Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

Hallo, ich bin Zaman. Ich bin Arturo Alvarez-Buylla. Wir befinden uns heute im Labor von Arturo, das Teil der Abteilung für Neurochirurgie und des Eli and Edythe Broad-Zentrums für Regenerationsmedizin und Stammzellforschung ist, und wir werden Ihnen zeigen, wie wir Präparationen der Wände der Seitenventrikel in Ganzpräparaten herstellen.

Diese Ganzpräparate können entweder fixiert für immunhistochemische Färbungen oder als lebende Präparationen zur Analyse des penilen Flusses verwendet werden. Die Ganzpräparat-Technik, die Mann Ihnen heute vorstellen wird, wurde im Laufe der Jahre im Labor entwickelt und verfeinert, um die gesamte Wand des Seitenventrikels einschließlich der penilen Zellen und der darunterliegenden Keimaktivität in der subventrikulären Zone, in der sich die neuronalen Stammzellen befinden, untersuchen zu können. Sie wurde ursprünglich von Fiona Dutch entwickelt und anschließend von HIE Victor und Casu Moto weiter verbessert.

Alle befinden sich nicht mehr im Labor. Die folgenden Diagramme veranschaulichen, wie eine Ganzpräparation der Seitenwand des Seitenventrikels hergestellt wird. Das Gehirn wird zunächst in zwei Hemisphären geteilt.

Ein sagittaler Schnitt wird posterior vorgenommen, um das Hippocampus freizulegen, dessen Querschnitt hier in Lila dargestellt ist. Die mediale Wand, die das Hippocampus bedeckt und in Lila gezeigt wird, wird anschließend von der lateralen Wand abgelöst, die das Stria-Ende bedeckt und in Rosa dargestellt ist. Die beiden Wände werden wie beim Öffnen eines Buches auseinandergeklappt, und die mediale Wand wird entfernt, sodass die laterale Wand freiliegt.

Der erste Abschnitt dieses Videos befasst sich mit der Ganzpräparat-Dissektion, dies muss jedoch nicht der erste Schritt sein. Wenn zeitlich eine Analyse des Liquorflusses geplant ist, beachten Sie bitte die schriftliche Anleitung für weitere Einzelheiten. Stellen Sie vor jeder Dissektion sicher, dass alle Instrumente steril und griffbereit sind. Stellen Sie eine sechs Zentimeter große Dissektionschale mit 37 Grad Celsius warmem L-15-Leitz-Medium unter ein fluoreszierendes stereoskopisches Dissektionsmikroskop und legen Sie ein frisch präpariertes Maushirn unter dem Stereomikroskop in die Schale.

Verwenden Sie die feinen Pinzetten, um die Riechkugeln zu dissezieren. Teilen Sie das Gehirn mit einem Stichmesser in seine beiden Hemisphären. Schneiden Sie koronal am hinteren Ende einer Hemisphäre.

Um das kordale Hippocampus und den Querschnitt freizulegen, führen Sie das Stichmesser in den kleinen ventrikulären Raum zwischen Kortex und Hippocampus ein und schneiden Sie, um den Kortex dort zu lösen, wo er dorsal mit dem Hippocampus verbunden ist. Schneiden Sie eine keilförmige Kortexpartie an der Ecke ab und verwenden Sie feine Pinzette, um sie langsam vom Hippocampus abzulösen. Setzen Sie das Abheben des Kortex fort, während dieser sich um die ventrale Kante des Hippocampus herumzieht.

Verwenden Sie ein Stichmesser, um den Hippocampus von den ventralen Teilen der Großhirnrinde zu lösen. Benutzen Sie das Messer und feine Pinzetten, um den Hippocampus vorsichtig von der Großhirnrinde wegzuziehen. Arbeiten Sie vorsichtig nach anterior, ohne die Wände der Ventrikel zu beschädigen.

Die beiden Wände sollten sich voneinander wegbewegen. Wie bei einem Buch mit einem Messer schneiden Sie die Teile der Hirnrinde ab, die über die Seitenwand hinausragen. Um diese Oberfläche besser sichtbar zu machen, da der Widerstand gegen die Retraktion zunimmt, müssen zwei zusätzliche Schnitte angelegt werden.

Eine dorsal, wo die mediale und laterale Wand zusammentreffen, und einen ähnlichen Schnitt ventral. Verwenden Sie kleine Stiche mit dem Stichmesser, um diese Schnitte anzulegen. Diese zusätzlichen Schnitte ermöglichen es, die mediale Wand stärker zurückzuziehen, um die Vorderseite des Ventrikels freizulegen.

Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Schatten die Grenze zwischen der medialen und der lateralen Wand erkennbar machen, wie ein Tal zwischen den beiden Wänden. Schneiden Sie mit dem Messer exakt entlang dieses Tals und entfernen Sie den Thalamus sowie jegliche überstehende Großhirnrinde.

Die Lochpräparate sollten sofort für eine Pulsstrom-Analyse verwendet werden. Wenn mehrere Lochpräparate zur Immunfärbung präpariert werden, können sie alle in einer Sitzung bearbeitet werden, sofern sie nach Fertigstellung in Fixansatz getaucht werden. Der nächste Abschnitt des Videos wird demonstrieren, wie Assays zur Untersuchung des Flüssigkeitsstroms, der von den Zilien ependymaler Zellen erzeugt wird, durchgeführt werden.

Mit fluoreszierenden Mikroperlen. Die frisch präparierte Lateralseitenwand-Präparation wird zunächst mit zwei Insektennadeln in der Präparierschale befestigt. Die Spitze einer Glas-Mikropipette, gefüllt mit fluoreszierenden Mikroperlen, wird dann auf die Oberfläche des Präparats abgesenkt, und die fluoreszierenden Perlen werden während der Zeitrafferaufnahme vorsichtig auf die Oberfläche aufgebracht.

Das Video zeichnet die Bewegung der Kügelchen für den Anfluss-Test auf. Eine Glas-Mikropipette sollte vor der Ganzpräparat-Dissektion wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben vorbereitet werden. Die fertige Pipette sollte ein gleichmäßiges, flaches Konusende und eine 45-Grad-Schleife mit einem Innendurchmesser von etwa 100 Mikrometern aufweisen.

Füllen Sie die Pipette durch Kapillarwirkung etwa zur Hälfte mit Mineralöl auf. Führen Sie einen mit Vakuumfett überzogenen Kolben in das hintere Ende der Pipette ein. Drücken Sie ihn dann hinein, um den Meniskus des Öls bis zur Pipettenspitze vorzuschieben.

Befestigen Sie die Pipette mit Kolben an einem Mikromanipulator auf einem verstellbaren Arm. Laden Sie die Pipette von vorne mit einer Lösung aus 50% fluoreszierenden Mikroperlen, 5% Glycerin und 45% Wasser. Präparieren Sie frisch eine Lochmontage, wie zuvor gezeigt, und übertragen Sie sie mit der Ventrikelseite nach oben in eine saubere Präparierschale, die mit 37 Grad Celsius gefüllt ist.

Leitz-Medium, fixieren Sie die Lochhalterung an der Präparierschale mit zwei Insektenstiften im Thalamus und im vorderen dorsalen Kortex. Platzieren Sie den Sockel des feststehenden Arms, der den Mikromanipulator hält, neben dem Stereomikroskop, wobei der Arm angehoben bleiben muss, um ein Abbrechen der Mikropipettenspitze zu vermeiden. Tauchen Sie die Spitze der Mikropipette in ein Gefäß mit Medium, um Mikroperlen von der Außenseite der Spitze zu entfernen.

Dabei vorsichtig sein, die Spitze nicht zu beschädigen. Die Spitze der Pipette über der dorsalen Oberfläche der Seitenwand positionieren und den Arm absenken, um die Pipettenspitze knapp über der Gewebeoberfläche zu platzieren. Ein Blickfeld fokussieren, das die vordere Hälfte der Lochhalterung umfasst, und mit der Aufnahme der gewünschten Bilder beginnen.

Drücken Sie mit dem Kolben etwa fünf Liter der Mikroperlen auf die Bohrungsmontagefläche. Sobald der anfängliche Perlenbolus durch einen Spülvorgang von der Oberfläche entfernt wurde, geben Sie mit dem Kolben zusätzliche Runden von jeweils fünf Nanolitern Mikroperlen ab. Strömung, Richtung und Geschwindigkeit können anhand des aufgezeichneten Videos analysiert werden.

Der letzte Abschnitt dieses Videos zeigt, wie die Präparate immungefärbt und auf Objektträger für die konfokale Bildgebung aufgebracht werden. Frisch präparierte Präparate werden zunächst in eine 24-Loch-Platte überführt und durch Einlegen in Paraformaldehyd fixiert. Anschließend folgen mehrere Inkubationen mit primären Antikörpern und danach mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, jeweils mit dazwischenliegenden Waschschritten.

