Name: Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Erfahren Sie die DNA-Extraktion aus Darmmikroben der Termite Zootermopsis angusticollis für mikrobielle Ökologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften im Hinterdarm.

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Zusammenfassung des Verfahrens für die Termiten ganzen Darm DNA-Extraktion: <ol><li> Gefühlt Termiten auf Eis zu entfernen gut mit einer sterilen Pinzette und stabilisieren gut Proben in Puffer. </li><li> Homogenisieren Proben in PVPP / SDS / Phenol-Puffer. </li><li> Extrahieren und zu reinigen DNA aus Rohlysat mit Qiagen DNeasy Spalten. </li></ol> Protokoll: <ol><li> Auf Eis, entfernen Sie die Eingeweide aus Arbeiter Kaste Termiten mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Sofort überweisen Sie den Mut und die Inhalte in einen sterilen, Nuklease-freies Röhrchen mit 50 uL eiskaltem 1x Molekularbiologie TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze-Proben bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt mit der Homogenisierung. </li><li> Übertragen Sie die gut Proben und Puffer, um eine sterile, Nuklease-freies 2 ml Schraube Röhrchen vorinstalliert mit 500 mg sterile Zirkonoxid / Silica-Kugeln (0,1 mm) und 700 ul 1x TE-Puffer mit 1% w / v Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ). </li><li> Dann werden 50 ul 20% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 500 ul Phenol zu den Proben. </li><li> Homogenisieren (bead beat) auf die höchste Einstellung mit drei Zyklen von 30 sec homogenisiert und 30 sec von Kühlen auf Eis. </li><li> Sediment unlösliches Material für 1 min bei 8.000 x g. </li><li> Purify 300-ul Aliquots der wässrigen (oberste) Schicht mit Qiagen DNeasy Spalten mit der Methode für Rohlysat Reinigung beschrieben. </li><li> Quantify Nukleinsäure Inhalt und frieren die Proben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

Nach unserer Erfahrung ist die DNA aus der mikrobiellen Lebensgemeinschaften von Holz-Fütterung Termitenart wie Zootermopis nevadensis extrahiert rein genug für die PCR-Vorlage nach einer Runde der Extraktion und Reinigung. Jedoch können einige Termiten, wie Wurf-Fütterung und Boden-Fütterung Arten haben eine höhere Konzentration an Huminsäuren in ihren Darminhalt und kann zusätzliche Reinigung des Darms mikrobielle DNA erfordern. Die gesamte DNA-Ausbeute aus dem Bauch von 5 Z. nevadensis Arbeiter liegt im Bereich von 10-30 pg. Für Termiten...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/Phenol</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>Homogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Wird gemäß dem Protokoll zur Isolierung genomischer DNA aus rohen Lysaten verwendet (Anhang H, Produktanleitung Version: Juli 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1x-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) aus 100x-Konzentrat hergestellt</td></tr><tr><td>Zirkonia/Silica-Perlen</td><td>Zubehör</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0,1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1 % (w/v) Polyvinylpolypyrrolidon, hergestellt aus trockenem Reagenz als 1x-Suspension in TE-Puffer</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Termiten</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>Natriumdodecylsulfat 20 %ige Lösung in Wasser, hergestellt aus trockenem Reagenz</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>TE-gesättigt, ~73 %</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Gerät</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>gepufferte Salzlösung, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>Zusammensetzung pro Liter: 2,5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl und 10 mL einer 1 M Lösung von NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Ausgestattet mit 40x-Objektiv, 1,6x-Optivar und 10x-Augenlinsen. Die Proben wurden im Phasenkontrastverfahren betrachtet</td></tr></tbody></table>

extrahieren von dna aus dem gut mikroben der termite (zootermopsis angusticollis) und visualisieren gut mikroben

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termiten gehören zu den wenigen Tieren bekannt, dass die Fähigkeit, allein bestehen durch den Verzehr von Holz haben. Die Termitendarm Trakt enthält eine dichte und artenreiche mikrobiellen Population, die in den Abbau von Lignocellulose unterstützt überwiegend in Acetat, der Schlüssel Nährstoff Betankung Termiten Stoffwechsel (Odelson &amp; Breznak, 1983). Innerhalb dieser mikrobiellen Populationen sind Bakterien, methanogenen Archaea und in einigen (&quot;lower&quot;) Termiten, Protozoen eukaryotische. So werden Termiten ausgezeichnete Versuchspersonen für die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroben-Spezies und den zahlreichen biochemischen Funktionen, die sie durchführen, um den Nutzen ihrer Gastgeber. Die Artenzusammensetzung der mikrobiellen Populationen in Termiten guts sowie wichtige Gene in verschiedenen biochemischen Prozessen beteiligt wurde erforscht mit Hilfe molekularer Techniken (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Diese Techniken sind abhängig von der Extraktion und Reinigung von hochwertigen Nukleinsäuren aus der Termitendarm Umwelt. Die Extraktion Technik in diesem Video beschrieben wird, eine modifizierte Zusammenstellung von Protokollen für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Umweltproben (Mor et al, 1994 entwickelt;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) und sie produziert DNA von Termiten Enddarm Material für die Verwendung als Vorlage für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).

