Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Hier ist deine Reaktion auf diese Umgebung nicht einzigartig. Die meisten Menschen, auch Nicht-Wissenschaftler, sind ziemlich überwältigt. ja. Durch die, Die Vielfalt und Komplexität.

Hallo, mein Name ist Eric Matson und ich bin Postdoc am Department of Environmental and Science Engineering hier am California Institute of Technology. Meine Arbeit unter der Leitung von Professor Jared Ledbetter konzentriert sich auf die mikrobiellen Interaktionen und die Vielfalt der Arten, die den Termiten-Hinterdarm bewohnen. Insbesondere interessieren wir uns für einige der biochemischen Stoffwechselwege, die ablaufen, und insbesondere für den Prozess der Ass-Agenesie, bei dem diese Mikroben Wasserstoff- und CO2-Gase verbrauchen und in Acetat umwandeln, das ein wichtiger Nährstoff für den Energiestoffwechsel des Termitenwirts ist.

Ich und andere im Labor haben gezielte Primer-Sets entwickelt, um wichtige Enzyme auf diesem Weg bewerten zu können. Aber um dies zu tun, müssen wir saubere DNA-Proben der Gemeinschaft (DNA) erzeugen, um sie als Ziele für diesen Prozess zu verwenden. Deshalb wollte ich heute zeigen, wie wir die Termitenarten, über die wir sprechen, sezieren, die DNA aus dem Hinterdarm extrahieren und sie dann reinigen und später für Untersuchungen verwenden.

Heute konzentrieren wir uns auf eine Termitenart, die Zo Opsis Nevadensis genannt wird. Dies ist eine kalifornische Feuchtholztermite, die hier vor Ort gesammelt wurde, und es ist eine ziemlich große Art, was es ziemlich einfach macht, die Sektionen und Extraktionen durchzuführen. Okay, heute habe ich bereits einige der Vorräte vorbereitet, die wir für den Eingriff benötigen werden.

Eines der ersten Dinge, die wir brauchen, ist eine gewisse Menge Eis, um die Insekten, die zerlegen werden, abzukühlen. Ich habe auch etwas TE-Puffer vorgekühlt, und dieser enthält eine Verbindung, die hilft, die DNA zu stabilisieren, sobald sie aus den Zellen hier drin freigesetzt wird. Ich habe sterile Fläschchen, die mit Zirkon-Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen vorgeladen sind.

Das sind 0,1 Millimeter große Kügelchen und es ist etwa ein halbes Gramm oder so drin. Das ist es, was wir tatsächlich tun werden, mechanisches Scheren. Und dann habe ich noch ein paar Reagenzien, die an der Lyse und Reinigung beteiligt sind.

Hier habe ich eine Flasche mit 1% Polyvinyl, PolyOne oder PVPP im Puffer. Das PVPP ist wichtig für die Entfernung von Huminsäuren aus den DNA-Präparaten, die unsere PCR-Analyse der Ergebnisse beeinträchtigen können. Und dann habe ich etwas Natrium-ECCO-Sulfat, ein Tensid, das wir verwenden werden, um die Zellen zu extrahieren und zu zerstören.

Und für die Sektion der Termiten brauchen wir nur eine sterile Pinzette. Diese sind ziemlich fein gekippt und das ist es, was wir tatsächlich verwenden werden, um die Darmspuren zu entfernen. Und schließlich, um die mechanische Scherung durchzuführen, haben wir hier ein Bienenschlaggerät, das sich mit sehr hohen Drehzahlen dreht und zusammen mit den Zirkoniumdioxid-Silikatkügelchen die Zellen mechanisch aufbricht.

Nachdem wir die Termiten im Feld eingesammelt haben, bringen wir sie zurück hierher ins Labor. Die meisten der kalifornischen Feuchtholztermiten, mit denen wir arbeiten, sind sehr anfällig für Austrocknung. Einer der Fortschritte, die wir in diesem Labor gemacht haben, ist die Verwendung von feuchtigkeitskontrollierten Kammern, wie z. B. diesen 10-Gallonen-Aquarien.

