Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel des A-CT-Assays ist es, zu testen, ob ein oder mehrere Gene von Interesse die primitive Haut für ein bestimmtes Zellschicksal spezifizieren können. Das Verfahren beginnt mit der Überexpression der RNAs bei der Kodierung des fluoreszierenden Reportergens und des Gens oder der Gene, die für die Entwicklung von XUS-Lavis-Embryonen von Interesse sind. Der nächste Schritt besteht darin, die tierische Kappe oder das primitive Odum, das die überexprimierten RNAs exprimiert, zu zerlegen und sie bis zum Stadium 15 zu züchten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Gewebe an der Flanke eines Wirtsembryos im Stadium 15 zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die Hälfte des Spendergewebes auf die Flanke des Wirtsembryos zu transplantieren und den Wirt auf die Stadien 42 bis 43 zu züchten. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von ektopischem Gewebe, wie z.B. augenähnliche Strukturen, durch Schnitte und Immunfärbung für gewebespezifische Marker.

Hallo, ich bin und bin in der Abteilung für Augenheilkunde an der Upstate Medical University. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren, das wir den Animal Cap Transplant Assay nennen, den ich in Zusammenarbeit mit Mike Suber entwickelt habe. Wir verwenden diesen Assay in unseren beiden Laboren, um die Gene zu untersuchen, die für die Augenbildung ausreichend sind.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Cap-RNAs für die Injektion vor, transkribieren Sie Noggin oder ein anderes Gen von Interesse und YFP, um es als Tracer zu verwenden. Bereiten Sie auch die MMR-basierten Lösungen, einen Vorrat von acht x Eiablagelösung und die Nadeln für die Injektion der Embryonen vor.

Eine speziell angefertigte Elastomerform wird für die Herstellung von Schalen zur Embryonenhaltung verwendet. Erzeugen Sie eine Injektionsplatte pro Versuchsbedingung, indem Sie 1 %AROS in 0,4 XMMR in einer Mikrowelle schmelzen. Übertragen Sie etwa sechs Milliliter der Lösung in eine 60-Millimeter-Platte.

Legen Sie vorsichtig eine Elastomerform auf die Lösung, um Blasen zu vermeiden, und lassen Sie sie etwa 20 Minuten abkühlen. Erzeugen Sie bei Raumtemperatur eine Kappenisolationsplatte pro Versuchsbedingung unter Verwendung von 1 %AGROS plus 0,7 XMMR mit Formen, wie gerade für die Injektionsplatten gezeigt. Bereiten Sie für jeden Zeitpunkt zusätzliche Platten vor.

Konsultieren Sie das beigefügte schriftliche Protokoll für Einzelheiten zur Berechnung der Zeitpunkte. Als nächstes isolieren. Testen Sie diese an einem männlichen Frosch und lagern Sie das Gewebe bei vier Grad Celsius in einer sterilen Lösung aus einem XMMR, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin.

Dies kann bis zu einer Woche vor Beginn des Experiments erfolgen, aber beachten Sie, dass das Sperma mit der Zeit an Wirksamkeit verliert, spät am Tag vor der Mikroinjektion. Injizieren Sie Frauen 500 Einheiten humanes Choriongonadotropin. Setze die Weibchen über Nacht bei 16 bis 18 Grad Celsius aus.

Jetzt ist alles bereit für die Mikroinjektion am nächsten Tag. Beginnen Sie damit, die hormonell induzierten Weibchen zu entfernen und sie in einzelne Becken zu setzen, die einen XELS enthalten. Bereiten Sie die Nadel für die Mikroinjektion vor, indem Sie die Spitze abschneiden.

Um einen Durchmesser von 25 bis 35 Mikrometern zu erhalten, setzen Sie die Nadel auf den Pico-Injektor PLI 100 und kalibrieren Sie ihn so, dass er 10 Nanoliter pro Injektion abgibt. Stellen Sie einen Inkubator auf 14 Grad Celsius ein, indem Sie den Ausgang nach der Injektion von RNA auf diese niedrigere Temperatur bringen, die Entwicklung des Embryos wird verlangsamt und viele weitere Transplantationen können in einem Experiment etwa eine Stunde vor der Befruchtung durchgeführt werden, nehmen Sie die Eizellen aus dem Tank. Sobald die Weibchen eine weitere Stunde lang Eier gelegt haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um die neu gelegten Eier aus dem Tank zu nehmen.

