schnitt verzichten, doch er erleichtert definitiv den folgenden Arbeitsgang. Schneiden Sie nun die gelbe Spitze unterhalb der Fliege ab, füllen Sie das untere Ende mit Ton aus und stellen Sie es aufrecht hin.

Sie können die endgültige Anpassung vornehmen, indem Sie weitere Tonmasse an die Spitze anbringen. Wichtig ist, den Köder nicht zu stark zu drücken. Lassen Sie mich hier kurz konzentrieren und ihn vielleicht noch etwas weiter nach oben schieben.

Der Kopf der Fliege befindet sich also etwas darüber. So sieht es unter dem Mikroskop aus, wenn Sie beginnen; dies ist eine Seitenansicht und eine Vorderansicht. Nun sind Sie bereit, pr zu testen.

Das WIC, das wir verwenden, um den Geschmack zu übermitteln, wird auf die folgende Weise hergestellt. Wir verwenden Kim-Tücher und führen diese durch einen Aktenvernichter, wodurch ein Streifen wie dieser entsteht. Die Breite des Streifens beträgt ungefähr sechs Millimeter, sechs Millimeter, etwa fünf bis sechs Millimeter.

Was Sie nun tun müssen, ist, diesen Streifen zu drehen, um einen Faden zu erzeugen, und ihn fest zu verdrehen. Ich drehe ihn gerade, und nun haben wir einen Faden, der folgendermaßen aussieht. Als Nächstes nehmen wir eine Pinzette, ziehen und lösen diese kleinen Büschel vom Faden ab.

Und so stellen wir Wake her. In diesem Videoclip möchten wir die korrekte Position zeigen, um Kontakt mit dem Pro Bois herzustellen. Wir verwenden einen Faden, der mit 4% Sucrose getränkt ist, und möchten den Unterschied in der Empfindlichkeit demonstrieren, indem wir verschiedene Regionen entlang der dorsoventralen Achse berühren.

Das Zentrum des Beins hier ist die empfindlichste Stelle. Daher sollten Sie stets versuchen, Kontakt mit dem Zentrum wie folgt herzustellen. Wenn Sie nun den obersten Punkt oder den dorsalen Bereich des Labrums berühren, reagiert die Fliege nicht.

Wir stellen also dort Kontakt her, aber Sie können sehen, dass die Fliege die ssis nicht ausstreckt. Dasselbe geschieht, wenn Sie den ventralen Teil des Labums berühren. Das ist etwas schwieriger, aber schauen wir, ob wir einen guten Kontakt zum untersten Teil des Levels herstellen können.

Wir werden vorsichtig, ganz vorsichtig vorgehen. Und mal sehen. Ich berühre noch einmal die Mitte, um sicherzustellen, dass die Fliege noch drin ist.

Interessiert am süßen Geschmack. Im Lum sollte man daher immer die Mitte berühren, diesen zentralen Bereich. Wenn man es vertikal im Assay betrachtet, zeigt die Mitte des Lums leicht abwärts in diese Richtung.

Wenn Sie sich der Bohne also rein horizontal nähern, also in diese Richtung, diese Richtung, wäre der nächstgelegene Punkt zwischen der empfindlichen und der nichtempfindlichen Region. Dann würde sie reagieren. Aber wenn sie nur geringfügig darüber liegt, wird sie nicht reagieren.

Also lassen Sie mich ein wenig untersuchen. Jetzt keine Reaktion in der ersten Reihe der Silla, zweite Reihe, dritte Reihe, ja. Sie müssen also mindestens unterhalb der dritten Reihe der Silla vordringen.

Jetzt führe ich eine ähnliche Abtastung von unten durch. Dies ist etwas schwieriger. Ich berühre die zweite Reihe von unten.

Jetzt werde ich dort nach oben gehen. Die dritte Reihe dort, vierte Reihe, nein, es reagiert nicht. Fünfte Reihe dort.

Sie sollten also mindestens die vierte bis fünfte Sula von unten berühren. Dies bedeutet, dass Sie tatsächlich ständig die Mitte berühren müssen, da andernfalls die Varianz Ihrer Daten stark zunehmen würde. Möglicherweise möchten Sie dies immer wieder üben.