Hier drinnen sammeln wir die einzelnen Völker und halten sie getrennt in diesen, in diesen Kisten. Und am Boden des Tanks befinden sich im Grunde Behälter mit unterschiedlichen Salzlösungen. Diese spezielle enthält eine Lösung von Kaliumphosphat, die die relative Luftfeuchtigkeit bei 95 bis 96% hält, was perfekt ist.

Und unter diesen Bedingungen haben wir die Termiten tatsächlich in Gefangenschaft brüten lassen, aber wenn wir ein Experiment durchführen wollen, sammeln wir frisch vom Feld. Aber in dieser Box kann man etwas von dem Holz sehen, von dem sie sich ernähren. Das ist nur Ponderosa oder Jeffrey Pine, die wir am Ort des Termitennestes sammeln.

Und es gibt eine Reihe verschiedener Termitenabgüste, einschließlich der männlichen und weiblichen Fortpflanzungsformen. Der größte Teil der Kolonie besteht aus Arbeitertermiten mit der Anzahl der Soldatenabgüsse. Interessanterweise haben die Soldaten Mundwerkzeuge und Mandibeln, die eher zur Verteidigung der Kolonie als zum Fressen des Holzes gedacht sind.

Und so sind sie auf die Arbeitertermiten angewiesen, um sie auch zu ernähren. Und so können Sie in dieser Box sowohl Arbeiter- als auch Soldatentermiten sehen, sowie einige Jungtiere, die kürzlich aus Eiern geschlüpft sind. Nun, hier in Gefangenschaft.

Also habe ich, also ich habe fünf Arbeiter-Termiten aus der Gruppe ausgewählt, die ich Ihnen gerade gezeigt habe. Und ich habe damit angefangen, sie hier auf Eis zu kühlen. Um mich auf die Dissektion vorzubereiten, werde ich diese Pinzette verwenden und mit Hilfe eines Präparierzielfernrohrs arbeiten, und hoffentlich werden Sie in der Lage sein, das große Darmvolumen zu sehen, das wir von jedem dieser Individuen entfernen können.

Drehen Sie die Termiten einfach auf den Rücken und mit einer Pinzette halten Sie das Kopfende fest und mit der anderen kneifen Sie nur. Nur ganz an der Spitze des Bauches hier. Und mit einem Pol sollten Sie sehen, wie der Darmtrakt aus dem Organismus entfernt wird. Okay.

Und Sie können sehen, dass das große Volumen, etwa 30 % 40 % des Gewichts des Insekts, tatsächlich in dieser Umgebung dort enthalten ist. Und Sie können sehen, dass es in mehrere Abschnitte unterteilt ist. Wir haben den Viererdarm und dann den Mitteldarm und dann diesen Hinterdarmstanzer, die sehr große Kammer, die den größten Teil der mikrobiellen Gemeinschaft enthält, die die Fermentationen durchführt.

Hier habe ich also die Eingeweide von fünf Arbeitertermiten entfernt. Und jetzt ist der nächste Schritt, die Nukleinsäuren, die in der Gemeinschaft hier in einer Lösung aus eiskaltem Puffer enthalten sind, zu stabilisieren. Zu diesem Zeitpunkt können sie bei minus 20 Grad Celsius eingefroren werden, wenn Sie auf dem Feld arbeiten.

Oder wir fahren direkt mit dem Extraktionsverfahren fort. Aber alle Zellen und, und, und DNA-Material sind immer noch im Darm enthalten. Und ich werde sie einfach in 100 Mikroliter te Puffer geben.

Okay, bevor ich mit der Extraktion der Darmproben beginne, muss ich den Puffer vorbereiten, den ich verwenden werde, um die Zellen und Gewebe darin aufzubrechen. Zu dieser Tube, in der ich bereits etwa ein halbes Gramm Zirkonperlen habe, werde ich PVPP 700 Mikroliter davon hinzufügen. Dies ist der 1%ige Puffer und 50 Mikroliter einer 20%igen SDS-Lösung.

