Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

Die magnetische Modulation BIOSENSING oder MMB ist eine neuartige Technik zum Nachweis biologischer Moleküle. Hier wird ein Prinzipnachweis gezeigt, bei dem Interleukin-acht nachgewiesen wird, wenn Interleukin-acht, auch IL-acht genannt, einer Reaktionsmischung hinzugefügt wird, die mit Antikörpern beschichtete magnetische Kügelchen, inativierten anti-IL-acht-Antikörper und fluoreszenzmarkiertes Streptavidin enthält. Es bildet sich effektiv ein molekularer Sandwichkomplex, der das fluoreszierende Molekül mit dem magnetischen Kügelchen verknüpft.

Die Reaktion wird in ein Vete und ein wechselndes Magnetfeld gebracht. Gradienten werden über zwei elektromagnetische Pole angelegt, die die Perlen in eine oszillatorische Bewegung versetzen. Die periodische Bewegung der Perle, an die fluoreszierende Proteine gebunden sind, hinein und hinaus aus einem orthogonalen Laserstrahl erzeugt ein Fluoreszenzsignal, das von einem PMT gesammelt und demoduliert wird.

Mithilfe eines Lock-in-Verstärkers kann die Bewegung der Kügelchen mit einer CCD-Kamera sichtbar gemacht werden, wobei anstelle des PMT eine synchrone Bewegung in Proben beobachtet wird, in denen die magnetischen Kügelchen über IL-8 mit fluoreszierenden Proteinen verknüpft wurden. Hallo, ich bin Adia aus dem Labor für Nichtlineare Optik und Laser am Department für Physikalische Elektronik der Universität Tel Aviv. Ich bin NoGo vom Department für Biowissenschaften der University of Illinois in Chicago, und ich bin Marcelo Erlich vom Department für Zellforschung und Immunologie der Universität Tel Aviv.

Heute stellen wir Ihnen eine Methode zur schnellen homogenen Detektion biologischer Assays unter Verwendung eines magnetischen Modulations-Biosensorsystems vor. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um spezifische Proteine und DNA-Sequenzen in niedrigen Konzentrationen nachzuweisen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie für jede Reaktion ein Röhrchen vorbereiten und beschriften, einschließlich einer Zielprobe und einer Nicht-Ziel-Kontrollprobe. Geben Sie nacheinander die folgenden Komponenten des Bio-Plex Precision Pro-Zytokin-Assays in jedes Röhrchen: gekoppelte magnetische Kügelchen, Detektionsantikörper gegen IL-8, Streptavidin-PE und IL-8-Target. Füllen Sie mit Assaypuffer auf ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern auf und schütteln Sie 30 Minuten lang auf einem kompakten Orbitalschüttler.

Nachdem die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wurden, füllen Sie diese direkt in Küvetten zur Analyse ein. Reinigen Sie mit dem MMB-System klare Küvetten mit Objektträgerreinigungstuch und 70 %igem Ethanol. Das zur Analyse verwendete Instrument besteht aus einem frequenzverdoppelten Laser mit 488 Nanometer, der als Anregungslichtquelle dient und mittels eines dichroitischen Strahlteilers bei 562 Nanometer auf eine Mikroskop-Objektivlinse gelenkt wird.

Die Objektivlinse des Mikroskops fokussiert den Laser zu einem 27 Mikrometer breiten Strahl in einem 400 Mikrometer breiten BO-Silikatglasrohr. Das emittierte Licht wird spektral mit zwei aufeinanderfolgenden Bandpassfiltern gefiltert, von einem Fotomultiplikator oder PMT detektiert und mittels einer Lock-in-Verstärkerschaltung demoduliert. Ein selbstgebauter Strommodulator wird verwendet, um nacheinander eine Rechteckwelle an jeden Elektromagneten anzulegen.

Die Amplitude sollte 1,4 Ampere betragen, bei einer Frequenz von ein bis sechs Hertz, da die Kügelchen bei jedem Zyklus zweimal in den Laserstrahl eintreten und ihn verlassen. Die Demodulationsfrequenz am Lock-in-Verstärker liegt zwischen zwei und 12 Hertz. Starten Sie das System, indem Sie den Schlüssel für den 488-Nanometer-Laser in die Ein-Position drehen und die Stromversorgung einschalten.

