Name: Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Lernen Sie die magnetische Modulations-Biosensorik zur schnellen, homogenen Detektion von Interleukin-8 (IL-8) mit magnetischen Perlen und fluoreszenter Markierung. Diese Methode ermöglicht empfindliche Analysen ohne Waschschritte.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die Ishaya Horowitz Fund unterstützt.

IL-8-Assay: <ol><li> Das Reaktionsgemisch enthalten die folgenden vier Komponenten in 100 ul Endvolumen von Assay-Puffer in ihren jeweiligen Konzentrationen. 10 ul der magnetische Beads mit Capture-Antikörper bei 100 Perlen / ul Endkonzentrationen, 2 ul biotinylierten IL-8-Antikörper bei 1 nano-gram/μl Endkonzentration, 1 ul Streptavidin fluoreszierendes Protein bei 20 nano-gram/μl Endkonzentration, und 1 ul IL-8 Target bei 0,48 pico-gram/μl. Die Komponenten werden nacheinander auf die Assay-Puffer aufgenommen und werden dann für 30 Minuten geschüttelt. </li><li> Ein Kontroll-Reaktion ist die gleiche Art und Weise ohne die IL-8 Target vorbereitet. </li><li> Die Reaktionen sind später ohne Trenn-oder Waschschritt in die Küvetten gestellt und überprüft mit dem MMB-System. </li></ol> MMB-System: <ol><li> Setzen Sie die Küvette in seiner Position zwischen den beiden elektromagnetische Pole. </li><li> Betreiben Sie das Modulationsstrom und 30 Sekunden warten, um die Aggregation und Kondensation der Perlen ermöglichen </li><li> Messen Sie das Signal des Lock-in-Verstärker mit einem Oszilloskop. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Sichtprüfung der aggregierten Perlen präsentiert einen deutlichen Unterschied zwischen der Reaktion mit dem Ziel und der Reaktion ohne das Ziel. In allen Reaktionen mit dem Ziel, bildete die Perlen einer einzigen dichten Aggregat, das in und aus den Laserstrahl in einem zu vereinen Weise bewegt. Doch in all die Reaktion ohne das Ziel, wurden die Perlen weniger aggregiert und ihre Bewegung war weniger zu vereinen (siehe Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Sichtprüfung der Sandwich "-Immunoassay (a), ohne das Ziel IL-8 (b) Mit dem Ziel IL-8. Der Pol Modulation Uhr (gelb) und die PMT-Ausgangssignal (Magenta) beim Erkennen von 0,48 pico-Gramm-IL-8 Target sind in Abbildung 1 dargestellt (a). Die Modulationsfrequenz für jeden Pol ist mit 2 Hz. Doch wie es theoretisch zu erwarten war, wenn die Perlen der Laserstrahl passieren, erkennt der PMT das Fluoreszenzlicht und es ist ein Spitzenwert in der PMT Ausgangsspannung. Daher ist die Demodulation Frequenz 4 Hz. Wenn die PMT-Signal und das Doppelte-Modulation Uhr (bei 4 Hz), die Sperre im Verstärker gespeist werden, erkennt der sensiblen Phase-Detektor die Synchronisation und die Ergebnisse mit hoher Spannung (siehe Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: (a) die Modulation Uhr (gelb) und die PMT-Signal (magenta), wenn Erkennung 0,48 pico-Gramm-IL-8 Target. (B) Die Folge lock in-Verstärker Spannung an zwei verschiedenen Scans. Das Schloss in Verstärker erkannte kein Signal, wenn die Kontrollprobe getestet wurde. Diese Tatsache, zusammen mit den visuellen Unterschied in Aggregation nahe, dass die MMB-System kann eindeutig die Anwesenheit von IL-8 Target.

