Name: Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie, wie der Animal Cap Transplant Assay in Xenopus laevis zur Untersuchung der Gewebedetermination durch Genüberexpression eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellfatespezifikation in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Forschung bis Blindness (Career Development Awards zu MEZ und ASV und einen nicht zweckgebundenen Zuschuss an das Department of Ophthalmology), die E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ und ASV) und der National Eye Institute / NIH (MEZ Prevent unterstützt gewährt R01EY015748 und R01EY017964).

Teil I. Set-up für die ACT-Test <ol><li> Generieren capped RNA für die Injektion, wie vom Hersteller empfohlen, mit ihren Phenol: Chloroform Reinigungsverfahren (z. B. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA kodierend für ein fluoreszierendes Protein wird als Tracer verwendet. Wir transkribieren entweder gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) oder mCherry 5 cDNA, die in einem pCS2 + Expressionsvektor ist. </li><li> Pull Borosilikatglas Kapillarröhrchen zu konischem Tipps mit einer Mikropipette puller bilden. Wir verwenden Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Machen sterilen Lösungen in Tabelle 1 aus einer 10 X Marcs Geändert Ringer (MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl; auf pH 7,5 eingestellt, autoklaviert und gelagert bei RT). </li><li> Isolieren Hoden von einem männlichen Frosch und speichern das Gewebe bei 4 ° C in einer sterilen Lösung von 1X MMR / Gentamicin (50 ug / mL Gentamicinsulfat; BioWhittaker, Kat. Nr. 17-518Z). Dies kann bis zu einer Woche vor dem Start des Experiments durchgeführt werden, aber es ist verliert seine Wirksamkeit im Laufe der Zeit. </li><li> Eiablage-Lösung (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma Basis, 2,62 mM NaHCO 3 und 2,75 mM MgSO 4, eingestellt auf pH 7,6) kann als ein 8X Lager getroffen werden, die kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Hinweis: Achten Sie auf Kontamination in dieser Lösung, da dies die Qualität der Eier beeinflussen. </li><li> Generieren Injektion Platten. Um dies zu tun, schmelzen 1% Agarose in 0,4 x MMR in einer Mikrowelle, add ~ 6 ml geschmolzener Agarose-Lösung in 60 mm Platten, sanft abrollen ein Elastomer Form (Abbildung 1) auf der Oberseite der Lösung, um Blasen zu verhindern, und lassen Sie für etwa kühlen 20 Minuten bei RT. Zur Bestimmung der Anzahl benötigt, sollten Sie die Anzahl der experimentellen Bedingungen (z. B. 1, YFP, 2, YFP + Noggin) und die Zahl der transplantierten Host Embryonen benötigt werden. Für unsere Experimente zu generieren wir mindestens 20 transplantierten Host Embryonen für jeden experimentellen Zustand. Bei 18-19 ° C, Embryonen im Stadium 15 für etwa eine Stunde sein. Wenn es eine Stunde dauert bis 20 Transplantationen durchführen, dann zwei Befruchtung Zeitpunkten benötigt werden, vorausgesetzt, der Host-Embryonen akzeptieren alle Transplantationen. Daher wird mittels vier Injektionen verabreichter Gerichte benötigt (2 exp Bedingungen x 2-Düngung Zeitpunkte = 4). Lagern Sie die Platten bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Generieren Kappe Isolation Platten mit 1% Agarose + 0,7 X MMR mit Formen wie bei der Injektion Platte. Machen Sie die gleiche Anzahl von Cap isoliert als Injektion Platten plus eine extra pro Befruchtung Zeitpunkt (4 + 2 Befruchtung Zeitpunkten = 6). </li><li> Inject Weibchen mit 500 Einheiten humanes Chorion-Gonadotropin spät in den Tag, an dem Tag vor der Mikroinjektion. Shop Frauen bei 16-18 ° C über Nacht. </li></ol> Part II. RNA Mikroinjektion von Xenopus laevis Embryonen A. Vorbereitung für die Mikroinjektion <ol><li> Entfernen Sie hormonell induzierten weiblichen und legen Sie sie in einzelnen Tanks mit 1X Eiablage Lösung (ELS). Hinweis: wir verwenden keine Eier, die in der ELS mehr als zwei Stunden wurden die Qualität der Eier wird reduziert. Deshalb etwa eine Stunde vor