Es ist wichtig, das PVPP vor der Zugabe wieder zu suspendieren, da es in wässrigen Puffern unlöslich ist. Zu diesem Zeitpunkt sind wir bereit, das Phenol zur Probe hinzuzufügen, also werde ich eine Pipette verwenden, um etwa 500 Mikroliter hinzuzufügen. Okay. Und damit sind wir bereit, mit der Extraktion zu beginnen. ja.

Mit dem Zusatz des Phenols sind wir bereit, die Darmprobe hinzuzufügen, die wir zuvor von der Termiten seziert haben, damit das Gewebe ein wenig mazeriert werden kann. Es macht den Transfer tendenziell etwas einfacher. Und jetzt, da das Phenol hinzugefügt wurde, sind wir bereit, mit dem mechanischen Aufstoßen mit der Raupensickervorrichtung zu beginnen.

Die Technik, die wir verwenden werden, besteht aus drei Zyklen bei voller Geschwindigkeit, 30 Sekunden, gefolgt von 30 Sekunden auf Eis. Es ist wichtig, den Schritt auf Eis einzubauen, um die Probe abzukühlen, da sie aufgrund der Reibung dazu neigt, sich zu erwärmen. Also setze ich die Probe einfach in die Perlenperlenvorrichtung hier ein, und ich werde 30 Sekunden lang gehen. Okay.

Am Ende des Eingriffs sollten Sie feststellen, dass der größte Teil des Gewebes homogenisiert wurde. Es sollten nur noch sehr wenige Klumpen übrig sein, und Sie werden sehen, dass es eine Art schaumiges Aussehen hat, wahrscheinlich wegen des SDS darin. Zu diesem Zeitpunkt sind wir bereit, zu zentrifugieren und dann mit der eigentlichen Extraktionsreinigung der DNA selbst aus dieser Probe zu beginnen.

Nachdem wir die Zellen mechanisch aufgebrochen haben, werden wir das unlösliche Material herauszentrifugieren. Wir werden dies tun, indem wir die Zentrifuge einsetzen und eine Minute lang die 8.000-fache Schwerkraft verwenden. Und was wir jetzt erwarten, ist, dass sich der größte Teil des löslichen Materials in der Nähe des Bodens des Röhrchens sammelt.

Und was uns interessiert, ist die wässrige Lösung oben. Und das ist es, was wir dem KaiGen DNA-Extraktionskit nach dem Verfahren für Rohlysat hinzufügen werden. Jetzt, da wir unsere Probenzentrifuge haben, nehmen wir 200 Mikroliter pro Präparat des Überstands und extrahieren die DNA einfach mit dem A-D-N-E-Z KaiGen-Kit unter Verwendung des für Rohlysat angegebenen Protokolls.

Jetzt haben wir die 200 Mikroliter Darmprobe, und ich werde mit dem Kyogen d Easy Kit fortfahren, wobei ich das für Rohlysat angegebene Protokoll verwenden werde. Wann immer wir eine Darmextraktion durchführen, ist es immer eine gute Idee, den Status des Darminhalts zu überprüfen. Wir tun das, indem wir eine Termite sezieren und sicherstellen, dass sie repräsentativ für Dinge ist, die wir in der Vergangenheit gesehen haben.

Wir werden das tatsächlich visuell tun, indem wir uns die Zellen in dieser mikrobiellen Gemeinschaft ansehen. Nur ganz an der Spitze des Bauches hier. Und mit einer Stange sollten Sie den Darmtrakt sehen.

Es handelt sich also nur um eine gepufferte Salzlösung, die sehr genau der Zusammensetzung der tatsächlichen Darmflüssigkeit der Termiten entspricht. Und ich werde das einfach ein wenig mazerieren und dann füge ich es dem Objektträger hinzu und wir schauen es uns an. Okay, jetzt sind wir bereit, das unter die Lupe zu nehmen.