Der entscheidende Faktor ist, den Kontakt leicht unterhalb des nächstgelegenen Punkts aus horizontaler Annäherung herzustellen, und zwar hier. Als Nächstes möchte ich Ihnen den Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen dem medialen und dem lateralen Bereich des Labums zeigen. Ich verändere die Position der Fliege, sodass sie in diesem Bild nach oben gerichtet ist.

Zuerst berühre ich die Mitte oder den medialen Teil des Labrum der Fliege, und Sie können sehen, dass die Fliege gut reagiert. Als Nächstes berühre ich den Sensor, der am äußersten lateralen Teil des Labrum sitzt, und Sie können sehen, dass die Fliege hier nicht reagiert. Nun werde ich von der Seite zur Mitte vorrücken und berühre gerade den äußersten Seitenrand.

Ich bewege mich nach und nach auf die Mitte zu. Und wie Sie sehen können, reagiert die Fliege, sobald sie die genaue Mitte erreicht. Lassen Sie mich das noch einmal von der Seite her und in Richtung der Mitte vorführen.

Daher ist es wichtig, das Zentrum der Ebene sowohl vertikal als auch horizontal zu berühren. In diesem Abschnitt möchte ich demonstrieren, wie man Kontakt mit dem Osis herstellt. Allgemein gesprochen sollte der Kontakt so sanft wie möglich erfolgen.

Ein guter Hinweis auf die Wirkung ist die resultierende Kopfbewegung der Fliege. Die ideale Berührung ist daher eine, bei der man überhaupt keine Rückwärtsbewegung des Kopfes sieht. Der andere wichtige Faktor ist die Form des Dochts.

Ich zeige einige Beispiele. Die Form des Dochts hier ist sehr gut. Er ist nicht sehr dick, nicht sehr dünn.

Wenn es zu dick ist, wird es schwierig, einen präzisen Kontakt herzustellen, und die Auswirkung neigt dazu, größer zu sein. Wenn es zu dünn ist, wissen Sie nicht, ob die Lösung korrekt bis zur Spitze geliefert wird, was schlimmer ist als eine dickere Schicht. Lassen Sie mich damit mehrmals das Labium berühren.

Und dort, dort, dort, und man sieht fast keine Kopfbewegung mehr durch den Kontakt dort. Manchmal erhält man einen Docht, der so aussieht. Der Spitzenbereich ist also eindeutig zu dünn.

Sie können nicht sicher sein, ob die Konzentration an der Spitze der gewünschten abgegebenen Menge entspricht. Was Sie daher tun können, ist, den gelben Spitzenbereich mehrmals derart zu falten, wie hier gezeigt. Auf diese Weise können Sie eine formschöne Struktur erzeugen, lassen Sie mich kurz Kontakt herstellen. Wie Sie sehen, treten kaum Kopfbewegungen auf.

Es gab dort eine leichte Hüftbewegung, aber ja, dies ist ein weiteres gutes Beispiel. Sie müssen die dickeren nicht immer wegwerfen, solange Sie einen präzisen, sanften Kontakt herstellen können. Auch diese können Sie weiterhin verwenden.

Die Kopfbewegung könnte etwas stärker sein als bei den dünnen, aber solange Sie einen ruhigen Handschlag haben, können Sie immer noch einen guten Kontakt wie diesen erzielen. Dies ist etwas, das Sie nicht verwenden sollten. Es treten zu viele Fasern heraus, und es ist schwierig, sie zusammenzubündeln.

Sie sollten diese wegwerfen und eine andere suchen. Diese ist ebenfalls nicht geeignet. Die Spitze ist zu dünn und zu kurz, um sie umzufalten und dadurch eine dickere zu erhalten.

Und die umliegenden Teile sind zu dick, um einen präzisen Kontakt herzustellen. Auch diese sollten Sie entsorgen. Das Problem bei diesem Exemplar ist, dass sich zu viel Flüssigkeit darauf befindet, wodurch ein genauer Kontakt schwer herzustellbar ist.

Es würde eine größere Menge Flüssigkeit auf dem Prop-Bois zurücklassen, was die folgende Prozedur stören könnte. Selbst wenn Sie einen sehr guten Docht hätten, wäre es nicht gut, wenn Sie keinen sanften Kontakt herstellen. Hier ist ein schlechtes Beispiel.