in-vitro-Fertilisation, verwerfen wir alle Eier aus dem Tank, so dass nur frisch gelegten Eier gesammelt werden. </li><li> Bereiten Sie die Nadel für die Mikroinjektion von Schnippeln von der Spitze zu einem 25-35 Mikrometer Durchmesser zu erhalten. Setzen Sie die Nadel auf die picoinjector und kalibrieren, so dass es 10 nL verzichtet pro Injektion. </li><li> Set einem Inkubator auf 14 ° C. </li><li> Sobald Weibchen Eier für etwa eine Stunde, entfernen Sie die Eier aus dem Tank mit einer Transferpipette und sie in 60 mm Petrischalen gelegt. Entfernen Sie so viel ELS aus den Eiern wie möglich und ersetzen mit 1X MMR. Die Eier können sofort befruchtet werden oder bleiben in 1X MMR für bis zu eine Stunde. Für die Transplantation Assay ist es am besten, zwei Gerichte, 80% voll aus einer einzigen Schicht von Eiern in bis zu drei getrennten Ansätzen gegen 11 Uhr, mittags und 01.00 Uhr zu befruchten. Nach der Injektion wird sie bei 14 ° C platziert werden, so dass sie auf die gewünschte Bühnen für cap Trennung (Stufe 8,5-9) und Transplantation wachsen (Stufe 15; siehe Teil I, Nr. 6 oben). </li><li> Zur Überprüfung der Qualität der Hoden führen wir einen frühen Morgen-Fertilisation (~ 08.00 Uhr), die uns Hoden von einem anderen männlichen extrahieren, wenn die Spermien aus dem ersten ist nicht lebensfähig ermöglicht. Hinweis: Wir homogenisieren ~ 0,25 Hoden in 1 ml 1X MMR und fügen etwa 5 bis 7 Tropfen pro Platte von Eizellen. </li><li> In-vitro-Befruchtung der Eier mit homogenisiert Hoden und eine Stunde später, entfernen Sie das Gelee Mantel auf die Eier mit de-Gelee-Lösung (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 bis 50 ml autoklaviert Nanopure Wasser). Warten Sie, bis sie zwei-Zell-Stadium zu sortieren, die etwa 2 Stunden dauert bei 18 beginnen ° C erreichen oder 1,5 Stunden bei Raumtemperatur (22 ° C). </li><li> Mit einem transfer Pipette Art gleichmäßig pigmentierte und gleichmäßig geteilt Embryonen, wie in der linken Tier Kappe in Abbildung 3 dargestellt, in den Brunnen einer Injektion Gericht mit 0.4x MMR + 6% Ficoll gefüllt. </li></ol> B. Mikroinjektion <ol><li> Stretch Parafilm über die Spitze eines 60 mm-Petrischale Deckel. Pipette 2 ul Ihre erste RNA-Probe auf den Parafilm und saugen mit den PLI-100, um Ihre Injektionsnadel zu füllen. Achten Sie darauf, um zu überprüfen, dass die Nadel immer noch Dosieren 10 nL der Probe vor dem Start Injektion. </li><li> Inject 20-30 Zwei-Zell-Embryonen (beide Blastomeren) mit 500 pg YFP RNA in eine Schüssel und Ihr Gen von Interesse (zB 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA in eine andere Schüssel sieben. </li><li> Legen 100-200 nicht-injizierten Embryonen pro Zeitpunkt in eine weitere Injektion Schale mit der Ficoll-Lösung. Bewegen Sie sie in und aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die injizierten Embryonen. Dies sind die Gastgeber in Teil IV verwendet werden. </li><li> Nach der Injektion inkubieren alle Embryonen bei 14 ° C über Nacht. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte. </li></ol> Teil III. Isolieren tierischer Kappen aus injizierten Embryonen <ol><li> Kommen Sie früh am Morgen, um die Embryonen der Bühne. Der früheste Zeitpunkt sollte in Stufe 9 sein. Entfernen Sie diejenigen, die nicht überlebt haben. Gehen Sie mit den folgenden Schritten die Arbeit mit jedem Zeitpunkt in den Reihen. </li><li> Abgießen Ficoll-Lösung von jeder Platte und wieder hinzuzufügen 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Um eine Kappe Isolation Schüssel, fügen Sie eine großzügige Menge 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Verdrängen Embryonen aus der Injektion Gericht Brunnen mit einer Transferpipette und in den frisch präparierten Kappe Isolation Gericht. </li><li> Isolieren tierischer Kappen in 0.7X MMR + Gentamicin-Lösung, halten 2 oder 3 intakte Embryonen für die Inszenierung. Entweder die Gastromaster, mit einer gelben Spitze gebogen, um 400 um, oder ein Paar scharfe Nummer 5 Zangen ausgerüstet