Name: Direkte Instillation von gelösten Stoffen in Mauslunge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Lernen Sie die intratracheale Instillation in Mäusen für die Atemwegsforschung. Diese Methode ermöglicht die gezielte Verabreichung von Substanzen in die Alveolen und unterstützt Studien zur Lungenfunktion.

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Diese Arbeit wurde vom NIH K99 HL09222601 und der S &amp; R Foundation Ryaji Uneo Award ausgezeichnet zu MNH unterstützt.

1. Anästhesie <ol><li> Betäubende Mäuse mit Isofluran kann die Behandlung der Tiere und Zurückhaltung vor Erleichterung auf die Verwaltung Anästhesie intraperitaneally. Mit einem inhalativen Narkosemittel kann oder auch nicht geeignet für eine bestimmte Studie: bestimmen zunächst die Auswirkungen der Verwendung von Isofluran oder andere Betäubungsmittel, über die vorgeschlagenen Lunge zu studieren. </li><li> Anesthetize Tiere mit Isofluran. Das Video zeigt den Einsatz eines Isofluran Verdampferkammer bei 2% Isofluran-Set mit Sauerstoff gemischt. Wenn Sie noch kein Isofluran Kammer, können Sie alternativ mit Standard-Open-drop Exposition Techniken. Legen Ratten in einer Glasglocke (oder einem anderen geeigneten nicht-porösen Behälter) mit einem Drahtgeflecht versehen auf den Boden. Um eine Gaze unter dem Drahtgeflecht gelegt, gelten eine Mischung aus 30% v / v Isofluran in Propylenglykol. Die Nutzung des Netzes sorgt dafür, dass das Tier nicht in Kontakt mit der Isofluran-getränkten Pad, die Hautreizungen und mögliche Überdosierung führen kann kommen. Nach einer kurzen Exposition gegenüber Isofluran, sollte das Tier betäubt werden und nicht mit einem aufrichtenden Reflex reagieren, wenn das Glas gekippt und werden nicht nach toe Prise reagieren. </li><li> Weitere sedate Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von Xylazin und Ketamin. (Es ist gute Praxis bei der Durchführung intraperitoneale Injektionen zurück zu ziehen, um sicherzustellen, dass Teile des Darms oder andere lebenswichtige Organe wurden nicht vorgedrungen). Mix 150 ul Xylazin (100 mg / ml) mit 1000 ul Ketamin (100 mg / mL) in 8850 ul von 0,9% steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Bei Mäusen, die Dosierung ca. 80 mL pro 10 g Körpergewicht werden. Die Endkonzentrationen werden 10 mg / Kg Xylazin und 100 mg / kg Ketamin werden. Die Tiere sollten trocken gehalten werden und isoliert, um dem übermäßigen Verlust von Körperwärme zu verhindern. Augensalbe kann die Augen aufgetragen werden, um zu verhindern Austrocknen der Hornhaut. </li></ol> 2. Vorbereitung der OP-Bereich <ol><li> Rasieren der Gegend, wo die chirurgische Einschnitt gemacht werden verhindert die Kontamination von nicht-prepped Bereichen. Ein elektrischer Rasierer kann eng rasiert das Fell vom Tier. Die rasierten Bereich sollte größer sein als der Schnitt vor Ort. </li><li> Nachfolgende Anwendung von Enthaarungscreme, wie Nair, entfernt alle übrigen Fell. Tragen Sie eine dicke Schicht von Enthaarungscreme, die OP-Bereich und lassen Sie für 3 Minuten. Wischen Sie das Fell und Enthaarungscreme mit einem feuchten Handtuch. Lassen Sie die Enthaarungscreme auf mehr als 