Name: Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Erfahren Sie die DNA-Extraktion aus Darmmikroben der Termite Zootermopsis angusticollis für mikrobielle Ökologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften im Hinterdarm.

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Zusammenfassung des Verfahrens für die Termiten ganzen Darm DNA-Extraktion: <ol><li> Gefühlt Termiten auf Eis zu entfernen gut mit einer sterilen Pinzette und stabilisieren gut Proben in Puffer. </li><li> Homogenisieren Proben in PVPP / SDS / Phenol-Puffer. </li><li> Extrahieren und zu reinigen DNA aus Rohlysat mit Qiagen DNeasy Spalten. </li></ol> Protokoll: <ol><li> Auf Eis, entfernen Sie die Eingeweide aus Arbeiter Kaste Termiten mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Sofort überweisen Sie den Mut und die Inhalte in einen sterilen, Nuklease-freies Röhrchen mit 50 uL eiskaltem 1x Molekularbiologie TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze-Proben bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt mit der Homogenisierung. </li><li> Übertragen Sie die gut Proben und Puffer, um eine sterile, Nuklease-freies 2 ml Schraube Röhrchen vorinstalliert mit 500 mg sterile Zirkonoxid / Silica-Kugeln (0,1 mm) und 700 ul 1x TE-Puffer mit 1% w / v Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ). </li><li> Dann werden 50 ul 20% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 500 ul Phenol zu den Proben. </li><li> Homogenisieren (bead beat) auf die höchste Einstellung mit drei Zyklen von 30 sec homogenisiert und 30 sec von Kühlen auf Eis. </li><li> Sediment unlösliches Material für 1 min bei 8.000 x g. </li><li> Purify 300-ul Aliquots der wässrigen (oberste) Schicht mit Qiagen DNeasy Spalten mit der Methode für Rohlysat Reinigung beschrieben. </li><li> Quantify Nukleinsäure Inhalt und frieren die Proben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

Nach unserer Erfahrung ist die DNA aus der mikrobiellen Lebensgemeinschaften von Holz-Fütterung Termitenart wie Zootermopis nevadensis extrahiert rein genug für die PCR-Vorlage nach einer Runde der Extraktion und Reinigung. Jedoch können einige Termiten, wie Wurf-Fütterung und Boden-Fütterung Arten haben eine höhere Konzentration an Huminsäuren in ihren Darminhalt und kann zusätzliche Reinigung des Darms mikrobielle DNA erfordern. Die gesamte DNA-Ausbeute aus dem Bauch von 5 Z. nevadensis Arbeiter liegt im Bereich von 10-30 pg. Für Termiten...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/Phenol</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>Homogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Wird gemäß dem Protokoll zur Isolierung genomischer DNA aus rohen Lysaten verwendet (Anhang H, Produktanleitung Version: Juli 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1x-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) aus 100x-Konzentrat hergestellt</td></tr><tr><td>Zirkonia/Silica-Perlen</td><td>Zubehör</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0,1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1 % (w/v) Polyvinylpolypyrrolidon, hergestellt aus trockenem Reagenz als 1x-Suspension in TE-Puffer</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Termiten</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>Natriumdodecylsulfat 20 %ige Lösung in Wasser, hergestellt aus trockenem Reagenz</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>TE-gesättigt, ~73 %</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Gerät</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>gepufferte Salzlösung, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>Zusammensetzung pro Liter: 2,5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl und 10 mL einer 1 M Lösung von NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Ausgestattet mit 40x-Objektiv, 1,6x-Optivar und 10x-Augenlinsen. Die Proben wurden im Phasenkontrastverfahren betrachtet</td></tr></tbody></table>

extrahieren von dna aus dem gut mikroben der termite (zootermopsis angusticollis) und visualisieren gut mikroben