Ja, das sieht wirklich gut aus. Termiten-Darm. Es gibt Vertreter aller drei anerkannten Lebensbereiche.

Es gibt eukaryotische Protozoen, es gibt Meth-Organismen und dann gibt es auch Bakterien. Und unser Labor beschäftigt sich vor allem mit der Bakterienpopulation in dieser Umgebung. Nämlich die SPI kes, die in dieser speziellen Art von Termitenspitzenkeets sind, gehören zu den dominantesten bakteriellen Mitgliedern der Gemeinschaft.

Und unsere aktuelle Forschung zeigt, dass sie tatsächlich zu einem großen Teil an der CO2-reduktiven Ketogenese beteiligt sind. Das sind also verschiedene Arten von Protozoen, und man nimmt an, dass sie an der primären Zersetzung von Holz beteiligt sind. Es wird also angenommen, dass sie Xin-AEs und Cellulase enthalten, die ihren Enzymen den Zugang zu diesen Holzpolymeren ermöglichen.

Und, und dann, sie fermentieren diese zu Monozucker-Monomeren und, und, und Polymeren, die von anderen Mitgliedern der Gemeinschaft weiter abgebaut werden. Und diese Protozoen produzieren auch selbst Acetat, aber, aber eines ihrer Nebenprodukte ist Wasserstoff und CO2, und dieser Wasserstoff und CO2 ist wiederum das, was von den Aceto-Populationen in dieser Umgebung verwendet oder verbraucht wird. Und hier sieht man nur einen Schwarm von Protozoen, wahrscheinlich direkt neben einer sehr großen Spezies von, von Trick und Infa dort.

Es ist einer der größten Organismen im Termitendarm. Wenn Sie nach unten gehen und sich Bereiche ansehen, die diese großen Protozoenzellen nicht enthalten, werden Sie sehen, dass der Hintergrund darin besteht, dass diese Art von interstitieller Flüssigkeit auch mit Spi, Keets und anderen Bakterienzellen beladen ist. Und so wird die Komplexität auch in diesen Räumen nicht geringer.

Eines der Dinge, auf die ich hinweisen sollte, ist, dass das typische Volumen des Hinterdarmstanzes, wie der, den wir uns hier angesehen haben, je nach Größe der Termiten zwischen zwei und fünf Mikrolitern liegt. Und so stellt die Nassmontagevorbereitung, die ich hier gemacht habe, wirklich mindestens eine Verdünnung dieser Umgebung um mindestens ein bis 20 Grad dar. Und so ist es eigentlich so, dass diese Spezies viel, viel dichter in den eigentlichen intakten Darm gedrängt sind, als das, was hier dargestellt wird.

Das gibt dir eine Vorstellung davon, wie sehr die Dichte und die Vielfalt des Lebens in dieser, in dieser Umgebung ist. Deshalb habe ich Ihnen heute gezeigt, wie wir mit diesen gereinigten Proben die DNA aus dem Termitendarm isolieren. Jetzt werden wir in der Lage sein, die spezifischen gezielten Grundierungssets aufzutragen.

Wir werden uns nämlich Gene für die Form einer Dehydrogenase, eine Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und die formale Tetrahydrofolatsynthese ansehen, die drei der Primer-Sets sind, die unser Labor entwickelt hat. Wir sind daran interessiert, die Vielfalt und die spezifischen Sequenzmerkmale einer Reihe dieser verschiedenen Gene für diese Umgebung zu untersuchen. Dazu gehört die PCR-Amplifikation der verschiedenen Gene, ihre Klonierung, ihre Sequenzierung und der Aufbau von Geninventaren.

Basierend auf den Ergebnissen können wir etwas über die Art einiger dieser Wechselwirkungen lernen und insbesondere darüber, wie diese Signalwege in diesen verschiedenen Mikroorganismen durch diesen Prozess aufgebaut sind.