10 Minuten. </li><li> Verwenden Sie 70% Alkohol, oder eine alternative Lösung schrubben, aseptisch vorbereiten OP-Bereich. </li></ol> 3. Surgical Procedure <ol><li> Positionieren Sie den narkotisierten Tier auf einer geneigten chirurgischen Bord, oder abgewinkelt einstweilige stehen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe der Vorderseite des Halses (Hals-Region). </li><li> Dissect weg das Platysma und der vorderen Tracheal-Muskeln, um sichtbar zu machen und den Zugang der Trachealringe. </li><li> Typischerweise sind intratracheale Injektionsvolumina 3 ul pro Gramm Gewicht (ca. 30-75 ul Endvolumen). Verwalten der entsprechenden Menge instillate mit einer 1 ml subkutan (sub-Q)-Spritze mit einer 30-Gauge, 5/16-Zoll- Nadel. Halten Sie die Spritze Schräge nach oben und parallel mit der Luftröhre, und injizieren das volle Volumen von instillate in die Luftröhre. </li><li> Das Tier kann durch keuchend nach der Instillation des gelösten Stoffes in die Lunge zu reagieren. Einleiten von Luft durch die Spritze und beobachtet, ob die Lunge zu erweitern wird auch bestätigen den erfolgreichen Intubation Techniken. </li><li> Entfernen Sie die Spritze aus der Luftröhre. </li></ol> 4. Nahtmaterial. <ol><li> Fassen Sie die Nadel swage (dickste Teil der Nadel, wo das Nahtmaterial befestigt ist) mit einem Nadelhalter. </li><li> In die Haut eindringen, wobei die Spitze der Nadel in einem Winkel von 90 ° etwa 1-3 mm vom Rand der Wunde, je nach der Dicke der Haut. Fassen Sie das austretende Nadel nach einem Durchgang durch das Gewebe. Einfache Stiche, einzeln geknotet, effizient in der Nähe der Wunde. </li></ol> 5. Tierische Wiederherstellung <ol><li> Die Tiere sollten vollständig aus der Narkose und Operation nach 3-24 Stunden zu erholen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Intratracheale Instillation von fluoreszierenden Verbindung, Cy5.5 konjugiert Dextran, zeigt erfolgreiche Instillation fluoreszierende Verbindung in B6 Maus Lunge (Abbildung 1). Der fluoreszierende Farbstoff wird in erster Linie die Lunge gezielt und gleichmäßig verteilt wird. Fluoreszenzsignal im Magen-Darm-Trakt unmittelbar nach dem Verfahren zeigt, dass die Speiseröhre unbeabsichtigt war während des Verfahrens (Abbildung 2) intubiert. Die Ermittler können auch überprüfen, gezielte Verabreichung von Verbindungen in die Lunge, und überprüfen Verteilung der instillate nach dem Verfahren durch Aufblasen der Lunge und der Vorbereitung Lungengewebe Scheiben (2, 3) oder feste histologischen Proben. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Fluorescent Cy5.5 Signal mit X-ray Bild in erfolgreich eingeflößt Mauslunge co-registriert. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (bei einer Konzentration von 10 ug / ul) wurde in die Luftröhre des B6 Mauslunge eingeflößt. Cy5.5 Signal wurde mit einem 675 nm Anregungs-Filter und einem 695 nm-Emission-Filter. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Co-Registrierung von Fluoreszenz-Signal mit X-ray-Overlay in schlecht eingeflößt Maus gezeigt. Unangemessene Intubation des Ösophagus während der Instillation Protokoll Ergebnisse in Cy5.5 Lieferung an den Darm.