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termiten gehören zu den wenigen Tieren bekannt, dass die Fähigkeit, allein bestehen durch den Verzehr von Holz haben. Die Termitendarm Trakt enthält eine dichte und artenreiche mikrobiellen Population, die in den Abbau von Lignocellulose unterstützt überwiegend in Acetat, der Schlüssel Nährstoff Betankung Termiten Stoffwechsel (Odelson &amp; Breznak, 1983). Innerhalb dieser mikrobiellen Populationen sind Bakterien, methanogenen Archaea und in einigen (&quot;lower&quot;) Termiten, Protozoen eukaryotische. So werden Termiten ausgezeichnete Versuchspersonen für die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroben-Spezies und den zahlreichen biochemischen Funktionen, die sie durchführen, um den Nutzen ihrer Gastgeber. Die Artenzusammensetzung der mikrobiellen Populationen in Termiten guts sowie wichtige Gene in verschiedenen biochemischen Prozessen beteiligt wurde erforscht mit Hilfe molekularer Techniken (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Diese Techniken sind abhängig von der Extraktion und Reinigung von hochwertigen Nukleinsäuren aus der Termitendarm Umwelt. Die Extraktion Technik in diesem Video beschrieben wird, eine modifizierte Zusammenstellung von Protokollen für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Umweltproben (Mor et al, 1994 entwickelt;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) und sie produziert DNA von Termiten Enddarm Material für die Verwendung als Vorlage für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).

Dieses Video zeigt die Technik zur Gewinnung von DNA aus den Arten von Mikroben mit Wohnsitz in der Termite Enddarm. Die Herstellung eines Nasspräparat Rutsche, die nützlich für die Visualisierung der gut mikrobiellen Gemeinschaft ist, ist auch dargestellt, und eine Tour durch die artenreiche gut Umfeld gegeben ist.

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Termiten gehören zu den wenigen Tieren, von denen bekannt ist, dass sie die Fähigkeit besitzen, ausschließlich durch den Verzehr von Holz zu überleben. Der Termitendarm enthält eine dichte und ...