Sie können sehen, wie der Kopf der Fliege heftig bewegt wird. Ein starker Aufprall könnte die Fliege davon abhalten, auf eine Substanz zu reagieren, und die Fliege kann leicht das Interesse an nachfolgenden Geschmacksprüfungen verlieren. Als Nächstes möchte ich einige Tipps geben, wie man den Aufprall verringern kann.

Zuerst stoppen Sie den Docht knapp oberhalb der gelben Spitze, bevor er Kontakt aufnimmt. Auf diese Weise können Sie die Amplitude des Zitterns Ihrer Hand in diesem Moment beobachten. Indem Sie dies betrachten, können Sie den Abstand der endgültigen Annäherung visualisieren und den Docht so bewegen, dass der am weitesten reichende Punkt Ihres Handzitterns die Illa des Pergaments erreicht.

Und natürlich ist es besser, wenn Sie überhaupt keine Erschütterungen hätten. Doch diese Methode ermöglicht es Ihnen, damit zu arbeiten und die Gesamtauswirkung zu verringern. Eines, was uns auffällt, ist, dass selbst wenn Sie die Fliegen für die gleiche Zeitspanne starten, Sie eine Gruppe von Fliegen erhalten, die auf nichts ansprechen, aufgrund einer unzureichenden Verhungernszeit.

Oder andererseits könnten Sie eine Charge Fliegen finden, die alle tot sind. Daher ist es nicht sehr ratsam, Fliegen zu einem festgelegten Zeitpunkt nach Hungerentzug zu testen, unabhängig vom Zustand der Fliegen. Dies würde die Datenvariabilität derart erhöhen, dass der Effekt, den Sie untersuchen, in den Hintergrund treten könnte.

Um diese Situation zu verbessern, möchten wir Ihnen eine Reihe von Kontrollen vorstellen, mit denen Sie den Zustand der Fliege bewerten können. Der erste Schritt besteht darin, die PER einer positiven Kontrolle zu testen, die aus 4% Saccharose besteht. Diese Konzentration ist ausreichend hoch, um eine Reaktion hervorzurufen.

Bei den meisten Sternfliegen bedeutet es, falls die Fliege nicht auf diese positive Kontrolle reagiert, entweder, dass die Fliege mehr Hungerzeit benötigt oder dass sie aus verschiedenen anderen Gründen wie Verletzungen inaktiv ist. Daher müssen Sie diese Fliegen verwerfen. Wenn sie jedoch reagiert haben, versuchen Sie eine negative Kontrolle mit Wasser.

Wenn die Fliege auf Wasser reagiert hat, bedeutet dies, dass sie durstig ist, oder dass sie einfach auf alles reagiert, oder dass sie darauf konditioniert ist, alles zu fressen, was sich nähert. Dies liegt an der attraktiven Substanz, die wir hier als positiven Kontrollwert verabreicht haben. Und die Fliege hat gelernt, dass ein sich näherndes Objekt wahrscheinlich süß ist.

Wir versuchen also ein Geschmacksverhalten und nicht ein Lernverhalten zu messen. Dabei soll verhindert werden, dass ein vorheriger Versuch aufgrund von Lernen den folgenden Versuch beeinflusst. Es scheint, dass die Wahrscheinlichkeit einer Reaktion auf einen negativen Reiz steigt, wenn eine höhere Konzentration als positiver Kontrollreiz verwendet wird.

Nun können Sie die Fliege mit der gewünschten Substanz oder unter den gewünschten Bedingungen auf die PER testen. Nach dem Test sollten Sie jedoch erneut den positiven und negativen Kontrollversuch durchführen. Wenn die Fliege hier nicht auf den positiven Reiz reagiert, bedeutet dies, dass sie während des Tests das Interesse an Stimuli verloren hat, und Sie könnten nicht beurteilen, ob die fehlende Reaktion im Test auf ein allgemeines Desinteresse der Fliege zurückzuführen ist. Als Nächstes: Reagiert die Fliege auf die negative Kontrolle, bedeutet dies, dass die Fliege durstig geworden ist oder sich an ein sich näherndes Objekt gewöhnt hat. Reagiert die Fliege jedoch nicht auf die negative Kontrolle, haben Sie abschließend Daten, die Sie auswerten können.