Nach der Färbung werden die Ganzpräparate weiter unterteilt, um lediglich die dünne Schicht der Seitenwand, die die subventrikuläre Zone enthält, von dem Rest des Ganzpräparats, das das darunterliegende Stratum und den Kortex enthält, zu trennen. Dieses dünne, flache Gewebestück wird anschließend auf einen Objektträger übertragen und mit einem Deckglas bedeckt, um die Ganzpräparate für die Immunfärbung zu fixieren. Eine 24-Loch-Platte enthält 4 % Paraldehyd und 0,1 % Triton X-100 auf Eis.

Im chemischen Abzug das präparierte Lochpräparat mit der Ventrikelseite nach oben vorsichtig in eine Vertiefung der Platte eintauchen. Die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren, das Fixierungsmittel abpipettieren und das Lochpräparat mit einer Transferpipette vorsichtig dreimal je fünf Minuten in 1× PBS mit 0,1 % Triton X-100 waschen. Bei allen Flüssigkeitsmanipulationen stets vorsichtig an der Seite der Vertiefung pipettieren, um ein Umkippen des Lochpräparats und eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden.

Gebe eine Blockierungslösung, die Triton X und 10 % normales Ziegenserum in 1× PBS enthält, unter Verwendung von bis zu 2 % Triton X je nach erforderlicher Tiefe des Antikörpereindringens hinzu. Inkubieren Sie das gesamte Präparat eine Stunde lang in der Blockierungslösung. Entfernen Sie die Blockierungslösung bei Raumtemperatur.

Fügen Sie die in Blockierungslösung verdünnten primären Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für 24 oder 48 Stunden, abhängig vom Zielantigen. Waschen Sie mit zwei kurzen Spülgängen mit 1× PBS mit Triton X, gefolgt von drei Waschungen zu je 20 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie die in Blockierungslösung verdünnten sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für die gleiche Dauer wie bei den primären Antikörpern. Waschen Sie auf die gleiche Weise wie bei den primären Antikörpern. Die folgende Abfolge von Schritten zeigt, wie man lediglich die Seitenwand vom übrigen Präparat als einzelne flache Probe isolieren kann. Diese kann anschließend zur hochauflösenden Bildgebung eingebettet werden.

Bringen Sie die immunohistochemisch gefärbte Präparation mit der Ventrikelseite nach oben in eine saubere Petrischale mit einer XPBS-Lösung unter dem Stereomikroskop, wobei Sie sich von posterior nach anterior bewegen. Entfernen Sie mit einem Stichmesser den dorsalen Kortex und darunterliegendes weißes Corpus callosum, um die Grenzfläche zwischen der subventrikulären Zone und dem Striatum sichtbar zu machen. Führen Sie anschließend einen langen horizontalen Schnitt entlang der ventralen Seite der gesamten Präparation durch.

Verwenden Sie feine Pinzetten, um das Gewebe an dieser neuen flachen Kante so auszurichten, dass die dorsale Oberfläche nach oben zeigt. Die subventrikuläre Zone ist ein schmaler Streifen homogen rosa gefärbten Gewebes, während das Striatum von Strängen weißer Substanz durchzogen ist. Verwenden Sie die Pinzette wie zwei Stifte im Striatum, um das Gewebe zu fixieren, ohne die Ventrikelwand zu beschädigen.

Beginnend anterior. Verwenden Sie das Stichmesser, um vorsichtig zwischen Striatum und subventrikulärer Zone zu schneiden. Es ist wichtig, die Schnitte parallel zur ventrikulären Oberfläche zu führen und die Dicke des präparierten Gewebes beizubehalten.

Da die subventrikuläre Zone posterior dünner wird, entfernen Sie vorsichtig alle umgebenden Gewebe von den Lochpräparaten, die nicht Teil der Ventrikelwand sind. Das Lochpräparat sollte eine einheitliche Dicke zwischen 200 und 300 Mikrometern aufweisen.

Heben Sie mit einer Pinzette das Gewebestück von unten an und übertragen Sie es auf einen Objektträger. Geben Sie Eindeckmedium auf und legen Sie danach ein Deckglas auf. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschließen.

Bewahren Sie die Objektträger flach in einer Objektträgerkassette bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Tage auf, um die Deckgläser vor der Bildaufnahme zur Ruhe kommen zu lassen. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse für Whole-Mount-Immunfärbungen und Append-Flow-Assays. Das erste Bild zeigt eine Übersichtsaufnahme einer Whole-Mount-Färbung für Doublecortin, einem Marker für Neuroblasten, die das Netzwerk aus Ketten wandernder junger Neuronen in der adulten subventrikulären Zone veranschaulicht.

