Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Dieses Protokoll demonstriert eine videobioinformatische Methode zur Messung des Wachstums menschlicher embryonaler Stammzellkolonien durch die Analyse von Zeitraffervideos, die in einem CT-Inkubator der icon bio station gesammelt wurden, der mit einer Kamera für die Videobildgebung ausgestattet ist. Humane embryonale Stammzell- oder HESC-Kolonien werden auf 70 % Co-Flüssigkeit kultiviert, neu plattiert und 48 Stunden lang inkubiert, danach werden die HESC-Kolonien für weitere 48 Stunden im Biot ct gefilmt. Die Wachstumsrate wird anhand von Segmentierungserweiterungs- und Messrezepten bestimmt, die mit der CL Quant-Software entwickelt wurden.

Die Rezepte werden durch den Vergleich mit Adobe Photoshop validiert, einem Bildanalysetool, das eine präzise manuelle Anpassung der Masken an jede Kolonie ermöglicht. Das aufstrebende Gebiet der Video-Bioinformatik kann genutzt werden, um die Verarbeitung, Analyse und das Mining biologischer Daten aus mikroskopischen Videos zu automatisieren. Hallo, ich bin Serena Lin aus dem Labor von Dr. Prou Talbot in der Abteilung für Zellbiologie und Neurowissenschaften hier an der University of California Riverside.

Hallo, ich bin Sean Fino, ebenfalls vom Talbot Lab. Hallo, ich bin TI Satish vom Cell Molecular and Developmental Biology Graduate Program. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie das Wachstum menschlicher embryonaler Stammzellkolonien mit Hilfe von Video-Bioinformatik-Tools messen können.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Auswirkungen von Umweltgiften auf das Verhalten menschlicher embryonaler Stammzellen zu messen. Wir werden dieses Verfahren in unserer neuen Stammzell-Core-Anlage demonstrieren. Also lasst uns loslegen.

Um HESC für die Videoanalyse vorzubereiten, züchten Sie HESC On Matrigel-beschichtete Sechs-Well-Platten bis zu 70 % konfluentes Aspiratmedium aus einer Well, die HESC enthält, und spülen Sie es zweimal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie einen Milliliter Accutane hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann 10 bis 12 Glasperlen in die Vertiefung und schütteln Sie die Platte vorsichtig, bis sich die Kolonien vollständig lösen.

Neutralisieren Sie Accutane mit einem Milliliter humanen embryonalen Stammzellen zur Erhaltungstherapie, Medium oder embryonalen Fibroblasten der Maus. Sammeln Sie die abgelösten Zellen ohne die Kügelchen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 200 g. Dekantieren Sie das SUP-Natant und brechen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern frischem Erhaltungsmedium für menschliche embryonale Stammzellen oder M-T-E-S-R-Platte, 100 Mikrolitern der HESC-Suspension tropfenweise in mehrere Vertiefungen einer mit Matrigel beschichteten 12-Well-Platte.

Bewegen Sie die Platte vorsichtig hin und her und beobachten Sie die Kulturen unter einem Lichtmikroskop, damit die Zellklumpen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind. Stellen Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator, um sicherzustellen, dass die Zellen flach und groß genug sind, um sie leicht sichtbar zu machen. Nach 48 Stunden aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Vertiefungen mit 500 Mikrolitern PBS, um nicht gebundene Zellen zu entfernen, und fügen Sie dann jeweils 500 Mikroliter M-T-E-S-R-Medium hinzu.

Setzen Sie die Platte sofort in das Biot CT ein und beginnen Sie mit der Aufnahme von Zeitrafferbildern. Versuchen Sie, Felder mit diskreten Einzelvölkern auszuwählen, auf denen es unwahrscheinlich ist, dass sie zu anderen Völkern heranwachsen. Bei diesem Protokoll werden die Zellen für weitere 48 Stunden mit Bildern im Sieben-Minuten-Intervall aufgezeichnet.

Um zuerst das Segmentierungsrezept zu erstellen, scannen Sie das gesamte Video manuell, um sicherzustellen, dass es eine einzelne Kolonie enthält, die während des gesamten Aufnahmezeitraums fokussiert bleibt. Öffnen Sie danach den Segmentierungsassistenten in der CL quants-Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Wählen Sie den richtigen Bildkanal aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.

Wählen Sie Soft Matching und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie eine oder zwei gewünschte Bereiche aus, indem Sie den äußeren Rand zum mittleren Bereich der Kolonie kreisen. Dieser Bereich sollte so klein wie möglich sein, aber repräsentativ für die gesamte Kolonie sein.