<ol><li>Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fluorescent-labeled+probes+at+sub-picomolar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation.</a> Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).</li>
<li>Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homogenous+detection+of+the+Ibaraki+virus+NS3+cDNA+at+pico-molar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+%22Human+angiogenesis+assay+panel%22%22">Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel"</a>. , Bio-Plex Pro. Forthcoming.</li>
<li>Instruction Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Plex+Precision+Pro+Cytokine+Assay%22">Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay</a>. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.</li>
</ol>

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die MMB-System verwendet werden, um die Anwesenheit von IL-8 Target bei niedrigen Konzentrationen (0,5 pico-Gramm liegt die Nachweisgrenze des Bio-Plex Precision Pro Zytokin-Assays [3,4]) zu erkennen. Die Fähigkeit des Systems ist nicht auf IL-8 begrenzt und kann verwendet werden, um andere Proteine ​​zu erkennen. Die Vorteile des MMB-System sind die Fähigkeit, das Ziel schnell und ohne Trenn-oder Waschschritt zu erkennen. So erleichtert es die Erkennung und ermöglicht dem System,...

<table><tbody><tr><td>Bio-Plex Pro Human Zytokin IL-8-Set</td><td>Bio-Rad</td><td>171-B5008M</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-8-Zielprotein</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>R202625</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte monoklonale Maus-Anti-Human-IL-8-Antikörper G265-8</td><td>BD Biosciences</td><td>554718</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-gekoppelter fluoreszierender Proteinmarker</td><td>Bio-Rad</td><td>Streptavidin PE</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle homogene detektion von biologischen assays mit magnetischen modulation biosensorik-system

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Eine magnetische Modulation Biosensorik System (MMB) [1,2] schnell und homogen erkannt biologischer Targets bei niedrigen Konzentrationen ohne Waschen oder Trennschritt. Wenn die IL-8 Target anwesend war, eine &quot;sandwich&#39;-basierter Assay magnetische Beads mit IL-8 Fänger-Antikörper an gekoppelten fluoreszierenden Proteins über die IL-8 Target und einem biotinylierten IL-8-Antikörper Streptavidin. Die magnetischen Beads werden in schwingende Bewegung durch Anlegen einer Wechselspannung Magnetfeldgradienten durch zwei elektromagnetische Pole manövriert. Die fluoreszierenden Proteine, die den magnetischen Kügelchen befestigt sind, sind in den Erfassungsbereich und ihre Bewegung in und aus einem orthogonalen Laserstrahl erzeugt eine periodische Fluoreszenzsignal, demoduliert mit synchronen Erfassung wird kondensiert. Die magnetische Modulation Biosensoren wurde bereits verwendet, um die kodierenden Sequenzen des nicht-strukturellen Ibaraki Virus-Protein 3 (NS3) komplementäre DNA (cDNA) [2] zu erkennen. Die Techniken, die in dieser Arbeit für externe Manipulation und Kondensation von Teilchen nachgewiesen werden können, für andere Anwendungen, zB Lieferung von magnetisch gekoppelt Drogen verwendet werden<em&gt; In-vivo</em&gt; Oder den Kontrast für<em&gt; In-vivo</em&gt; Imaging-Anwendungen.

Magnetic Modulation Biosensorik System wird genutzt, um schnell, feinfühlig und einfach erkennen biologischen Assays, wie DNA-Moleküle und Proteine.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

Ein magnetisches Modulations-Biosensorsystem (MMB) [1,2] detektierte biologische Zielmoleküle in niedrigen Konzentrationen schnell und homogen, ohne dass Waschschritte oder ...