Als Nächstes folgt eine weitere Niedrigvergrößerungsaufnahme einer Präparation, die für KI-67 in Grün und Blutgefäße in Rot gefärbt wurde und die kürzlich beschriebene enge Wechselwirkung zwischen teilenden Zellen und dem Gefäßsystem in der subventrikulären Zone bei höherer Vergrößerung veranschaulicht. Das nächste Bild zeigt eine konfokale Aufnahme der ventrikulären Oberfläche, wobei die apikale Oberfläche der das Ventrikel auskleidenden Zellen durch Beta-Catenin-Färbung in Grün hervorgehoben ist und die Basalkörper dieser Zellen durch Gamma-Tubulin in Rot markiert sind. Die letzte Aufnahme mit hoher Vergrößerung ist eine maximale Projektion eines konfokalen Stacks, aufgenommen aus einer Ganzpräparat-Färbung für GFAP, die die langen, GFAP-positiven basalen Fortsätze von S-vz-Typ-B1-Zellen zeigt, um den Liquorfluss, dessen Richtung und Geschwindigkeit an der ventrikulären Oberfläche zu analysieren.

Aufeinanderfolgende Einzelbilder aus Anhängsel-Bewegungsfilmen können zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammengefügt werden. Diese zusammengesetzten Bilder zeigen die Position einzelner Kügelchen zu verschiedenen Zeitpunkten an, während sie das Anhängsel oder die Oberfläche durchqueren. Hier ist ein Beispiel dafür, wie die Ergebnisse am Ende aussehen.

Sie haben gerade gesehen, wie man Ganzpräparate aus der subventrikulären Zone der Seitenwand des Seitenventrikels herstellt. Dies ermöglicht eine Gesamtsicht der gesamten Wand und hat im Laufe der Jahre viele Entdeckungen ermöglicht, darunter die Beobachtung, dass diese ventrikuläre Region als Netzwerk von Wegen für die Kettenwanderung organisiert ist. Es erlaubte uns außerdem, zu untersuchen, wie diese Liquorströmung über diese Wand verläuft, und deutete indirekt auch Wege an, auf denen diese Zellen ihre Migration durch dieses sehr ausgedehnte Netzwerk von Wegen steuern.

In jüngerer Zeit hat uns diese Technik ermöglicht zu entdecken, dass die subventrikuläre Zone sternförmig wie eine Anordnung von Pinwheels organisiert ist, wobei sich die Stammzellen im Kern dieser Pinwheels befinden und so das optische Ende der Stammzellen innerhalb dieser Struktur offenbaren. Da die Ganzpräparat-Darstellung eine umfassende Perspektive dieser ventrikulären Zone ermöglicht, bietet sie einen Überblick, den Schnittpräparate nicht liefern können. Aus diesem Grund stellen wir sie allen zur Verfügung, da sie für viele weitere Studien nützlich sein sollte. Es gibt einige wichtige Punkte, die beim Vorbereiten von Ganzpräparaten beachtet werden sollten, um die Präparationen zu verbessern.

Die erste Methode besteht darin, eine geeignete Beleuchtung einzustellen, sodass Schatten auf der Bohrung sichtbar werden. Dadurch entsteht ein Kontrast, der zeigt, an welchen Stellen geschnitten werden muss. Die zweite Methode besteht darin, die Pinzette als zwei bewegliche Stifte zu verwenden.

Sie sollten die Pinzette nicht verwenden, um das Gewebe zu quetschen oder anzuheben. Nutzen Sie sie vielmehr wie zwei bewegliche Stifte, die das Gewebe fixieren, während Sie schneiden. Der dritte Punkt besteht darin, eine Kombination aus allgemeiner Retraktion und Schneiden anzuwenden.

Wie Sie bei den Präparationen bemerken werden, wird tatsächlich sehr wenig Gewebe geschnitten. Der größte Teil der Präparation erfolgt durch allgemeine Retraktion während der zweiten Runde der Präparation, wenn Sie die Seitenwand vom Rest des Ganzpräparats ablösen.

Das Wichtigste ist, die Schnitte in einer Ebene auszurichten, die parallel zur Ebene der ventrikulären Oberfläche liegt. Dadurch gewährleisten Sie eine einheitliche Dicke von anterior nach posterior entlang der Seitenwand. Außerdem ist sichergestellt, dass bei der konfokalen hochauflösenden Bildgebung alle Bilder in einer einzigen Ebene scharf abgebildet werden.

Wir hoffen, dass dieses Video für Ihre Studien hilfreich sein wird. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.