Dieses Zeitfenster dauert normalerweise etwa fünf bis 10, 15 Minuten. In einigen Fällen habe ich beobachtet, dass es bis zu 30 Minuten andauern kann. Nach einer Weile wurde uns klar, dass dies eine grafische Darstellung des Zusammenhangs zwischen Sternezeit und Mortalität ist.

Das hier ist die Zeit, und das ist der Prozentsatz der lebenden Fliegen in einem Gefäß. Natürlich beginnen sie irgendwann zu sterben, und das geschieht sehr unterschiedlich. Eine Beobachtung, die ich gemacht habe, ist, dass bis zu einem bestimmten Zeitpunkt keine Fliegen auf die positive Kontrolle reagieren, aber plötzlich beginnt man, eine Fliege zu sehen, die zu reagieren beginnt.

Und natürlich, wenn die Zeit fortschreitet, können Sie weiterhin damit arbeiten. Doch ab einem bestimmten Punkt stellten wir fest, dass immer mehr Fliegen auf die Negativkontrolle reagieren. Dies ist daher der Zeitraum, den Sie erfassen sollten, um ERs durchzuführen.

Die Frage ist also, wann dies eintreten wird. Nach meiner Erfahrung geschieht dies unter sehr guten Bedingungen normalerweise etwa zwischen 36 und möglicherweise 48 Stunden, manchmal kann es jedoch bis zu 72 Stunden dauern, und dies schwankt tatsächlich sehr stark. Daher ist es wichtig, mehrere Gefäße vorzubereiten, um dieses kurze Zeitfenster sicher abzudecken.

Auch bei erneuter Anwendung mit denselben Hungerphasen, demselben Futter und sonst gleichen Bedingungen variiert dies erneut stark. Selbst bei identischer Genetik und einem sehr ähnlichen genetischen Hintergrund variiert dieser Faktor also erheblich. Darauf sollten Sie daher besonders achten.

Wir haben über die Fliegen gesprochen, die auf die Reize konditioniert wurden und nun auf alles reagieren. Eine Möglichkeit, dies zu verhindern, besteht darin, nicht wiederholt einen attraktiven Geschmack zu verabreichen, sondern dazwischen negative Kontrollen einzufügen. Lassen Sie mich zeigen, wie das funktioniert.

Dies ist also eine positive Kontrolle. Das ist 4% Saccharose, wir haben sie hier zweimal verabreicht. Wenn wir dies beibehalten und dem Subjekt immer wieder eine süße Substanz verabreichen, würde es sich schließlich einstellen.

Jetzt fügen wir stattdessen eine negative Kontrolle hinzu. Wie Sie sehen, reagiert es nicht auf die negative Kontrolle. Lassen Sie mich das noch einmal durchführen.

Erste positive Kontrolle, 4 % mit 4 % Saccharose. Lassen Sie mich das etwas abwandeln. Wiederum eine sehr starke, sehr schnelle Ruheantwort.

Und nun kehren wir erneut zur Negativkontrolle zurück. Mal sehen, das ist nicht gut, lassen Sie mich das umdrehen. Okay, hier.

Dies ist also Wasser als Negativkontrolle. Wie Sie sehen, zeigt es keine Reaktion auf die Negativkontrolle. Nun zeige ich Ihnen ein schlechtes Beispiel.

Wir geben also 8% Saccharose, was höher ist als die positive Kontrolle, die wir verwenden. Die Fliege mag es daher wirklich und versucht, danach zu suchen. Lassen Sie mich, lassen Sie uns noch einmal versuchen. Schauen wir uns einen sanften Kontakt dort an.

Und es sucht sehr aktiv. Es bleibt weiterhin in seiner vorgestreckten Position. Warten wir also etwas ab und stellen erneut einen Kontakt her.

Ach, da. Es sucht also, ja, immer noch danach. Immer noch auf der Suche.

Stellen Sie sicher, ja, es ist immer noch in Ordnung. Und vielleicht noch einmal, noch einmal, ein weiteres Mal. Oh, da, ja, es ist eine sehr starke Reaktion.

Statt des 8%igen Saccharoses verwenden wir nun eine negative Kontrolle. Bringen wir also hier diesen Docht an. Dieser ist etwas zu dünn.