<ol><li>Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).</li>
<li>Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+epithelial+sodium+channels+examined+in+alveolar+type+1+and+2+cells+patch-clamped+in+lung+slice+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue.</a> J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).</li>
<li>Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activates+amiloride-sensitive+sodium+channels+in+alveolar+type+I+cells+in+lung+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).</li>
<li>Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+extracellular+cysteine%2Fcystine+redox+state+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).</li>
<li>Li, T., Folkesson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+alpha-ENaC+inhibits+rat+lung+fluid+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).</li>
<li>Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+disperse+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+investigation+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicol%22%5BJournal%5D)">An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity.</a> Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).</li>
<li>Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+senescence-accelerated+mouse+model+in+bleomycin-induced+lung+injury+suggests+that+bone+marrow-derived+cells+can+alter+the+outcome+of+lung+injury+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).</li>
<li>Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intratracheal+instillation+of+budesonide+using+surfactant+as+a+vehicle+to+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study.</a> Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).</li>
</ol>

Intratracheale Instillationen in mehreren verschiedenen Studien wurden verwendet, um die Toxizität von Testsubstanzen (6) zu bewerten, zu induzieren alveolären Lungenschädigung (4, 7), ersetzen Tenside (8), sowie alter Genexpression über Lieferung von kleinen Oligonukleotide direkt in die Lunge (5). Wir prüfen derzeit den Einsatz von Einträufeln 1) fluoreszierenden Redox-sensitive Material in die Lunge, um oxidativen Stress in vivo Messung unter normalen und pathophysiologischen Bedingungen, sowie 2) einzuflößen fluores...

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-220-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td>New Animal Drug Application #139-236</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-001-10</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td></td><td></td><td>In Drogerien erhältlich</td></tr><tr><td>1-mL-SubQ-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td>26 5/8 G</td></tr><tr><td>4-0-Nylon-Nahtmaterial</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1894G.S30</td><td></td></tr></tbody></table>

direkte instillation von gelösten stoffen in mauslunge

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheale Instillationen liefern Solute direkt in die Lunge. Dieses Verfahren zielt auf die Lieferung der instillate in den distalen Regionen der Lunge, und wird daher oft in Studien am Studium Alveolen gerichtet eingebaut. Wir bieten Ihnen eine detaillierte Überleben Protokoll für die Durchführung intratracheale Instillationen in Mäusen. Mit diesem Ansatz kann eine Lieferung von Test-Solute oder festen Stoffen (wie Lungen-Therapeutika, Tenside, Viren und kleine Oligonukleotide) in den distalen Lunge Ziel. Tracheal Instillationen kann die bevorzugte Methode sein, über Inhalation Protokolle, die in erster Linie an der oberen Atemwege und möglicherweise aussetzen Ermittler potentiell gefährlicher Stoffe. Zusätzlich bei der Verwendung der Instillation Protokoll, können Tiere in vollem Umfang aus dem nicht-invasive Verfahren zu erholen. Dies ermöglicht für die Herstellung anschließenden physiologischen Messungen an Versuchstieren oder Neuinstallation mit dem gleichen Tier. Die Höhe der instillate in die Lunge eingeführt sorgfältig bestimmt werden und osmotisch ausbalanciert, um Tier-Erholung zu gewährleisten. In der Regel können 30-75 ul instillate Volumen in Mauslunge eingeführt werden.

Intratracheale Instillationen liefern Solute direkt in die Lunge. Dieses Verfahren zielt auf die Lieferung der instillate in den distalen Regionen der Lunge, und wird daher oft in Studien am Studium Alveolen gerichtet eingebaut. Wir bieten Ihnen eine detaillierte Überleben Protokoll für die Durchführung intratracheale Instillationen in Mäusen.

Direkte Instillation von gelösten Stoffen in Mauslunge

Intratracheale Instillationen bringen gelöste Stoffe direkt in die Lunge ein. Dieses Verfahren zielt darauf ab, das Instillat in die distalen Regionen der ...

