Name: Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektionstechnik für Medaka-Embryonen zur Analyse von Genfunktionen in vivo. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genexpressionsmustern auf Einzelzellebene.

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1. Paarung und sammeln Eier <ol><li> Weibliche und männliche medaka kann leicht durch die Größe und Form des analen und Rückenflossen unterschieden werden. Die Afterflosse der Männchen sind größer und Parallelogramm-förmige Vergleich zu den Weibchen. Die weibliche Afterflosse ist kleiner und Dreieck geformt. Die männlichen Rückenflosse hat eine deutlich sichtbare tiefe Kerbe zwischen den beiden letzten Strahlen. </li><li> Medaka legen bis zu 40 Eier täglich und medaka Weibchen tragen Eier in ihrem Bauch durch Anlagerung Filamente für mehrere Stunden Cluster, bevor sie in den Werken in den Tank entfernt werden. </li><li> Frauen können in einem Netz gefangen und gehalten werden innen sanft von beiden Seiten mit einer Hand. Eier können dann vorsichtig aus dem Bauch mit dem Zeigefinger der anderen Hand aufgezogen werden. Das Weibchen kann dann in den Tank zurückgeführt werden. Eier sollten auf einer 6 cm Petrischale mit Embryo Medien durch stumpfe Pinzette oder einem Finger gefüllt übertragen werden. </li><li> Medaka Paare nur selten zu kämpfen, wenn sie in einem kleinen Paarung Box aufbewahrt werden. Deshalb können sie in einem kleinen Tank mit Wasser fließen gehalten werden, so dass sie verfüttert werden können, und Eier aus dem gleichen Paar gesammelt werden können jeden Tag für ein paar Monate. </li><li> Es ist wichtig, dass die weiblichen Fische sollten nicht ohne Männchen gehalten werden, da der Eisprung stattfindet Alltag in medaka Frauen. Andernfalls können Frauen nicht liefern Eier und sich unwohl fühlt. </li></ol> 2. Reinigung Embryonen <ol><li> Transfer ohne Cluster Eier mit einer Glaspipette auf Schleifpapier (p2000 Korn, wasserdicht) in den Deckel eines 9cm Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges Medium, sondern sorgen für eine ausreichende Lautstärke bleibt zu verhindern Trocknung von Embryonen. </li><li> Sanft rollen Embryonen auf Schleifpapier mit dem Zeigefinger, der Anwendung minimal Druck und halten den Finger parallel zur Oberfläche des Sandes Papier für etwa 45-60 Sekunden, um einige der äußeren Oberfläche Haare des Chorion zu entfernen. Rollen Sie nicht mehr als 5-7 Embryonen auf einmal diese Vorsichtsmaßnahme die Gefahr von Quetschungen Embryonen unter einander zu minimieren. </li><li> Transfer gereinigt Embryonen in ein frisches Gericht Embryo Medium. </li></ol> 3. Machen Agaroseplatten zum Halten Embryonen während der Mikroinjektion Die Embryonen werden in Mulden während der Injektion mit einem Plexiglas-Form in 1,5% Agarose (Abbildung 1) hergestellt worden war. Die Konzentration der Agarose ist wichtig, dass Embryonen richtig halten. <ol><li> Stellen Sie zunächst einen Rahmen aus Agarose, die Plexiglas-Form zu halten. Gießen Sie 1,5% Agarose in Wasser zu einer 0,5 cm Tiefe in einem 9cm Petrischale und warten, bis es erstarrt vollständig. Schneiden Sie einen Bereich des Agarose nur größer als die Größe der Form. </li><li> Gießen Sie 1,5% Agarose, um den Schnitt Bereich zu füllen und legen Sie die Form, so dass keine Luftblasen eingeschlossen sind und warten, bis Agarose erstarrt. Diese Agarose Platte kann in den Kühlschrank zu beschleunigen solidifaction gespeichert werden. </li><li> Entfernen Sie den Schimmel zu Tröge zu schaffen, um die Eier zu halten. Fügen Sie genug Embryo Medium, um die Form, Deckel und lagern bei 4 ° C eintauchen, bis es gebraucht. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der maßgeschneiderten Form verwendet werden, um Tröge in Agarose-Platten für die Mikroinjektion vorzubereiten. </li></ol> 4. Mikroinjektion von medaka Embryonen In Medaka, sind DNA-, RNA-, Morpholino-Oligonukleotide und Tracer Farbstoffe durch das Chorion in das Zytoplasma der 1 bis 64-Zell-Stadium Embryos statt den Dotter als im Zebrafisch mikroinjiziert. Da das Zytoplasma ist kleiner und weniger sichtbar in Medaka, Praxis durch die Injektion von Farbstoffen wie Rhodamin-Dextran wird empfohlen, diese Fähigkeiten zu entwickeln. Die Zugabe von Phenolrot als Indikator wird auch aufgefordert, eine Bestätigung der Injektionen zu ermöglichen. Wie das Chorion umgeben medaka Embryonen ist hart, ist eine kurze, starke und breite Injektionsnadel erforderlich (Abbildung 2). Bereiten Sie diese starke breite Injektionsnadel aus einem Filament-haltigen Glaskapillare. <ol><li> Bereiten Injektionslösung mit Phenolrot als Tracer und laden Sie sie in die Nadel von der Rückseite mit einer Eppendorf Microloader. Schließen Sie die Nadel in die Luft Pumpe-Düse. </li><li> Eier müssen gesammelt und so bald wie möglich ohne Cluster werden nach der Befruchtung an der Ein-Zell-Stadium zu injizieren. Mehr Embryonen können, indem Sie sie auf dem Eis (nicht länger als 30 Minuten), um die Zellteilung zu stoppen injiziert werden. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Vergleich medaka und Zebrafisch Nadeln. Beachten Sie die Spitze des MF Nadel (oben) ist kürzer und breiter daher stärker für die Punktion der harten Chorion umgeben medaka Embryonen. </li><li> Transfer-Eier in die Agarose Platte und richten Sie sie in die Tröge mit einer Pinzette. Kurz vor der Injektion sollte fünf Eier gedreht werden, so dass die Zellmembran der Ein-Zell-Cytoplasma durch th getroffen werden könnene Nadel senkrecht. Das Zytoplasma der one-Zelle kann durch die Suche nach einem Gebiet ohne kleine Öltröpfchen, die gegenüber der Seite des Eies mit dichteste Öltröpfchen gefunden werden. Die identifizierten Bereich kann bestätigt werden, um das Cytoplasma durch Betrachtung von der Seite. </li><li> Stecken Sie die Nadel in der Nähe der Eier. Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel auf die Chorion oder mit microforceps (Abbildung 3). Eine kleine Menge der Injektion Substanz sollte gesehen abfließen werden. </li><li> Punktion durch das Chorion an der Spitze der Nadel im Inneren des Chorion Platz. Passen Sie den Nachdruck der Einspritzdüse relativ hoch zu sein, um sicherzustellen, kein Rücklauf erfolgt aufgrund des hohen Drucks auf Punktion durch die harten Chorion (Einstellungen von 80-100hPA für Nachdruck und 500-700hPa für Einspritzdruck). </li><li> Legen Sie die Spitze der Nadel in das Zytoplasma durch stark Stossen ihrer Membran. Vermeiden Sie die Spitze der Nadel in den Dotter. Im Gegensatz zu Zebrafisch wird das Material in den Dotter injiziert nicht in das Zytoplasma übertragen werden. Eingespritzten Flüssigkeiten haben eine deutliche Grenze, wenn sie in den Dotter injiziert, während die Grenze verwischt ist, wenn in das Zytoplasma (Abbildung 4). Gelegentlich kann die Nadel verstopft durch Agarose / Schutt. Pinzetten können verwendet werden, um touch / rebreak Ende der Nadel, und entfernen Sie die Blockierung sein. Wenn die Nadel bricht zu irgendeinem Zeitpunkt während der Injektion wird sprudeln in den Embryo Medium gesehen werden und die Substanz, die Sie spritzen verloren. Die Injektionen sollten systematisch von oben nach unten entlang Agarose-Kanäle und von links nach rechts über die Form durchgeführt. </li><li> Injizierten Embryonen sollte auf eine saubere Schüssel mit Embryo-Medium übertragen und weiterentwickelt werden bei entsprechender Temperatur. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Breaking the Nadelspitze vor der Injektion. 1: Bewegen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Chorion des Embryos; 2: Tippen Sie auf das Chorion und bewegen Nadel hin und her sanft bis zur Spitze zu brechen; 3: Wenn eine kleine Menge der Injektion Stoffströme aus dem Ende der Nadel dies bestätigt Bruch der Spitze. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Repräsentative Bilder injiziert medaka Embryonen. Panel A zeigt ein repräsentatives Bild der richtigen Injektion von Rhodamin-Dextran in das Zytoplasma einer one-Zell-Stadium medaka Embryo. Panel B zeigt ein repräsentatives Bild der falschen Injektion von Rhodamin-Dextran in den Dottersack eines Ein-Zell-Stadium medaka Embryo. Panels C und D zeigen die Embryonen aus Platten A und B jeweils bei etwa 30 Stunden nach der Injektion. EM: Embryo wird vorderen nach oben in Platten C und D und zeigen Sie ist dorsal. Beachten Sie den Körper des Embryos in Panel D ist nicht rot, wie der Farbstoff wurde falsch in den Dottersack injiziert. Arrows in B und D zeigen, Rhodamin-Dextran injiziert fälschlicherweise in den Dottersack beachten Sie die unterschiedlichen kreisförmige Begrenzung. Die gestrichelten Linien in A und B Umriss des Zytoplasma einer Zelle anzuzeigen, ist eine Ansicht lateral.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir eine Methode für die Zell-Tracer, mRNA, DNA oder anti-sense-Oligonukleotid-Injektion in einem Zell-Stadium medaka Embryonen. Diese Technik hat uns erlaubt, verschiedene Entwicklungsprozesse Studie in-vivo in Echtzeit. Dieser Prozess und die anschließende detaillierte Analyse bietet es hat das Potenzial, deutlich verbessern unser Verständnis von Wirbeltieren Organogenese und die zugrunde liegenden Zellbiologie. Solches Wissen kann wichtig sein für die, und die Ausbeute therapeutische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

<table><tbody><tr><td>4&quot; feines Netz</td><td>Werkzeuge</td><td>J K Aquatics Ltd.</td><td>MD001</td><td>Dient zum Fangen von Fischen während der Eiergewinnung.</td></tr><tr><td>Embryomedium</td><td>Reagenz</td><td>selbst hergestellt</td><td></td><td>200 ml 50X-Stammlösung, 1 ml 1 % Methylenblau in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 Liter RO-Wasser (50X-Stammlösung: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; · 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/Liter RO-Wasser).</td></tr><tr><td>Feines wasserfestes Schleifpapier – Körnung p2000</td><td>Werkzeuge</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td></td><td>Sehr feine Körnung zum Rollen und Reinigen von Embryonen mit Chorion.</td></tr><tr><td>Borosilikat-Glaskapillaren</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10F</td><td>Zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Gerät</td><td>Narishige International</td><td>Modell PP-830</td><td>Zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Eppendorf-Mikrolader</td><td>Werkzeug</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Zum Befüllen von Mikroinjektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Mikroinjektionsapparatur</td><td>Gerät</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modell 5242.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Gerät</td><td>Narishige International</td><td></td><td>Modell MN151.</td></tr><tr><td>Agarose-Injektionsplatte</td><td>Werkzeuge</td><td>selbst hergestellt</td><td></td><td>Zum Halten von Embryonen während der Injektion.</td></tr></tbody></table>

mikroinjektion von medaka embryonen für die verwendung als modell genetic organism

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In diesem Video zeigen wir die Technik der Mikroinjektion in one-Zell-Stadium medaka Embryonen. Medaka ist eine kleine eierlegende Süßwasserfische, dass sowohl genetische und embryologische Analysen ermöglicht und ist eines der Wirbeltiere Modell-Organismen in die genomweite Phänotyp-driven Mutantenscreens out 1 durchgeführt wurden, wie im Zebrafisch und Maus. Divergenz der funktionellen Überlappung von Genen zwischen medaka und Zebrafisch ermöglicht die Identifizierung von neuen Phänotypen, die nicht identifizierbar sind in einer einzigen Spezies 2, also medaka und Zebrafisch sind komplementär für Genetische Analyse von Vertebratengenom Funktionen. Um die Vorteile von medaka Fische, deren Embryonen sind durchsichtig und entwickeln nach außen, ist die Mikroinjektion eine wesentliche Technik, um Zell-Tracer für die Markierung von Zellen, mRNAs oder anti-sense-Oligonukleotide injizieren zur Überexpression und Klopfen-down Gene von Interesse, und DNAs zur Herstellung von transgenen Linien.