Falten Sie dies also und geben Sie es weiter, um eine schöne Treppe zu bilden. Doch dies ist Wasser. Wie Sie hier sehen können, reagiert die Fliege auf Wasser.

Jetzt haben wir in diesem Beispiel eine sehr attraktive Substanz fünfmal verabreicht. Das bedeutet nun nicht, dass zweimal in Ordnung wäre, aber fünfmal schlecht. Es gibt zahlreiche Fälle, in denen die Fliege bereits durch eine einzige Applikation von 4 % 1-Octen-3-ol oder sogar einer niedrigeren Konzentration konditioniert wird.

Und die wichtige Botschaft ist, die Anzahl wiederholter Applikationen einer attraktiven Substanz zu reduzieren. Und wenn Sie eine Reihe von Konzentrationen eines schmackhaften Stoffes haben, ist es sicherer, mit der niedrigeren Konzentration zu beginnen und schrittweise zu einer höheren überzugehen, den Reiz so schnell wie möglich wieder zurückzuziehen, sodass die Fliege davon möglichst wenig aufnehmen kann, was ebenfalls die Konditionierung der Fliege verringern würde. Hallo, in dieser Präsentation haben wir alle Schritte für den Proboscis Extension Response-Assay durchgesprochen.

Die Methode selbst klingt ziemlich einfach, aber genau wie viele andere Verhaltensassays gibt es kleine Dinge, die verhindern können, dass dieser Assay funktioniert. Und wir haben bereits viele dieser Schritte durchlaufen, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Hier möchte ich einige der wichtigsten Faktoren nochmals hervorheben.

Und das Erste ist die Form des Dochts. Ich habe einige Bilder mit sehr guten Beispielen gezeigt, aber in der Realität wird alles in diesem kontinuierlichen Spektrum von sehr gut bis sehr schlecht liegen. Zu Beginn verwenden Sie möglicherweise etwas aus dem Bereich „sehr gut“, aber von Tag zu Tag könnte es sich allmählich verschlechtern.

Die Sache, die Wochen, die Sie möglicherweise verwenden, könnten in den weniger guten Bereich abdriften. Und die menschliche Wahrnehmung dessen, was als gut bezeichnet wird, kann sich sehr leicht verändern, ohne dass man es bemerkt. Eine Möglichkeit, dies zu verhindern, besteht darin, ein gutes Bild einer WIC aufzunehmen, die sehr gut funktioniert, und dieses Bild kurz vor dem Testen von P zu betrachten. Der zweite wichtige Faktor ist der Einfluss.

Und dies ist leichter zu handhaben, weil der beste Kontakt, der Aufprall, der beste Kontakt ein solcher wäre, bei dem man keine Bewegung des Kopfes sieht. Wenn Sie ihn also so sanft wie möglich gestalten können und wenn Sie nicht sehen, dass sich der Kopf der Fliege in irgendeiner Weise verschiebt, wäre das am besten. Die Hungerbedingung, der dritte Punkt, die Hungerbedingung ist der schwierigste Faktor, der kontrolliert werden muss.

Und bei vielen Verhaltensanalysen zum Geschmackssinn oder zum Geruchssinn wird häufig eine Hungernzeit von 24 Stunden verwendet, was für uns Menschen oft sehr praktisch ist, um das Experiment durchzuführen. Wenn man die Fliegen jedoch unter sehr guten Bedingungen aufzieht, ist diese Zeitspanne von 24 Stunden eher kurz. Doch selbst wenn man ein sehr nährstoffreiches Futter für die Fliegen verwendet und die Fliegendichte genau kontrolliert, kann dieses experimentelle Zeitfenster etwa zwischen 36 und 72 Stunden variieren. Jetzt.

Als Experiment muss ich sagen, dass es für einen Menschen oder für Menschen äußerst unpraktisch ist, dieses Experiment durchzuführen, und es gibt einen weiteren Faktor, der es für die Versuchspersonen noch schwieriger macht. Tatsächlich gäbe es viele Chargen, bei denen das experimentelle Zeitfenster sehr kurz sein könnte oder sogar ganz fehlen könnte. Es gibt also einige wesentliche Hürden, die man überwinden muss.

Aber das Wichtigste sind die positiven und negativen Kontrollen. Wenn Sie diese Standards streng einhalten, können Sie zuverlässige Datensätze erhalten.