Hier ist Ihre Reaktion auf diese Umgebung nicht einzigartig. Die meisten Menschen, sogar Nicht-Wissenschaftler, sind ziemlich beeindruckt. Ja. Von der Vielfalt und Komplexität.Hallo, mein Name ist Eric Matson und ich bin Postdoktorand in der Abteilung für Umwelt- und Ingenieurwissenschaften am California Institute of Technology. Meine Arbeit unter der Leitung von Professor Jared Ledbetter konzentriert sich auf die mikrobiellen Wechselwirkungen und die Artenvielfalt von Organismen, die im hinteren Darm des Termiten leben. Insbesondere interessieren wir uns für einige der ablaufenden biochemischen Stoffwechselwege und beschäftigen uns vor allem mit dem Prozess der Acetogenese, bei dem diese Mikroben Wasserstoff und CO2 verbrauchen und in Acetat umwandeln, ein zentraler Nährstoff für den Energiestoffwechsel des Termitenwirts.Ich und andere Mitarbeiter im Labor haben gezielte Primer-Sets entwickelt, um wichtige Enzyme in diesem Stoffwechselweg untersuchen zu können. Dazu ist es jedoch erforderlich, saubere DNA-Proben der mikrobiellen Gemeinschaft zu gewinnen, die als Zielsequenzen für diesen Prozess verwendet werden können. Heute möchte ich daher demonstrieren, wie wir die betreffende Termitenart präparieren, die DNA aus dem Hinterdarm extrahieren, sie reinigen und für spätere Untersuchungen aufbewahren.Heute werden wir uns insbesondere auf eine Termitenart konzentrieren, die Zoopsia nevadensis genannt wird. Dabei handelt es sich um eine kalifornische Feuchtholztermitenart, die hier lokal gesammelt wurde und eine ziemlich große Art ist, was die Durchführung von Präparationen und Extraktionen ziemlich einfach macht. Gut, heute habe ich bereits einige der Materialien vorbereitet, die wir für das Verfahren benötigen.Eines der ersten Dinge, die wir benötigen, ist eine bestimmte Menge Eis, um die Insekten abzukühlen, die wir präparieren werden. Ich habe außerdem etwas TE-Puffer vorgekühlt, der eine Verbindung enthält, die dazu beiträgt, die DNA zu stabilisieren, sobald sie aus den Zellen freigesetzt wird. Ich habe sterile Gefäße vorbereitet, die mit Zirkon-Zirkonia-Silikat-Perlen befüllt sind.Dies sind 0,1 Millimeter große Kügelchen, von denen sich hier etwa ein halbes Gramm befinden. Dies ist der mechanische Scherprozess, den wir durchführen werden. Außerdem habe ich einige Reagenzien, die an dem Lysier- und Reinigungsverfahren beteiligt sind.Hier habe ich eine Flasche mit 1 % Polyvinyl PolyOne oder PVPP im Puffer. Das PVPP ist wichtig, um Huminsäuren aus den DNA-Präparationen zu entfernen, die unsere PCR-Analyse der Ergebnisse hemmen können. Außerdem habe ich etwas Natrium-ECCO-Sulfat, ein Tensid, das wir zur Unterstützung der Extraktion und zur Zerstörung der Zellen verwenden.Und dann benötigen wir zur Dissektion der Termiten lediglich einige sterile Pinzetten. Diese haben ziemlich feine Spitzen und werden verwendet, um die Darmtrakte herauszunehmen. Schließlich haben wir zur mechanischen Scherung hier ein Beating-Gerät, das mit sehr hohen Umdrehungen pro Minute rotiert und zusammen mit den Zirkonia-Silikat-Perlen die mechanische Zerstörung der Zellen bewirkt.Nachdem wir die Termiten im Feld gesammelt haben, bringen wir sie hier ins Labor zurück. Die meisten kalifornischen Feuchtholztermiten, mit denen wir arbeiten, sind sehr anfällig für Austrocknung. Eine der Verbesserungen, die wir in diesem Labor vorgenommen haben, besteht daher darin, feuchtigkeitskontrollierte Kammern zu verwenden, wie diese 10-Gallonen-Aquarien.Hier sammeln wir die einzelnen Kolonien und halten sie in diesen Feldern getrennt. An der Unterseite des Behälters befinden sich im Wesentlichen Behälter mit unterschiedlichen Salzlösungen. Dieser enthält eine Kaliumphosphatlösung, die die relative Luftfeuchtigkeit bei etwa 95 bis 96 % hält, was ideal ist.Und unter diesen Bedingungen haben wir tatsächlich die Zucht von Termiten in Gefangenschaft erreicht, obwohl wir, wenn wir ein Experiment durchführen möchten, frische Tiere aus dem Feld sammeln. In dieser Box hier können Sie jedoch etwas von dem Holz sehen, von dem sie sich ernähren. Dies ist einfach Ponderosa- oder Jeffrey-Kiefer, das wir an der Stelle sammeln, an der sich das Termitennest befindet.Es gibt eine Reihe verschiedener Termitenkasten, darunter die männlichen und weiblichen Fortpflanzungsindividuen. Der größte Teil der Kolonie besteht aus Arbeitertermiten, es gibt jedoch auch eine Anzahl von Soldatenkasten. Interessanterweise verfügen die Soldaten über Mundwerkzeuge (Mandibeln), die zur Verteidigung der Kolonie und nicht zum Fressen von Holz ausgelegt sind.Sie sind daher ebenfalls auf die