Wählen Sie nicht zu viele Regionen aus, da dies zu einer ungenauen Maskenanwendung führen kann. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Wählen Sie Regionen nicht wünschen, indem Regionen eingekreist werden, die nicht Teil der Kolonie und nicht Teil des Hintergrunds sind.

Diese Regionen weisen Muster auf, die unterdrückt werden sollten, wie z. B. Ablagerungen und abgestorbene Zellen. Klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den Hintergrund aus, indem Sie Bereiche einkreisen, die keine Kolonien, Ablagerungen oder toten Zellen sind.

Der Hintergrund sollte einheitlich sein und wahrscheinlich in jedem Bild zu sehen sein. In der Regel wählen wir den grauen Hintergrund um die Kolonie aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.

Eine farbige Maske sollte über dem Interessenbereich angezeigt werden, wenn die Maske den Interessenbereich nicht genau abdeckt. Der Segmentierungsschwellenwert in der unteren rechten Ecke des Bildschirms kann erhöht oder verringert werden, wenn eine Änderung der Maske erforderlich ist. Wählen Sie "Soft-Matching-Regionen aktualisieren" aus.

Dies ermöglicht es, die Bereiche "Want", "Don't Want" oder "Hintergrund" zu ändern. Wenn die Maske zufriedenstellend ist, wählen Sie Schwellenwert anwenden und meine Maske speichern. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter.

Die Maske wird dann in einer anderen Farbe angezeigt. Wählen Sie Fertig stellen. Das Rezept sollte in der rechten oberen Ecke der Software als Segmentierungsrezept angezeigt werden.

Benennen Sie das Rezept bei Bedarf um, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und einen neuen Namen eingeben. Um das Rezept anzuwenden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und platzieren Sie die Maus darüber.

Rezept anwenden. Es erscheint ein Menü, in dem Sie die Anzahl der zu verwendenden Frames auswählen können. Legen Sie das Frame-Intervall auf alle 20 Frames fest, um die Wiedergabetreue der Maske zu gewährleisten.

Führen Sie nach dem Zufallsprinzip eine manuelle Stichprobenprüfung von 10 % der Frames durch, auf die die Maske angewendet wurde, um ein Verbesserungsrezept zu erstellen, das unerwünschte Bereiche in Ablagerungen entfernt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner für das Verbesserungsrezept, und klicken Sie dann auf Neu. Ein neues Erweiterungsrezept sollte aus dem ursprünglichen Sichtfeld angezeigt werden.

Bewegen Sie die Maus über die Symbole in der Symbolleiste, um die Schaltfläche zum Umschalten des Erweiterungsmoduls rechts neben dem Bild zu identifizieren, und klicken Sie darauf. Wählen Sie das Dropdown-Menü "Beschriftung" aus. Wählen Sie die Beschriftung für die Verbindung aus, wählen Sie die Beschriftung für die beiden verbundenen aus.

Eine neue Aufgabenleiste sollte angezeigt werden. Nehmen Sie die Anfangsmaske aus dem Segmentierungsrezept und ziehen Sie sie in das Eingabefeld. In der Leiste sollte nun die Nummer der Eingabemaske angezeigt werden.

Ziehen Sie das Symbol mit der Nummer der Eingabemaske auf das Symbol Null der Maske. Suchen Sie die Mindestgröße in der Taskleiste und passen Sie die Zahl an, bis nur der gewünschte Bereich angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede passende Testversion auf Ausführen klicken.

Sobald die minimale Größenanpassung zufriedenstellend ist, klicken Sie auf das vorherige Verbesserungsrezept am unteren Bildschirmrand und wählen Sie In Rezept speichern. Die Software fordert Sie nun auf, das ausgewählte Rezept zu überschreiben und Ja Spot auszuwählen. Prüfen Sie das Erweiterungsrezept mit der gleichen Vorgehensweise wie bei der Stichprobenprüfung der Segmentierung.

Wenn Sie mit den Segmentierungs- und Verbesserungsrezepten zufrieden sind, fahren Sie mit der Erstellung der Messvorlage fort. Um mit der Auswahl zu beginnen, erstellen Sie eine Messvorlage in der rechten Symbolleiste. Wählen Sie im Messfenster die Option Cursor über die ClipArt-Zellenfigur bewegen.

Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und wählen Sie die Zelle unter dem Abschnitt Morphologie aus, deaktivieren Sie den Standardparameter und den Bereichsparameter. Verlassen Sie dann das Vorlagenfenster. Wählen Sie das Symbol aus.