verwendet werden kann. </li><li> Put Kappen zurück in 14 ° C Inkubator bis zum nächsten Tag. Der Host-Embryonen aus dem Inkubator zur gleichen Zeit wie die Kappen, sie auf der gleichen Entwicklungsstufe wie das Spendergewebe halten entfernt werden. </li></ol> Teil IV. Die Transplantation von Kappen auf Flanke <ol><li> Entfernen Sie die Schutzkappen und Embryonen aus dem ersten Zeitpunkt aus dem 14 ° C Inkubator und Bühne der Embryonen. Sortieren für eine einheitliche gelbe oder rote Fluoreszenz-positive Mützen, abhängig von der Tracer (Abbildung 2). </li><li> Zählt die Anzahl der Kappen und entfernen Sie doppelte Anzahl der Bühne 12-13 Embryonen ein frisch zubereitetes Injektion Gericht mit 0.7X MMR / Gentamicin-Lösung. Mit scharfen Nr. 5 Pinzette entfernen die Dotterhaut von jedem. Übertragen auf die Platte mit dem Deckel, aber seien Sie vorsichtig. Ohne ihre vitelline Membranen können Embryonen schnell an der Oberfläche des Wassers zu distanzieren. </li><li> Mit dem gastromaster (gelber Spitze, 200-250μm gebogenen Draht, höchste Einstellung) oder Nr. 5 Zange, entfernen Sie einen 200 um Platz auf der Seite des Embryos im Stadium 14-15 (Abbildung 3). Dann schneiden Sie ein Cap in die Hälfte (mit dem gastromaster oder Nr. 5 Pinzette) und platzieren Sie das Gewebe in das Loch in der Host-Embryo gemacht. Drehen Sie den Embryo gegen die gut zur Heilung zu ermöglichen. Tun Sie dies für so viele Embryonen, wie Sie können, während sie bei Stufe 15 sind. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte. </li><li> Der Embryo wird in der Regel innerhalb von 30 Minuten zu heilen. Entfernen Sie die toten Zellen (weiß) mit einem sanften Bürsten Bewegung mit einem # 5 Pinzette. Wachsen sie bei 18 ° C über Nacht. </li><li> Unter dem Sezieren Fluoreszenzmikroskop, sortieren Embryonen mit fluoreszenzmarkierten, transplantierte Gewebe. Setzen Sie sie wieder bei 18 ° C bis Stufe 42-43 wachsen. </li><li> Anesthetize die Tiere in Tricaine. An dieser Stelle können Sie Bilder unter einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop nehmen. Nachdem Sie fertig sind, zu beheben, Abschnitt und immunostain oder in situ-Hybridisierung mit Markern für Ihre Gewebe von Interesse durchzuführen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Design aus Plexiglas für das Gießen der Elastomer-Form zur Herstellung Embryo hält Speisen verwendet. Ein 38 x 38 mm mit abgerundeten Ecken square (~ 5 mm tief) wurde aus einem Stück Plexiglas, das 50 x 50 mm ² und 25 mm dick ist geleitet. Circular, gleichmäßig verteilte Bohrungen (1,5 mm Durchmesser) wurden 1 mm tief in den Kunststoff gebohrt. Um das Elastomer Form für die Mikroinjektion Gerichte, gossen wir Sylgard Elastomer in den Plexiglas und erlaubt es sich zu verfestigen, wie pro Anweisungen des Herstellers. Dieses Elastomer Form wird verwendet, um Einspritzung und Kappe Isolation Platten zu machen. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Tierische Kappe Sortierung vor der Transplantation ist es wichtig, als Ausdruck variieren kann. Tierische Kappe auf der linken Seite drückt mCherry gleichmäßig über das Gewebe, das Explantat auf der rechten Seite hat spotty Ausdruck und werden verworfen. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Eine Vielzahl TADPole hat ein Auge-Struktur auf ihrer Flanke von transplantierten Tieren cap-Zellen entwickelt. Ein fluoreszierendes Bild auf dem Hellfeld Bild wurde überlagert.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

In diesem Video haben wir unsere Version des klassischen Techniken, die von Xenopus Biologen, die wir neu geordnet, um das Tier Kappe Transplantation Assay erstellen demonstriert. Bei Raumtemperatur entwickeln Xenopus Embryonen sehr schnell durch die Stufen 9 und 15. Indem sie bei 14 ° C, die Entwicklung des Embryos wird verlangsamt und viele weitere Transplantationen können in einem Experiment durchgeführt werden. Sollte es notwendig sein, um die Embryonen zu älteren Stadien (&gt; 42/43) wachsen wird,...