Die magnetische Modulation BIOSENSING oder MMB ist eine neuartige Technik zum Nachweis biologischer Moleküle. Hier wird ein Prinzipnachweis gezeigt, bei dem Interleukin-acht nachgewiesen wird, wenn Interleukin-acht, auch IL-acht genannt, einer Reaktionsmischung hinzugefügt wird, die mit Antikörpern beschichtete magnetische Kügelchen, inativierten anti-IL-acht-Antikörper und fluoreszenzmarkiertes Streptavidin enthält. Es bildet sich effektiv ein molekularer Sandwichkomplex, der das fluoreszierende Molekül mit dem magnetischen Kügelchen verknüpft.Die Reaktion wird in ein Vete und ein wechselndes Magnetfeld gebracht. Gradienten werden über zwei elektromagnetische Pole angelegt, die die Perlen in eine oszillatorische Bewegung versetzen. Die periodische Bewegung der Perle, an die fluoreszierende Proteine gebunden sind, hinein und hinaus aus einem orthogonalen Laserstrahl erzeugt ein Fluoreszenzsignal, das von einem PMT gesammelt und demoduliert wird.Mithilfe eines Lock-in-Verstärkers kann die Bewegung der Kügelchen mit einer CCD-Kamera sichtbar gemacht werden, wobei anstelle des PMT eine synchrone Bewegung in Proben beobachtet wird, in denen die magnetischen Kügelchen über IL-8 mit fluoreszierenden Proteinen verknüpft wurden. Hallo, ich bin Adia aus dem Labor für Nichtlineare Optik und Laser am Department für Physikalische Elektronik der Universität Tel Aviv. Ich bin NoGo vom Department für Biowissenschaften der University of Illinois in Chicago, und ich bin Marcelo Erlich vom Department für Zellforschung und Immunologie der Universität Tel Aviv.Heute stellen wir Ihnen eine Methode zur schnellen homogenen Detektion biologischer Assays unter Verwendung eines magnetischen Modulations-Biosensorsystems vor. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um spezifische Proteine und DNA-Sequenzen in niedrigen Konzentrationen nachzuweisen. Beginnen wir also.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie für jede Reaktion ein Röhrchen vorbereiten und beschriften, einschließlich einer Zielprobe und einer Nicht-Ziel-Kontrollprobe. Geben Sie nacheinander die folgenden Komponenten des Bio-Plex Precision Pro-Zytokin-Assays in jedes Röhrchen: gekoppelte magnetische Kügelchen, Detektionsantikörper gegen IL-8, Streptavidin-PE und IL-8-Target. Füllen Sie mit Assaypuffer auf ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern auf und schütteln Sie 30 Minuten lang auf einem kompakten Orbitalschüttler.Nachdem die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wurden, füllen Sie diese direkt in Küvetten zur Analyse ein. Reinigen Sie mit dem MMB-System klare Küvetten mit Objektträgerreinigungstuch und 70 %igem Ethanol. Das zur Analyse verwendete Instrument besteht aus einem frequenzverdoppelten Laser mit 488 Nanometer, der als Anregungslichtquelle dient und mittels eines dichroitischen Strahlteilers bei 562 Nanometer auf eine Mikroskop-Objektivlinse gelenkt wird.Die Objektivlinse des Mikroskops fokussiert den Laser zu einem 27 Mikrometer breiten Strahl in einem 400 Mikrometer breiten BO-Silikatglasrohr. Das emittierte Licht wird spektral mit zwei aufeinanderfolgenden Bandpassfiltern gefiltert, von einem Fotomultiplikator oder PMT detektiert und mittels einer Lock-in-Verstärkerschaltung demoduliert. Ein selbstgebauter Strommodulator wird verwendet, um nacheinander eine Rechteckwelle an jeden Elektromagneten anzulegen.Die Amplitude sollte 1,4 Ampere betragen, bei einer Frequenz von ein bis sechs Hertz, da die Kügelchen bei jedem Zyklus zweimal in den Laserstrahl eintreten und ihn verlassen. Die Demodulationsfrequenz am Lock-in-Verstärker liegt zwischen zwei und 12 Hertz. Starten Sie das System, indem Sie den Schlüssel für den 488-Nanometer-Laser