Erstellen Sie ein Messrezept. Benennen Sie das Rezept um. Wechseln zur Registerkarte Vorlage und auswählen In der oberen rechten Ecke ziehen Sie die zuvor erstellte Messvorlage per Drag & Drop in das Messfenster.

Klicken Sie auf Ja, um im Fenster des Messrezepts fortzufahren, und wählen Sie Kanalzuordnungen aus. Wählen Sie dann die Maskenzuordnungen für die ganze Zelle aus. Wählen Sie dann die Option "Ganze Zelle" Für eine verbesserte Maske wählen Sie das Messrezept auf der Registerkarte "Rezept" aus.

Wählen Sie im Hauptfenster das Symbol Speichern im Fenster des Messrezepts aus. Schließen Sie dann das Fenster Weiter schließen und öffnen Sie das Sichtfeld erneut. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Rezeptlistenordner und klicken Sie dann auf Neu: Ziehen Sie Rezepte in der Reihenfolge der erforderlichen Anwendung in die Rezeptliste, wählen Sie Rezeptliste sperren und führen Sie die Rezepte nacheinander auf den Videodaten mit Adobe Photoshop aus.

Jedes 20. Bild der gleichen Völker wurde analysiert. Öffnen Sie manuell den Rahmen eines Koloniebildes in Adobe Photoshop. Klicken Sie auf das Zauberstab-Werkzeug in der Symbolleiste.

Klicke auf den Bereich um die Kolonie, so dass das gesamte Feld mit Ausnahme der Kolonieregion bedeckt ist. Achte darauf, dass die gestrichelte Linie um das Volk herum genau um den Rand des Volkes herum und nicht innerhalb des Volkes sitzt. Wenn sich die gestrichelte Linie nicht um den Rand herum befindet, ändern Sie den Toleranzwert in der oberen Symbolleiste entsprechend.

Klicken Sie in der Symbolleiste auf Im Schnellmaskenmodus bearbeiten und klicken Sie auf die Kolonie, damit die Kolonie ausgewählt wird. Gehen Sie zum Fenster, ziehen Sie das Menü herunter und klicken Sie auf Histogramm. Der Cache sollte auf eins gesetzt sein.

Wenn es sich um zwei Caches handelt, klicken Sie auf das Ausrufezeichen mit dem Ausdruckszeichen, um den Cache in einen Cache zu ändern. Notiere den Pixelwert in einer Tabelle. Wiederholen Sie den obigen Vorgang für jedes 20. Bild.

Daten, die mit Photoshop und CL quant gesammelt wurden, können dann zusammen dargestellt werden. Unser Protokoll zur Quantifizierung des HESC-Koloniewachstums zeigt eine Anwendung der Videobioinformatik auf ein biologisches Problem. Hier zeigen wir eine Grafik, die die Zunahme der Koloniegröße über 48 Stunden vergleicht, wie sie mit der CL Quant-Software und Adobe Photoshop ermittelt wurde.

Die Grafik zeigt fünf verschiedene Kolonien, die jeweils von beiden Softwarepaketen analysiert wurden. Jede Kolonie wird durch eine andere Farbe dargestellt. Die durchgezogenen Linien wurden mit der Software sail quant abgeleitet, während die gestrichelten Linien mit Photoshop erfasst wurden.

Die Grafik der Rohdaten zeigt, dass beide Messmethoden gut übereinstimmen, um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass die Kolonien eine unterschiedliche Ausgangsgröße haben. Diese Abbildung zeigt die Daten, die als prozentuale Zunahme der Koloniegröße dargestellt werden. Die Wachstumsraten sind unabhängig von der Größe der Ausgangskolonie ähnlich und beide Analysemaße liefern ähnliche Ergebnisse.

Das folgende Diagramm zeigt die Mittelwerte der vorangegangenen prozentualen Veränderungsdaten zum Wachstum der HESC-Kolonien. Diese Grafik zeigt deutlich eine gute Übereinstimmung zwischen der Analyse mit Hilfe der Videobioinformatik und Adobe Photoshop. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie das Wachstum menschlicher embryonaler Stammzellkolonien mit Hilfe von Video-Bioinformatik-Tools messen können.

Wenn Sie dieses Verfahren mit der Phasenkontrastmikroskopie durchführen, achten Sie darauf, den Halo um die Kolonie herum einzubeziehen, um eine präzise Kolonieauswahl durch die Software zu ermöglichen. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass andere Methoden zum Kultivieren, Inkubieren und Sammeln von Videos anstelle des von uns demonstrierten Protokolls verwendet werden können. Sobald die Rezepte entwickelt und validiert sind, werden sie die Analyse viel schneller und mit weniger experimentellen Variationen durchführen als bei der manuellen Analyse.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.