Bei diesem Verfahren können Lösungsmittel direkt in die Lunge eingeleitet werden. Zuerst die Trachea freilegen. Das Fell des kleinen Nagetiers entfernen und einen kleinen Schnitt in der Nähe der vorderen Halsregion anlegen.Legen Sie die Luftröhre frei. Verwenden Sie eine subkutane Ein-Milliliter-Nadel, um drei Mikroliter Lösung pro Gramm Körpergewicht über die Luftröhre zu verabreichen. Entfernen Sie die Spritze und nähen Sie die Wunde.Hallo, ich bin Dr. Ma Helms aus der Abteilung für Physiologie an der Emory University. Hallo, ich bin Dr. Mauricio Rojas aus der Abteilung für Medizin hier an der Emory University. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zeigen, um Lösungen direkt in die distalen Abschnitte des Lungengewebes einzubringen.Wir verwenden dieses Verfahren in meinem Labor routinemäßig, um die Flüssigkeitsklarage in der Lunge als Reaktion auf verschiedene applizierte Verbindungen zu untersuchen, und nutzen diese Technik in meinem Labor zur Verabreichung von bli. Erzeugung eines männlichen Mausmodells einer Lungenverletzung. Die direkte Applikation von gelösten Substanzen in die Lungen kleiner Nagetiere könnte für Ihre Studien nützlich sein.Beginnen wir nun. Zur Vorbereitung auf die Operation wird die Maus zunächst mit Isofluran anästhesiert und anschließend durch eine intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus Xylazin und Ketamin weiter sediert. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um zu bestätigen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist.Verwenden Sie anschließend einen Elektrorasierer, um das Fell vom Operationsbereich abzurasieren. Um verbleibende Haare zu entfernen, tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf den Operationsbereich auf. Lassen Sie die Enthaarungscreme drei Minuten lang einwirken und wischen Sie dann das Fell und die Creme mit einem feuchten Tuch ab.Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 70 % Alkohol, gefolgt von Betadine-Operationsscrub. Um das Tier aseptisch vorzubereiten. Das Tier ist nun bereit für die Operation.Um mit dem Verfahren für eine intratracheale Applikation zu beginnen, positionieren Sie das anästhetisierte Tier auf einer geneigten Operationsplatte. Führen Sie einen kleinen Schnitt im vorderen Bereich des Halses oder der Kehlregion durch. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Plattenmuskel zurückzuschieben, und führen Sie anschließend einen Schnitt in die vorderen Trachealmuskeln ein.Dadurch können Sie die Trachealringe visualisieren und erreichen. Sobald die Trachea freigelegt ist, verabreichen Sie die entsprechende Menge Installat mit einer einmilliliterigen subkutanen Nadel und Spritze. Halten Sie die Spritze mit der Schräge nach oben und parallel zur Trachea ausgerichtet und injizieren Sie das gesamte Volumen des Installats in die Trachea.Ein typisches Injektionsvolumen für eine intratracheale Applikation beträgt drei Mikroliter pro Gramm Körpergewicht. Entfernen Sie die Spritze aus der Luftröhre. Das Tier kann mit einem Keuchen reagieren, nachdem die Lösung in die Lungen appliziert wurde.Die Einführung von Luft über die Spritze und die Beobachtung, ob sich die Lungen ausdehnen, bestätigt ebenfalls, dass die Intubation erfolgreich war. Verschließen Sie den Schnitt mit vier Nähfäden aus Nylon 4-0. Greifen Sie die Nadel, fassen Sie die dickste Stelle der Nadel, an der das Nahtmaterial befestigt ist, mit einer Nadelhalterzange, und durchstechen Sie die Haut mit der Nadelspitze in einem Winkel von 90 Grad, etwa ein bis drei Millimeter vom Wundrand entfernt.Abhängig von der Dicke der Haut die austretende Nadel nach einem Durchgang durch das Gewebe greifen. Einfache Einzelknopfnähte verschließen die hier gezeigte Wunde effizient. Dargestellt sind einige repräsentative Ergebnisse von intratrachealen Applikationen. Dieses erste Bild zeigt eine erfolgreiche Applikation einer fluoreszierenden Verbindung, Sci-Fi 0,5 konjugiert mit Dextrin, in der Lunge einer Black-Six-Maus.Die Ko-Registrierung des SCI-5,5-Signals mit dem Röntgenbild bestätigt, dass der fluoreszierende Farbstoff hauptsächlich auf die Lunge ausgerichtet ist und unmittelbar nach der Applikation gleichmäßig verteilt wird. Im Gegensatz dazu zeigt dieses zweite Bild das Ergebnis bei einer schlecht applizierten Maus. Das unmittelbar nach dem Eingriff im Magen-Darm-Trakt sichtbare fluoreszierende Signal weist darauf hin, dass während des Verfahrens versehentlich die Speiseröhre intubiert wurde.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Lösungen direkt in die distalen Abschnitte der Lunge einbringt. Wenn Sie dies oder ein anderes Verfahren durchführen, ist es wichtig, die Richtlinien Ihrer Institution für die Verwendung von Tieren in der Forschung zu befolgen. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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