Medaka und Zebrafisch sind für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen ergänzen. Dieses Protokoll werden die wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in medaka Embryonen eine wichtige Technik für embryologische und genetische Analyse mit medaka und Zebrafisch in einem Labor.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In diesem Video demonstrieren wir die Technik der Mikroinjektion in Medaka-Embryonen im Einzellstadium. Der Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasserfisch, der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion eines Gens oder Proteins durch Störung der normalen Expressionsmuster des Gens oder Proteins Ihrer Wahl zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Aros-Form und Injektionsnadeln hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, mittlere Embryonen im Einzelzellstadium zu sammeln.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Ein-Zell-Stadium-Embryonen in die korrekte Position für die Injektion auszurichten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Injektion von Zelltracern, mRNAs oder Antisense-Oligonukleotiden in Ein-Zell-Stadium-Midar-Embryonen. Letztendlich können Ergebnisse durch mikroskopische Beobachtung erzielt werden, die morphologische, physiologische oder molekulare Veränderungen zeigen, die mit dem von der injizierten Substanz beeinflussten Protein assoziiert sind.Hallo, ich bin Sean Brazinski aus dem Labor von Dr. Makoto Fki am Department für Biologie und Biochemie der University of Bath. Ich gehöre außerdem zum gesamten Seki-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Mikroinjektion von Meca-Embryonen mit Zellmarkern, mRNAs und Antisense-Oligonukleotiden.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktion eines Gens von Interesse in vivo auf Einzelzellniveau zu untersuchen. Beginnen wir also. Im Gegensatz zu Zebrafischen lassen sich bei Männchen und Weibchen von maka die Geschlechter leicht anhand ihrer dimorphen Flossen unterscheiden.Weibliche Flossen haben eine runde Form mit einem glatten Rand. Sowohl die After- als auch die Rückenflosse des Männchens sind größer als die der Weibchen, und die Rückenflosse weist eine tiefe Kerbe zwischen den letzten beiden Strahlen auf. Halten Sie ein Paarungspaar von Meca in einem Paarungsbecken mit oder ohne Wasserfluss.Dieses P kann bis zu zwei Monate lang in einem Behälter mit fließendem Wasser aufbewahrt werden. Für tägliche Injektionen legt ein Weibchen bis zu 40 Eier pro Tag, die durch Anheftungsfilamente am Bauch zusammenklumpen. Fangen Sie mit einem Netz ein Weibchen aus dem Behälter und halten Sie den Fisch mit einer Hand im Netz fest. Lösen Sie die Eier vorsichtig mit einem Zeigefinger. Bringen Sie das Weibchen zurück in den Behälter. Übertragen Sie die Eier mit einer Pinzette oder dem Zeigefinger in eine sechs Zentimeter große Petrischale, die mit Embryomedium gefüllt ist. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop mit zwei Paar Pinzetten die Befestigungsfilamente durch und lösen Sie die Eier voneinander.Entnehmen Sie die Embryonen mit einer Pasteurpipette, um sie von Kot und Algen zu trennen, und überführen Sie maximal 40 Eier in eine Schale mit frischem Embryonenmedium. Stellen Sie die Eier auf Eis, wenn sie unmittelbar mikroinjiziert werden sollen. Alternativ können Sie die Entwicklungsgeschwindigkeit in spätere Stadien durch Variationen der Inkubationstemperatur beeinflussen.Zur Herstellung von Agaroseplatten für die Aufbewahrung von Embryonen während der Injektion wird eine Plexiglasform benötigt. Weitere Einzelheiten finden Sie im schriftlichen Teil dieses Protokolls. Geben Sie 0,5 Zentimeter 1,5 % Agarose in Wasser in eine neun Zentimeter große Petrischale. Wenn das Agarose-Gerinnungsmittel erstarrt ist, schneiden Sie einen Bereich etwas kleiner als die Form aus, damit die Form nicht auf den Boden absinkt. Füllen Sie den ausgeschnittenen Bereich mit weiteren 1,5 % Agarose und legen Sie die Plexiglasform darauf. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, nachdem das Agarose-Gerinnungsmittel erstarrt ist.Lösen Sie die Form im Allgemeinen, um Rillen zu erzeugen. Bedecken Sie die Aris mit Embryonenmedium. Stellen Sie die Petrischale abgedeckt bei vier Grad Celsius bereit, bis sie verwendet wird.Stellen Sie eine starke, breite Injektionsnadel aus einem Glas-Kapillar bestehenden Filament her. Füllen Sie die Injektionsnadel mit einem Mikrolader rückwärts mit der Injektionslösung, einschließlich Phenolrot als Tracer, und verbinden Sie die Nadel mit einem Luftinjektorstand. Stellen Sie das Aufbau neben einem Stereomikroskop bereit.Überführen Sie Eier des geeigneten Entwicklungsstadiums auf die Injektionsplatte mit Aufstehrand. Die Embryonen können bis zu 30 Minuten auf Eis gehalten werden, um die Entwicklung anzuhalten, während die Injektion unter dem Stereomikroskop durchgeführt wird. Richten Sie mit einer Pinzette sieben bis zehn Eier in jeder Rille aus.Drehen Sie die Eier so, dass die Injektionsnadel senkrecht auf die Eier trifft. Die Einzelzelle des Embryos liegt der Delle mit den Öltröpfchen gegenüber. Daher sollte der Öltropfen nach links ausgerichtet sein, sodass sich die Einzelzelle rechts zur Injektion befindet.Bei der Meca werden Nukleinsäuren und Tracerfarbstoffe über die Chorionhaut in das Zytoplasma des Embryos und nicht in das Eigelb mikroinjiziert. Wie bei Zebrafischen bewegen Sie die Nadel nahe an die Eier heran. Berühren Sie die Nadelspitze mit der Chorionhaut oder verwenden Sie eine Mikrozange, um die Nadelspitze aufzubrechen, sodass eine kleine Menge der Injektionslösung aus dem Ende austritt.Bei Verstopfung die Nadel erneut brechen, das Corian durchstechen und die Spitze der Injektionsnadel gerade innerhalb der inneren Schicht positionieren, um das Risiko eines Rückflusses in die Nadel zu verringern. Stellen Sie den Halte­druck des Injektors scharf auf etwa 80 bis 100 Hektopascal ein. Stich durch die Membran und führen Sie die Nadel in das Zytoplasma ein.Injizieren Sie das Embryo. Betrachten Sie das Embryo von der Seite, um die gleichmäßige Verteilung des injizierten Materials im Cytoplasma zu überprüfen. Flüssigkeiten, die korrekt in das Cytoplasma injiziert wurden, weisen eine unscharfe Grenzfläche auf; Material, das zu tief in das Eiweiß injiziert wurde, hat eine deutliche Grenzfläche und wird nicht ins Cytoplasma übergehen.Überführen Sie die injizierten Embryonen in eine saubere Schale mit Embryomedium und lassen Sie sie je nach Anforderung in einem Inkubator mit geeigneter Temperatur entwickeln. Panel A zeigt ein repräsentatives Bild einer korrekten Injektion von Rumin-Dextran in das Zytoplasma eines Ein-Zell-Stadiums-Meca-Embryos. Panel B zeigt ein repräsentatives Bild einer fehlerhaften Injektion von Rumin-Dextran in den Dottersack eines Ein-Zell-Stadiums-Meca-Embryos. Gestrichelte Linien markieren den Umriss des Zytoplasmas einer Zelle.Die Panels C und D zeigen die Embryonen aus den Panels A bzw. B etwa 30 Stunden nach der Injektion. Beachten Sie, dass der Körper des Embryos im Panel D nicht rot ist, da die Farbstoffinjektion fälschlicherweise in den Dottersack erfolgte. Soeben haben wir Ihnen demonstriert, wie man Nukleinsäuren oder Tracer in das Ein-Zell-Stadium dunklerer Embryonen mikroinjiziert.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, korrekt entwicklungsgestufte Embryonen für eine erfolgreiche Injektion zu verwenden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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