in die Ein-Position drehen und die Stromversorgung einschalten.Danach die Laserleistung auf etwa vier bis sechs Milliwatt auf das Minimum einstellen. Das Oszilloskop einschalten, danach die PMT einschalten. Als Nächstes die Probenzelle zwischen die beiden elektromagnetischen Pole bringen.Verwenden Sie den Drehständer des Vete, um sicherzustellen, dass der Laserstrahl durch das Vete hindurchtritt und nicht die Wände des Vete trifft. Verwenden Sie den XY- und Z-Translationsständer des Vete, um dessen Position relativ zur Objektivlinse und den elektromagnetischen Polen zu verändern. Um die Kopplung des Fluoreszenzlichts in den Detektor zu optimieren, sollte das Vete leicht hinter der Polachse positioniert werden.Stellen Sie nun das Oszilloskop auf die Zeitverlaufs-Messung ein. Stellen Sie die PMT-Verstärkungsregelung auf 0,5 Volt ein. Schalten Sie als Nächstes den Strommodulator ein und stellen Sie die Frequenz auf drei Hertz ein.Warten Sie 30 Sekunden, um die Aggregation und Kondensation der Kügelchen zu ermöglichen. Die magnetischen Kügelchen beginnen zu oszillieren und bewegen sich in Richtung der Vorderseite des Röhrchens. Wenn der Laserstrahl auf die oszillierenden Kügelchen trifft, sollte ein Flimmern des reflektierten Laserlichts von den Kügelchen sichtbar sein.Beachten Sie, dass sich die Kügelchen schneller bewegen, wenn die Strommodulation erhöht, und langsamer, wenn sie verringert wird. Die Position der Kügelchen im Rohr kann mithilfe der mikrometrisch verstellbaren Stufen angepasst werden. Um die Bewegung der Pole zu verfolgen, kann eine CCD-Kamera, die anstelle der PMT platziert wird, zur Visualisierung der Kügelchenbewegung verwendet werden.Das Oszilloskop erfasst das periodische Signal der fluoreszenzgekoppelten Perlen und zeichnet die Zeitkurve des Oszilloskops auf. Die gespeicherten Daten können mit MATLAB analysiert werden. Reaktionsgemische mit und ohne IL acht wurden mittels MMB untersucht. In allen Reaktionen mit dem Ziel bildeten die Perlen ein einziges dichtes Aggregat, das synchron in den Laserstrahl hinein- und wieder herausbewegte.Jedoch waren die Perlen ohne Ziel weniger aggregiert und ihre Bewegung weniger einheitlich. Hier zeigen die in Gelb dargestellte Polmodulationsuhr und das in Magenta dargestellte PMT-Ausgangssignal die Modulationsfrequenz für jeden Pol bei zwei Hertz. Daher liegt die Demodulationsfrequenz bei vier Hertz, wie theoretisch erwartet.Wenn die Kügelchen den Laserstrahl passieren, erfasst die PMT das fluoreszierende Licht, und es entsteht ein Peak in der Ausgangsspannung der PMT, wenn das PMT-Signal und der Doppelmodulations-Takt dem Lock-in-Verstärker zugeführt werden. Der empfindliche Phasendetektor sorgt für die Synchronisation und führt zu Hochspannung. Die beiden Farben zeigen zwei verschiedene Messungen bei derselben Zielkonzentration an.Die schwarzen Linien stellen den Durchschnitt jedes Signals dar. Der Lock-in-Verstärker detektierte kein Signal, als die Kontrollprobe getestet wurde. Der Lock-in-Verstärker lieferte für diesen Fall kein gesperrtes Signal.Diese Tatsache, zusammen mit dem visuellen Unterschied in der Aggregation, legt nahe, dass das MMB-System und der Unterschied in den zeitlichen Verlaufs-Messungen des PMT-Ausgangssignals das Vorhandensein des ILH-Ziels eindeutig identifizieren können. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man biologische Moleküle mithilfe magnetischer Modulation schnell und homogen nachweisen kann. Biosensing mit IL acht als Beispiel.Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lasersicherheitsvorschriften zu beachten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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