Danach die Laserleistung auf etwa vier bis sechs Milliwatt auf das Minimum einstellen. Das Oszilloskop einschalten, danach die PMT einschalten. Als Nächstes die Probenzelle zwischen die beiden elektromagnetischen Pole bringen.

Verwenden Sie den Drehständer des Vete, um sicherzustellen, dass der Laserstrahl durch das Vete hindurchtritt und nicht die Wände des Vete trifft. Verwenden Sie den XY- und Z-Translationsständer des Vete, um dessen Position relativ zur Objektivlinse und den elektromagnetischen Polen zu verändern. Um die Kopplung des Fluoreszenzlichts in den Detektor zu optimieren, sollte das Vete leicht hinter der Polachse positioniert werden.

Stellen Sie nun das Oszilloskop auf die Zeitverlaufs-Messung ein. Stellen Sie die PMT-Verstärkungsregelung auf 0,5 Volt ein. Schalten Sie als Nächstes den Strommodulator ein und stellen Sie die Frequenz auf drei Hertz ein.

Warten Sie 30 Sekunden, um die Aggregation und Kondensation der Kügelchen zu ermöglichen. Die magnetischen Kügelchen beginnen zu oszillieren und bewegen sich in Richtung der Vorderseite des Röhrchens. Wenn der Laserstrahl auf die oszillierenden Kügelchen trifft, sollte ein Flimmern des reflektierten Laserlichts von den Kügelchen sichtbar sein.

Beachten Sie, dass sich die Kügelchen schneller bewegen, wenn die Strommodulation erhöht, und langsamer, wenn sie verringert wird. Die Position der Kügelchen im Rohr kann mithilfe der mikrometrisch verstellbaren Stufen angepasst werden. Um die Bewegung der Pole zu verfolgen, kann eine CCD-Kamera, die anstelle der PMT platziert wird, zur Visualisierung der Kügelchenbewegung verwendet werden.

Das Oszilloskop erfasst das periodische Signal der fluoreszenzgekoppelten Perlen und zeichnet die Zeitkurve des Oszilloskops auf. Die gespeicherten Daten können mit MATLAB analysiert werden. Reaktionsgemische mit und ohne IL acht wurden mittels MMB untersucht. In allen Reaktionen mit dem Ziel bildeten die Perlen ein einziges dichtes Aggregat, das synchron in den Laserstrahl hinein- und wieder herausbewegte.

Jedoch waren die Perlen ohne Ziel weniger aggregiert und ihre Bewegung weniger einheitlich. Hier zeigen die in Gelb dargestellte Polmodulationsuhr und das in Magenta dargestellte PMT-Ausgangssignal die Modulationsfrequenz für jeden Pol bei zwei Hertz. Daher liegt die Demodulationsfrequenz bei vier Hertz, wie theoretisch erwartet.

Wenn die Kügelchen den Laserstrahl passieren, erfasst die PMT das fluoreszierende Licht, und es entsteht ein Peak in der Ausgangsspannung der PMT, wenn das PMT-Signal und der Doppelmodulations-Takt dem Lock-in-Verstärker zugeführt werden. Der empfindliche Phasendetektor sorgt für die Synchronisation und führt zu Hochspannung. Die beiden Farben zeigen zwei verschiedene Messungen bei derselben Zielkonzentration an.

Die schwarzen Linien stellen den Durchschnitt jedes Signals dar. Der Lock-in-Verstärker detektierte kein Signal, als die Kontrollprobe getestet wurde. Der Lock-in-Verstärker lieferte für diesen Fall kein gesperrtes Signal.

Diese Tatsache, zusammen mit dem visuellen Unterschied in der Aggregation, legt nahe, dass das MMB-System und der Unterschied in den zeitlichen Verlaufs-Messungen des PMT-Ausgangssignals das Vorhandensein des ILH-Ziels eindeutig identifizieren können. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man biologische Moleküle mithilfe magnetischer Modulation schnell und homogen nachweisen kann. Biosensing mit IL acht als Beispiel.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lasersicherheitsvorschriften zu beachten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.