<table><tbody><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillarrohre (1,0 mm Außendurchmesser x 0,5 mm Innendurchmesser)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Sutter-Mikropipettenzug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin-Sulfat [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard/Elastomer-Kit 1,1 lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petrischale aus Polystyrol</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>menschliches Choriongonadotropin</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Pico-Injektor-Mikroinjektionssysteme</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Dumostar #5 Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue bestimmung mit dem tier cap transplant (act) assay in xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Viele Proteine ​​spielen eine doppelte Rolle in der embryonalen Entwicklung. Diejenigen, die Zelle Schicksal Bestimmung in einem bestimmten Gewebe zu regulieren kann auch Auswirkungen auf die Entwicklung einer größeren Region des Embryos. Dies macht die Definition seiner Rolle in einem bestimmten Gewebe schwer zu analysieren. Zum Beispiel,<em&gt; Noggin</em&gt; Überexpression in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen bewirkt, dass der Ausbau des gesamten vorderen Bereich, einschließlich der Augen<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Aus diesem Ergebnis ist es nicht bekannt, ob Noggin spielt eine direkte Rolle in Auge Bestimmung oder indem ein Ausbau des Nervengewebes, Noggin indirekt auf die Entstehung des Auges. Nachdem dieser komplexen Phänotyp macht das Studium ihrer Augen-spezifische Rolle in der Zelle Schicksal Bestimmung schwer zu analysieren. Wir haben einen Test, dass dieses Problem überwindet entwickelt. Unter Ausnutzung der pluripotenten Charakter der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tier Kappe<sup&gt; 3</sup&gt; Wir haben einen Test auf die Fähigkeit von Gen-Produkt (e)-Test entwickelt, wie<em&gt; Noggin</em&gt; Oder das Auge Feld Transkriptionsfaktoren (EFTFs), um Kappen in bestimmte Gewebe oder Zelltypen zu verwandeln durch die Transplantation von diesem Gewebe auf die Seite des Embryos<sup&gt; 4</sup&gt;. Während wir fanden entweder Noggin-Protein-Behandlung oder eine Sammlung von Transkriptionsfaktoren können retinale Zelle Schicksal in der Tier-Mützen zu bestimmen haben, kann das Verfahren verwendet werden, um Gen-Produkt (e) in der Angabe anderer Gewebe ebenfalls beteiligt zu identifizieren.

Tierische caps überexprimierenden Genprodukt (e) auf die Flanke der Entwicklung von transplantierten<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen, um festzustellen, ob Gewebe bestimmt wird.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Viele Proteine nehmen eine Doppelrolle in der Embryonalentwicklung ein. Proteine, die die Bestimmung des Zellschicksals in einem bestimmten Gewebe regulieren, können auch die Entwicklung beeinflussen ...