Dieses Video zeigt die Technik zur Gewinnung von DNA aus den Arten von Mikroben mit Wohnsitz in der Termite Enddarm. Die Herstellung eines Nasspräparat Rutsche, die nützlich für die Visualisierung der gut mikrobiellen Gemeinschaft ist, ist auch dargestellt, und eine Tour durch die artenreiche gut Umfeld gegeben ist.

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Termiten gehören zu den wenigen Tieren, von denen bekannt ist, dass sie die Fähigkeit besitzen, ausschließlich durch den Verzehr von Holz zu überleben. Der Termitendarm enthält eine dichte und ...

Hier ist Ihre Reaktion auf diese Umgebung nicht einzigartig. Die meisten Menschen, sogar Nicht-Wissenschaftler, sind ziemlich beeindruckt. Ja. Von der Vielfalt und Komplexität.Hallo, mein Name ist Eric Matson und ich bin Postdoktorand in der Abteilung für Umwelt- und Ingenieurwissenschaften am California Institute of Technology. Meine Arbeit unter der Leitung von Professor Jared Ledbetter konzentriert sich auf die mikrobiellen Wechselwirkungen und die Artenvielfalt von Organismen, die im hinteren Darm des Termiten leben. Insbesondere interessieren wir uns für einige der ablaufenden biochemischen Stoffwechselwege und beschäftigen uns vor allem mit dem Prozess der Acetogenese, bei dem diese Mikroben Wasserstoff und CO2 verbrauchen und in Acetat umwandeln, ein zentraler Nährstoff für den Energiestoffwechsel des Termitenwirts.Ich und andere Mitarbeiter im Labor haben gezielte Primer-Sets entwickelt, um wichtige Enzyme in diesem Stoffwechselweg untersuchen zu können. Dazu ist es jedoch erforderlich, saubere DNA-Proben der mikrobiellen Gemeinschaft zu gewinnen, die als Zielsequenzen für diesen Prozess verwendet werden können. Heute möchte ich daher demonstrieren, wie wir die betreffende

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Jared Leadbetter erklärt, warum die Termiten-Darm mikrobiellen Gemeinschaft ist ein ausgezeichnetes System für die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen zwischen Mikroben. Die symbiotische Beziehung, die zwischen dem Host-Insekten-und Lignocellulose-abbauende Mikroben gut erklärt wird, sowie die industriellen Anwendungen dieser Mikroben zum Abbau von pflanzlicher Biomasse und Erzeugung von Biokraftstoffen.

Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter führt uns für einen Spaziergang durch die Natur durch die Vielfalt des Lebens mit Wohnsitz in der Termite Enddarm - ein Mikroumgebung mit 250 verschiedenen Arten, die nirgendwo sonst auf der Erde. Jared zeigt, dass die Symbiose von diesem System zeigten vielschichtige und beinhaltet nicht nur eine Beziehung zwischen den Termiten und ihre Bewohner gut, birgt aber auch ein komplexes Netz von Symbiose zwischen dem Darm Mikroben sich.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese...

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.

Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Über DNA Stable Isotope Probing Mit<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Wilde Caenorhabditis-Nematoden sind mit vielen Mikroben assoziiert, oft im Darmlumen oder im Darm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Mikroben, die den Darm besiedeln, unter Ausnutzung der Widerstandsfähigkeit der Dauerkutikula.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

Kompost-Mikrokosmen bringen die mikrobielle Vielfalt der Natur ins Labor, um die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans zu erleichtern. Hier sind Protokolle für den Aufbau von Mikrokosmos-Experimenten, wobei die Experimente die Fähigkeit demonstrieren, die mikrobielle Vielfalt der Umwelt zu modulieren, um die Beziehungen zwischen der mikrobiellen Vielfalt der Umwelt und der Zusammensetzung des Mikrobioms des Wurmdarms zu untersuchen.

Kompostmikrokosmen als mikrobiell vielfältige, naturähnliche Umgebungen für die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans

Wir schlagen ein optimiertes Rasterelektronenmikroskopie-Protokoll vor, um sehr heterogene und empfindliche Proben zu visualisieren, die pflanzliche und pilzliche Biomasse zusammen mit Mikrobiota und Biofilm enthalten. Dieses Protokoll ermöglicht es, die räumlichen Dimensionen der Mikrobiota-Organisation zu beschreiben.

Mikrobiota von Attinanameisengärten: Visualisierung einer mikrobiellen Landschaft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

Erfahren Sie die DNA-Extraktion aus Darmmikroben der Termite Zootermopsis angusticollis für mikrobielle Ökologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften im Hinterdarm.

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

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