Arbeitertermiten angewiesen, um sich ernähren zu lassen. Wie Sie in dieser Box sehen können, befinden sich dort sowohl Arbeiter- und Soldatentermiten als auch einige Jungtiere, die kürzlich aus Eiern geschlüpft sind – zumindest hier in Gefangenschaft.Ich habe also fünf Arbeitertermiten aus der Gruppe ausgewählt, die ich Ihnen gerade gezeigt habe. Zunächst habe ich sie hier auf Eis abgekühlt. Um die Dissektion vorzubereiten, werde ich diese Pinzette verwenden und mithilfe eines Stereomikroskops arbeiten. Hoffentlich können Sie das große Darmvolumen erkennen, das wir von jedem dieser Individuen entfernen werden.Drehen Sie die Termite einfach auf den Rücken und halten Sie mit einer Pinzette das Kopfende fest, während Sie mit der anderen nur leicht zudrücken – und zwar genau an der Spitze des Abdomens hier. Mit einer einzigen Bewegung sollte sich der Darmtrakt vom Organismus lösen. In Ordnung.Und Sie können das große Volumen sehen, das ungefähr 30–40 % des Gewichts des Insekts ausmacht und tatsächlich in diesem Bereich enthalten ist. Und Sie können erkennen, dass es in mehrere Abschnitte unterteilt ist. Wir haben den Vorderdarm und dann den Mitteldarm sowie diesen Hinterdarmabschnitt, der eine sehr große Kammer darstellt und die Mehrheit der mikrobiellen Gemeinschaft enthält, die die Fermentationen durchführt.Hier habe ich die Eingeweide von fünf Arbeitertermiten entfernt. Der nächste Schritt besteht nun darin, die Nukleinsäuren, die in der hier enthaltenen Gemeinschaft vorhanden sind, in einer eiskalten TE-Pufferlösung zu stabilisieren. Zu diesem Zeitpunkt können sie bei minus 20 Grad Celsius eingefroren werden, wenn Sie im Feld arbeiten.Oder wir können direkt mit dem Extraktionsverfahren fortfahren. Doch alle Zellen und das DNA-Material befinden sich nach wie vor im Darm. Ich werde sie nun einfach in 100 µL TE-Puffer geben.Okay, bevor ich tatsächlich mit der Extraktion der Darmproben beginne, muss ich den Puffer vorbereiten, den ich verwenden werde, um die Zellen und Gewebe aufzulösen. In dieses Röhrchen, in dem sich bereits etwa ein halbes Gramm Zirkonperlen befindet, werde ich 700 Mikroliter davon hinzufügen. Dies ist der 1 %-ige TE-Puffer, sowie 50 Mikroliter einer 20 %-igen SDS-Lösung.Es ist wichtig, das PVPP vor dem Hinzufügen erneut aufzuschwemmen, da es in wässrigen Puffern unlöslich ist. An diesem Punkt können wir das Phenol zur Probe hinzufügen, weshalb ich eine Pipette verwenden werde, um etwa 500 Mikroliter hinzuzufügen. Okay. Damit sind wir bereit, die Extraktion zu beginnen. Ja.Mit dem zugesetzten Phenol können wir nun die zuvor aus der Termitenprobe isolierte Darmsprobe hinzufügen, wobei eine leichte Zerkleinerung des Gewebes hilfreich ist. Dies erleichtert das Übertragen etwas. Nun, nach Zugabe des Phenols, können wir mit der mechanischen Zerstörung mithilfe des Bead-Beating-Geräts beginnen.Die Technik, die wir verwenden werden, besteht aus drei Zyklen auf voller Drehzahl für jeweils 30 Sekunden, gefolgt von 30 Sekunden auf Eis. Es ist wichtig, den Schritt auf Eis einzubauen, um die Probe abzukühlen, da sie sich aufgrund der Reibung erwärmt. Ich werde die Probe nun in das Bead-Beating-Gerät einsetzen und 30 Sekunden lang bearbeiten. Okay.Am Ende des Verfahrens sollten Sie feststellen, dass das meiste Gewebe homogenisiert wurde. Es sollten nur noch sehr wenige Klumpen vorhanden sein, und Sie werden bemerken, dass die Lösung einen leicht schaumigen, seifigen Glanz aufweist, vermutlich aufgrund des in der Lösung enthaltenen SDS. An diesem Punkt sind wir bereit, die Probe zu zentrifugieren und anschließend die eigentliche Extraktion und Reinigung der DNA aus dieser Probe zu beginnen.Nun, da wir die Zellen mechanisch aufgebrochen haben, werden wir das unlösliche Material abzentrifugieren. Dazu geben wir die Probe in die Zentrifuge und verwenden 8.000 × g für eine Minute. Danach erwarten wir, dass sich das meiste lösliche Material nahe dem Boden des Reaktionsgefäßes gesammelt hat.Und was uns interessiert, ist die wässrige Lösung oben. Dies ist das, was wir anschließend dem KaiGen DNA-Extraktionskit gemäß der Anleitung für rohen Lysat hinzufügen werden. Nachdem wir nun unsere Probe zentrifugiert haben, entnehmen wir 200 Mikroliter des Überstandes pro Präparation und extrahieren die DNA ausschließlich mit dem A-D-N-E-Z KaiGen-Kit, wobei wir die für rohen Lysat angegebene Protokollanleitung befolgen.Jetzt haben wir 200 Mikroliter Darmprobe und werde nun mit dem Kyogen D Easy Kit fortfahren, wobei ich dem Protokoll für rohe Lysate folge. Bei jeder Darmextraktion ist es immer ratsam, den Zustand des Darminhalts zu