Das übergeordnete Ziel des A-CT-Assays besteht darin zu prüfen, ob ein Gen oder mehrere Gene der Untersuchung die primitive Dermis in Richtung eines bestimmten Zellschicksals lenken können. Das Verfahren beginnt damit, dass zunächst die RNAs, die ein fluoreszierendes Reportergen sowie das Gen oder die Gene der Untersuchung kodieren, in sich entwickelnden XUS-lavis-Embryonen überexprimiert werden. Im nächsten Schritt wird die Animal-Cap oder die primitive Odum, in der die überexprimierten RNAs vorliegen, isoliert und bis zum Entwicklungsstadium 15 kultiviert.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Gewebe an der Flanke eines Embryos des Wirts im Stadium 15 zu entfernen. Der letzte Schritt ist die Transplantation der Hälfte des Donator-Gewebes aus der Animalcap an die Flanke des Wirts-Embryos und das Heranzüchten des Wirts bis zum Stadium 42 bis 43. Die Ergebnisse zeigen die Bildung ektopischen Gewebes, wie augenähnliche Strukturen, durch Schnittpräparation und Immunfärbung für gewebespezifische Marker.Hallo, ich bin Sine aus der Abteilung für Augenheilkunde an der Upstate Medical University. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren, das wir als Animal-Cap-Transplantations-Assay bezeichnen und das ich in Zusammenarbeit mit Mike Suber entwickelt habe. Wir verwenden diesen Assay in beiden Laboren, um Gene zu untersuchen, die ausreichend für die Augenbildung sind.Beginnen wir also. Bereiten Sie zunächst die Kap-RNAs für die Injektion vor, transkribieren Sie Noggin oder ein anderes Gen Ihrer Wahl sowie YFP, das als Tracer verwendet wird. Bereiten Sie außerdem die auf MMR basierenden Lösungen, einen Vorrat an achtfacher Ei-Legelösung und die Nadeln zur Injektion der Embryonen vor.Eine speziell angefertigte Elastomerform wird zur Herstellung von Embryohalterungen verwendet. Erzeugen Sie eine Injektionsplatte pro Versuchsbedingung, indem Sie 1 % AROS in 0,4 XMMR in einer Mikrowelle schmelzen. Geben Sie etwa sechs Milliliter der Lösung in eine 60-Millimeter-Platte. Platzieren Sie vorsichtig eine Elastomermatrize auf der Lösung, um Blasenbildung zu vermeiden, und lassen Sie sie etwa 20 Minuten abkühlen. Erzeugen Sie bei Raumtemperatur je experimentelle Bedingung eine Kapselfernplatten-Matrize unter Verwendung von 1 % AGROS plus 0,7 XMMR mit den Matrizen, wie zuvor für die Injektionsplatten gezeigt. Bereiten Sie für jeden Zeitpunkt zusätzliche Platten vor.Die Berechnung der Zeitpunkte ist in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Danach isolieren. Testen Sie diese von einem männlichen Frosch und lagern Sie das Gewebe bei vier Grad Celsius in einer sterilen Lösung aus 1 x MMR, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin.Dies kann bis zu einer Woche vor Beginn des Experiments durchgeführt werden, beachten Sie jedoch, dass die Spermien im Laufe der Zeit an Wirksam游戏副本Jetzt ist alles für die Mikroinjektion am folgenden Tag vorbereitet. Entfernen Sie zunächst die hormonell induzierten Weibchen und setzen Sie sie in einzelne Becken mit jeweils einem XELS. Bereiten Sie die Injektionsnadel vor, indem Sie die Spitze abschneiden.Um einen Durchmesser von 25 bis 35 Mikrometern zu erhalten, setzen Sie die Nadel auf den PLI-100-Piko-Injektor und kalibrieren Sie sie so, dass sie pro Injektion 10 Nanoliter abgibt. Stellen Sie einen Inkubator auf 14 Grad Celsius ein, indem Sie den Auslass auf diese niedrigere Temperatur einstellen. Nach der Injektion mit RNA verlangsamt sich die Entwicklung des Embryos, und es können weitaus mehr Transplantationen in einem Experiment durchgeführt werden. Etwa eine Stunde vor der Befruchtung entfernen Sie die Eier aus dem Becken. Sobald die Weibchen eine zusätzliche Stunde lang Eier gelegt haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um die frisch gelegten Eier aus dem Becken zu entnehmen.Beachten Sie, dass Eier, die länger als zwei Stunden in der ELS-Lösung waren, nicht verwendet werden sollten. Da die Qualität der Eier abnimmt, geben Sie die Eier in 60 Millimeter große Petrischalen. Die Schale ist zu