Beachten Sie, dass Sie keine Eier verwenden, die sich länger als zwei Stunden in der ELS-Lösung befunden haben. Da die Qualität der Eier nachlässt, legen Sie die Eier in 60 Millimeter große Petroschalen. Das Gericht besteht zu etwa 80 % aus einer einzigen Schicht Eier.

Entfernen Sie so viel ELS wie möglich aus den Eiern und ersetzen Sie sie durch ein XMMR. Die Eier können bis zu einer Stunde in einem XMMR bleiben. Anschließend werden die Eizellen mit homogenisierten Hoden in vitro befruchtet.

Es ist am besten, die Embryonen in drei getrennten Chargen gegen 11:00 Uhr mittags und 13:00 Uhr zu befruchten, damit sie in das gewünschte Stadium heranwachsen können: 8,5 bis neun für die Kappenisolierung und Stadium 15 für die Transplantation. Eine Stunde nach der Befruchtung der Eier entfernen Sie den Geleemantel auf den Eiern mit D Jelly Solution Wash mit reichlich 0,1 XMMR und warten Sie dann, bis die befruchteten Eier das Zweizellstadium erreicht haben.

Um mit dem Sortieren zu beginnen. Bereiten Sie eine Injektionsschale vor, die mit 0,4 XMMR plus 6%F Ccal gefüllt ist. Sobald die Embryonen das zweizellige Stadium erreicht haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um gleichmäßig pigmentierte und gleichmäßig verteilte Embryonen in die Vertiefung der Injektionsschale zu sortieren.

Fahren Sie mit der Mikroinjektion fort: Dehnen Sie zuerst Perfil über die Oberseite eines 60 Millimeter dicken Deckels der Petroschüssel. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der RNA-Probe auf den Biofilm und aspirieren Sie. Verwenden des Pico-Injektors zum Befüllen der Injektionsnadel.

Vergewissern Sie sich, dass die Nadel noch 10 Liter Probe abgibt, bevor Sie mit der Injektion beginnen. Die RNA wird über zwei Zellstadien des Embryos in beide Blaster injiziert. Injizieren Sie 20 bis 30 Embryonen mit je 500 Pikogramm Y-F-P-R-N-A und geben Sie sie in eine Schale.

Injizieren Sie weitere 20 bis 30 Embryonen mit je 20 Pikogramm Nain, RNA vorgemischt mit Y-F-P-R-N-A und legen Sie sie in die Schale. Legen Sie zusätzlich 100 bis 200 nicht injizierte Embryonen pro Zeitpunkt in eine andere Injektionsschale, die die FICO-Lösung enthält. Bewegen Sie diese Embryonen gleichzeitig mit den injizierten Embryonen in den Inkubator hinein und wieder heraus.

Dies sind die Wirte, die für die Transplantation der Kappen nach der Injektion verwendet werden. Inkubieren Sie alle Embryonen über Nacht bei 14 Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle geplanten Zeitpunkte.

Nach der Inkubation über Nacht kann der Tierhut isoliert werden. Kommen Sie früh am Morgen, um die Embryonen zu inszenieren. Denken Sie daran, auch die nicht injizierten Wirtsembryonen aus dem Inkubator zu entfernen.

Der früheste Zeitpunkt sollte in Phase neun liegen. Entfernen Sie zunächst die Embryonen, die nicht überlebt haben. Fahren Sie mit der Isolierung der tierischen Kappen aus den lebensfähigen Embryonen fort und arbeiten Sie mit jedem Zeitpunkt in Chargen in einer Kappenisolationsschale.

Fügen Sie eine großzügige Menge 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung hinzu. Gießen Sie dann die Fol-Lösung aus jeder Platte, die die injizierten Embryonen enthält, ab und fügen Sie 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung hinzu. Entfernen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette aus der Injektionsschale und legen Sie sie in die frisch vorbereitete Kapselisolationsschale.