überprüfen. Dazu sezieren wir ein Termitenexemplar und stellen sicher, dass es repräsentativ für die Beobachtungen ist, die wir bisher gemacht haben.Wir werden dies tatsächlich visuell tun, indem wir die Zellen in dieser mikrobiellen Gemeinschaft betrachten, und zwar genau an der Spitze des Abdomens hier. An einem Pol sollten Sie den Darmtrakt sehen.Das ist also lediglich eine gepufferte Salzlösung, die der Zusammensetzung der eigentlichen Darmflüssigkeit des Termiten sehr nahekommt. Ich werde dies nun etwas zermahlen und anschließend auf den Mikroskoptrichter geben, um einen Blick hineinzuwerfen. Gut, jetzt sind wir bereit, dies unter dem Mikroskop zu betrachten.Ja, das sieht wirklich gut aus. Termitendarm. Es gibt Vertreter aller drei anerkannten Lebensbereiche.Es gibt eukaryotische Protozoen, es gibt methanogene Organismen und außerdem gibt es auch Bakterien. Unser Labor beschäftigt sich vorwiegend mit der bakteriellen Population in diesem Milieu. Insbesondere die SPI-Kes in dieser bestimmten Termitenart, den Spirekeets, gehören zu den dominierendsten bakteriellen Mitgliedern der Gemeinschaft.Und unsere aktuelle Forschung zeigt, dass sie tatsächlich in hohem Maße an der CO2-reduktiven Ketogenese beteiligt sind. Das hier sind also verschiedene Arten von Protozoen, von denen angenommen wird, dass sie vor allem am primären Abbau von Holz beteiligt sind. Man vermutet, dass sie Xylanasen und Cellulasen enthalten, die es ihren Enzymen ermöglichen, auf diese Holzpolymere zuzugreifen.Und dann fermentieren diese sie zu einwertigen Zuckermolekülen und Polymeren, die anschließend von anderen Mitgliedern der Gemeinschaft weiter abgebaut werden. Diese Protozoen produzieren selbst auch Acetat, aber eines ihrer Nebenprodukte ist Wasserstoff und CO2, und dieser Wasserstoff und CO2 wird wiederum von den Acetogen-Populationen in diesem Milieu genutzt oder verbraucht. Und hier sehen Sie einen Schwarm von Protozoen-Organismen, vermutlich direkt neben einer sehr großen Art von Trick und Infa dort.Es ist eines der größten Organismen im Termitendarm. Wenn man tiefer geht und Bereiche betrachtet, die diese großen Protozoenzellen nicht enthalten, erkennt man, dass auch die Hintergrundflüssigkeit – eine Art interstitielle Flüssigkeit – voller Spikes und anderer Bakterienzellen ist. Die Komplexität nimmt also auch in diesen Bereichen nicht ab.Eines, worauf ich hinweisen sollte, ist, dass das typische Volumen einer Hinterdarm-Abstrichprobe, wie der hier betrachteten, je nach Größe der Termite zwischen zwei und fünf Mikrolitern liegt. Die hier angefertigte Feuchtpräparat-Probenvorbereitung stellt daher tatsächlich mindestens eine 1:20-Verdünnung dieses Milieus dar. Das bedeutet, dass diese Arten im eigentlichen, intakten Darm viel, viel dichter gepackt sind, als hier dargestellt.Dadurch erhalten Sie einen Eindruck von der Dichte sowie der Vielfalt des Lebens in diesem Umfeld. Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie wir die DNA aus dem Termitendarm mit diesen gereinigten Proben isolieren. Nun werden wir in der Lage sein, spezifische gezielte Primer-Sets anzuwenden.Und zwar werden wir Gene für eine Dehydrogenase, Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und die Synthese von formal tetrahydrofolat untersuchen, die drei der von unserem Labor entwickelten Primer-Sets sind. Wir interessieren uns dafür, die Diversität und spezifischen Sequenzmerkmale einer Reihe dieser verschiedenen Gene in diesem Milieu zu erforschen. Dazu werden die unterschiedlichen Gene per PCR amplifiziert, kloniert, sequenziert und anschließend Geninventare erstellt.Ausgehend von den Ergebnissen können wir etwas über die Natur einiger dieser Wechselwirkungen erfahren und insbesondere darüber, wie diese Signalwege in diesen verschiedenen Mikroorganismen durch diesen Prozess aufgebaut sind.

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Biology

Biologie

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Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter führt uns für einen Spaziergang durch die Natur durch die Vielfalt des Lebens mit Wohnsitz in der Termite Enddarm - ein Mikroumgebung mit 250 verschiedenen Arten, die nirgendwo sonst auf der Erde. Jared zeigt, dass die Symbiose von diesem System zeigten vielschichtige und beinhaltet nicht nur eine Beziehung zwischen den Termiten und ihre Bewohner gut, birgt aber auch ein komplexes Netz von Symbiose zwischen dem Darm Mikroben sich.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese...

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

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