etwa 80 % mit einer einzigen Eierschicht gefüllt.Entfernen Sie so viel ELS wie möglich aus den Eiern und ersetzen Sie es durch ein XMMR. Die Eier können bis zu einer Stunde in einem XMMR verbleiben. Befruchten Sie die Eier anschließend in vitro mit homogenisiertem Hodengewebe.Es ist am besten, die Embryonen in drei separaten Ansätzen gegen 11:00 Uhr und 13:00 Uhr zu befruchten, damit sie bis zur gewünschten Entwicklungsstufe heranwachsen können: 8,5 bis 9 für die Kapselfernisolierung und Stufe 15 für die Transplantation. Eine Stunde nach der Befruchtung der Eier entfernen Sie die Eigeleeschicht mithilfe von D-Jelly-Lösung. Waschen Sie die Eier gründlich mit großen Mengen 0,1 XMMR und warten Sie anschließend, bis die befruchteten Eier das Zweizellstadium erreicht haben.Um mit dem Sortieren zu beginnen, bereiten Sie eine Injektionsschale vor, die mit 0,4 XMMR plus 6 % F ccal gefüllt ist. Sobald die Embryonen das Zweizellstadium erreicht haben, verwenden Sie eine Transferpipette, um Embryonen mit gleichmäßiger Pigmentierung und symmetrischer Teilung in die Vertiefung der Injektionsschale zu sortieren.Fahren Sie fort, indem Sie zuerst das Profil über die Oberseite eines 60-Millimeter-Petri-Schalen-Deckels spannen. Geben Sie zwei Mikroliter der RNA-Probe auf den Biofilm und saugen Sie sie auf. Füllen Sie die Injektionsnadel mit dem Pico-Injektor.Stellen Sie sicher, dass die Nadel weiterhin 10 Liter Probe abgibt, bevor Sie mit der Injektion beginnen. Die RNA wird in beide Blastomeren eines Zweizellstadium-Embryos injiziert. Injizieren Sie jeweils 20 bis 30 Embryonen mit 500 Pikogramm Y-F-P-R-N-A und legen Sie sie in eine Schale. Injizieren Sie jeweils weitere 20 bis 30 Embryonen mit 20 Pikogramm Nain-RNA, die zuvor mit Y-F-P-R-N-A-RNA vorgemischt wurde, und geben Sie sie in eine Petrischale. Zusätzlich werden pro Zeitpunkt 100 bis 200 nicht injizierte Embryonen in eine andere Injektionsschale mit FICO-Lösung gegeben. Diese Embryonen werden gleichzeitig mit den injizierten Embryonen in den Inkubator hinein- und wieder herausgenommen.Dies sind die Wirtstiere, die nach der Injektion zur Transplantation der Kappen verwendet werden sollen. Inkubieren Sie alle Embryonen über Nacht bei 14 Grad Celsius. Wiederholen Sie dies für alle geplanten Zeitpunkte.Nach der Übernacht-Inkubation kann die Animal-Cap isoliert werden. Kommen Sie früh am Morgen, um die Embryonen zu einteilen. Denken Sie daran, auch die nicht injizierten Wirtsembryonen aus dem Inkubator zu entfernen.Der früheste Zeitpunkt sollte dem Stadium neun entsprechen. Entfernen Sie zunächst die Embryonen, die nicht überlebt haben. Isolieren Sie anschließend die Animalcaps von den lebensfähigen Embryonen, wobei Sie für jeden Zeitpunkt getrennte Chargen in eine Isolierschale überführen.Geben Sie eine reichliche Menge der 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung hinzu. Gießen Sie dann die Fol-Lösung von jedem Teller mit injizierten Embryonen ab und geben Sie erneut 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung hinzu. Lösen Sie die Embryonen mithilfe einer Transferpipette aus den Vertiefungen ihrer Injektionsplatte und geben Sie sie in die frisch vorbereitete Kap-Isolationschale.Verwenden Sie entweder den Gastro-Master mit einem gelben, auf 400 Mikrometer gebogenen Tipp oder ein Paar scharfe Nr.-5-Präparationsbestecke, um die Animal Caps in 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung zu isolieren. Behalten Sie zwei oder drei intakte Embryonen zur Stadienbestimmung bei. Nach der Isolierung der Animal Caps legen Sie diese zusammen mit den Wirtsembryonen wieder in den Inkubator bei 14 Grad Celsius, bis sie am nächsten Tag auf die Flanke der Wirtsembryonen transplantiert werden.Entfernen Sie die Kappen und Wirtsembryonen des ersten Zeitpunkts aus dem 14 Grad Celsius Inkubator und sortieren Sie die Embryonen nach einheitlich fluoreszierend positiven Kappen. Zählen Sie die Anzahl der Kappen und entfernen Sie sie. Verdoppeln Sie die Anzahl der Wirtsembryonen in eine frisch vorbereitete Injektionsschale mit 0,7 XMMR plus Gentamycin-Lösung unter Verwendung scharfer Nr.