Verwenden Sie entweder den Gastro-Master mit einer gelben, auf 400 Mikrometer gebogenen Spitze oder eine scharfe Pinzette mit der Nummer fünf, um die Tierkappen in 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung zu isolieren. Bewahren Sie zwei oder drei intakte Embryonen für das Staging auf. Nachdem Sie die tierischen Kappen isoliert haben, legen Sie sie zusammen mit den Wirtsembryonen wieder in den 14 Grad Celsius heißen Inkubator, bis am nächsten Tag die Kappen auf die Flanke der Wirtsembryonen transplantiert werden.

Entnehmen Sie die Kappen und Wirtsembryonen ab dem ersten Zeitpunkt aus dem 14 Grad Celsius heißen Inkubator und sortieren Sie die Embryonen nach einheitlichen fluoreszierenden positiven Kappen. Zählen Sie die Anzahl der Kappen und entfernen Sie sie. Verdoppeln Sie die Anzahl der Wirtsembryonen auf eine frisch zubereitete Injektionsschale mit 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung mit einer scharfen Pinzette mit der Nummer fünf.

Entfernen Sie die Lene-Membran von jedem Wirtsembryo. Übertragen Sie sie auf die Platte mit den Kappen, aber seien Sie vorsichtig ohne ihre Lene-Membranen. Die Embryonen können sich an der Wasseroberfläche schnell dissoziieren, indem sie den Gastro-Master verwenden, der mit einer gelben Spitze und einem 200 bis 250 Mikrometer dicken, gebogenen Draht auf der höchsten Stufe ausgestattet ist, oder mit einer Pinzette mit der Nummer fünf.

Entfernen Sie ein 200 Mikrometer großes Quadrat an der Seite des Embryos im Stadium 14 bis 15. Dann wieder mit dem Gastromeister oder der Zange Nummer fünf. Schneiden Sie eine Kappe in zwei Hälften und legen Sie das Gewebe in das Loch im Wirtsembryo.

Drehen Sie den Embryo gegen die Vertiefung, um die Heilung zu ermöglichen. Mache dies für so viele Embryonen wie möglich, während sie sich im Stadium 15 befinden. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Zeitpunkte.

Der Embryo heilt in der Regel innerhalb von 30 Minuten. Und mit der Pinzette Nummer fünf entfernen Sie die abgestorbenen Zellen, die mit der sanften Bürstenbewegung weiß erscheinen. Züchten Sie die transplantierten Embryonen über Nacht bei 18 Grad Celsius.

Arbeiten Sie nach der Inkubation über Nacht unter dem Präparierfluoreszenzmikroskop, um Embryonen mit fluoreszenzmarkiertem transplantiertem Gewebe zu sortieren. Setzen Sie die ausgewählten Embryonen wieder bei 18 Grad Celsius ein, um bis zum Stadium 42 bis 43 zu wachsen. Wenn die Tiere das gewünschte Stadium erreicht haben, betäuben Sie sie in trica und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop und machen Sie Fotos.

Die transplantierten Embryonen können dann fixiert, geschnitten und immungefärbt werden, oder man kann eine In-situ-Hybridisierung mit Markern für ein Gewebe von Interesse durchführen. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer Wirtskaulquappe mit Spendergewebe, das einen Tag nach der Transplantation einen fluoreszierenden Tracer und einen Noggin exprimierte. Achte darauf, wie sich das Taschentuch an der Seite der Kaulquappe zusammenballt.

Die Wirtsembryonen, die kontrolliertes Spendergewebe erhalten, das nur den fluoreszierenden Tracer exprimiert, beginnen bereits, die tierischen Kappenzellen in ihre Flanke einzubauen. Einige Tage später bilden die Kaulquappen, die nain-exprimierende Spenderzellen erhalten, augenähnliche Strukturen auf ihrer Seite, während die Kaulquappen, die das Kontrollspendergewebe erhalten, fluoreszierende Zellen auf der Hautoberfläche haben. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Tierkappentransplantationstest in Zaps Lavis durchführen.

Bei der Durchführung dieses Assays. Es ist wichtig, daran zu denken, dass Sie vor dem Eingriff an diesem Tag alles bereit haben, damit sich die Embryonen nicht schneller entwickeln, als Sie an sie herankommen können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.