-5-Pinzetten.Entfernen Sie die Lene-Membran von jedem Wirts-Embryo. Überführen Sie sie in die Platte mit den Kappen, achten Sie jedoch darauf, dass sie ohne ihre Lene-Membranen vorsichtig behandelt werden. Die Embryonen können sich schnell an der Wasseroberfläche lösen, weshalb entweder der Gastro-Master mit einer gelben Spitze und einem 200 bis 250 Mikrometer langen gebogenen Draht auf der höchsten Stufe oder Pinzette Nummer fünf verwendet werden sollte.Entfernen Sie ein 200 Mikrometer großes Quadrat an der Seite des Embryos im Stadium 14 bis 15. Verwenden Sie dann erneut den Gastro-Master oder die Pinzette Nummer fünf. Schneiden Sie eine Kappe der Länge nach durch und legen Sie das Gewebe in die Öffnung, die im Wirts-Embryo erzeugt wurde.Drehen Sie das Embryo gegen die Vertiefung, um die Heilung zu ermöglichen. Führen Sie dies bei so vielen Embryonen wie möglich durch, solange diese im Stadium 15 sind. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte.Der Embryo heilt normalerweise innerhalb von 30 Minuten. Entfernen Sie mit Pinzette Nummer fünf die toten Zellen, die durch eine sanfte Bürstbewegung weiß erscheinen. Kultivieren Sie die transplantierten Embryonen über Nacht bei 18 Grad Celsius.Nach der Übernacht-Inkubation arbeiten Sie unter dem Fluoreszenz-Zerlege-Mikroskop, um Embryonen mit fluoreszenzmarkiertem transplantiertem Gewebe zu sortieren. Stellen Sie die ausgewählten Embryonen zurück auf 18 Grad Celsius, um sie bis zum Stadium 42 bis 43 wachsen zu lassen. Wenn die Tiere das gewünschte Stadium erreicht haben, betäuben Sie sie in Trica und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Zerlege-Mikroskop und machen Sie Aufnahmen.Die transplantierten Embryonen können anschließend fixiert, geschnitten und immunhistochemisch gefärbt werden, oder es kann eine In-situ-Hybridisierung mit Markern für ein gewünschtes Gewebe durchgeführt werden. Hier sind repräsentative Ergebnisse eines Wirtskaulquappens mit Spendergewebe, das einen fluoreszierenden Tracer und Noggin exprimiert, einen Tag nach der Transplantation. Beachten Sie, wie sich das Gewebe seitlich am Körper des Kaulquappens zu einem Knäuel zusammenzieht.Die Wirtsembryonen, die kontrolliertes Donorgewebe erhalten, das nur den fluoreszierenden Tracer exprimiert, beginnen bereits damit, die Animal-Cap-Zellen an ihrer Flanke einzubauen. Einige Tage später bilden die Kaulschlingen, die Donorzellen mit nain-Expression erhalten, an ihrer Seite augenähnliche Strukturen aus, während die Kaulschlingen, die das Kontroll-Donorgewebe erhalten, fluoreszierende Zellen auf der Oberfläche ihrer Haut aufweisen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den Animal-Cap-Transplantations-Assay in Zaps Lavis durchführt.Bei der Durchführung dieses Assays ist es wichtig, daran zu denken, alles vor dem Verfahrenstag bereitzuhalten, damit die Embryonen nicht schneller entwickeln, als Sie zu ihnen gelangen können. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

Eine Technik zum Trans "Extreme Anterior Domain" Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Dies ist der erste Teil eines umfassenden Xenopus-Sampling-Protokolls. Bei den entnommenen Geweben handelt es sich um den Herzventrikel, den arteriellen Stamm, den linken Leberlappen, die Gallenblase, die Lunge, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, den Kehlkopf, den Kehlkopf, die Speiseröhre, den Magen, den Darm, die Hoden, die Fettkörper, den Eileiter, die paarigen Nieren, den Ischiasplexus, die Haut, den Thymus und das ganze Auge.

Effiziente Techniken für eine umfassende Probenahme von zugänglichem Gewebe bei adulten Xenopus

Erfahren Sie, wie der Animal Cap Transplant Assay in Xenopus laevis zur Untersuchung der Gewebedetermination durch Genüberexpression eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellfatespezifikation in der Entwicklungsbiologie.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

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