Name: Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors mit kleinen Molekülen. Diese Methode erzeugt effizient Olig2+NG2+ OPCs innerhalb von 30 Tagen für Neurowissenschaften.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse zu WD von National Institutes of Health (RO1 NS059043 und RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anämie Research, Feldstein Medical Foundation und der Shriners Hospitals for Children unterstützt. Wir möchten Dr. David Pleasure und Jennifer Flugzeug für Anregungen bedanken. Wir erklären, keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit diesem Artikel.

Detaillierte Verfahren zur Erzeugung Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) aus GFP-Olig2 embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs): <ol><li> Maus ES-Zelllinie GFP-Olig2 (G-Olig2), wird von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Die mESCs werden routinemäßig alle 3 Tage passagiert auf einer bestrahlten Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Feeder-Schicht. Die MEF-Zellen werden in 0,1% Gelatine beschichtete sechs gut Gewebekulturplatte mindestens einen Tag vor der Passage der WSR überzogen. Die MESC Kulturmedium Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco) mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM β-Mercaptoethanol /, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ( NEAA), und 1.000 U / ml Leukämie hemmender Faktor. </li><li> mES Kolonien trypsiniert (TrypLE, 5 min, 37 ° C) in einzelne Zellen, suspendiert in Knockout-Serum-Ersatz (KSR) Medium, dann werden die Zellen zu einer Costar Ultra-Low-Anlage Sechs-Well-Platte (Corning) in einer Zelle übertragen Dichte von 50.000 Zellen / cm 2. Unter diesen Bedingungen bilden mESCs Embryoidkörpern (EBS). KSR Medium besteht aus-minimal essential medium (-MEM) mit 20% KSR, 1 mM Natriumpyruvat, 1% NEAA und 0,1 mM β-Mercaptoethanol / ergänzt. </li><li> Von Tag 4 bis Tag 7, Retinsäure (RA, 0,2 M) und purmorphamine (Pur, 1 M) enthalten, wie in Abb. gezeigt. 1A in KSR oder N2 Medium. Die N2 Medium-MEM mit 1X N2 zu ergänzen, 1 mM Natriumpyruvat, 1% NEAA und 0,1 mM β-Mercaptoethanol /. Das Medium wird täglich gewechselt. </li><li> Am Tag 8, EBs aufgeschlüsselte mit TrypLE (5min, 37 ° C) und vergoldet auf 0,01% Polyornithin-beschichtete Platten in OPC Medium, das von N2 mittel-und Fibroblasten besteht growth factor-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Das Medium wird alle zwei Tage gewechselt. </li><li> Die Zellen werden trypsiniert (TrypLE, 3 min, 37 ° C) und replattiert etwa jede Woche, wenn sie konfluent geworden. Am Tag 30, zeigen mehr als 80% der Zellen GFP/Olig2 Ausdruck und sind NG2-positive, die charakteristisch für OPCs. </li><li> Um spiking OPCs zu generieren, die BacMam Na +-Kanal-Kit wird verwendet, um Na v 1.2-Untereinheit in diese MESC-derived OPCs einzuführen. Die BacMam Reagenz (1 ml, Komponente A) wird mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 5 ml gemischt. Dann wird die gemischte BacMam Reagenz in MESC-derived OPCs Kultur in einer 60 mm Kulturschale gegeben (bei 50-70% Konfluenz) vor, mit PBS gespült. Nach 2 Stunden Inkubation wird die gemischte BacMam Reagenz entfernt und durch OPC Medium mit 1X-Enhancer ergänzt ersetzt. Der Verstärker ist die Komponente B rekonstituiert in DMSO (Komponente C). Als nächstes wird nach zusätzlichen 2-Stunden-Inkubation das Medium mit Enhancer wird entfernt und durch vollständige OPC-Medium ersetzt. Die Zellen werden 24 Stunden später untersucht. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Nach der Differenzierung Protokoll in Abb.. 1A, G-Olig2 mESCs wurden zunächst in KSR Medium und für 4 Tage ausgesetzt, um Embryoidkörpern (EVG) (Abb. 1B) zu bilden. Dann haben wir nacheinander behandelt die EBs mit RA und Pur. Die EBs zeigten keine GFP-Fluoreszenz an Tag 4 und äußerte starke GFP-Fluoreszenz bei D8 (Abb. 1B). Zu diesem Zeitpunkt wurden die EBs trypsiniert und vernickelt in N2-Medium mit Wachstumsfaktoren FGF-2 ergänzt. Nach weiteren Kultur für 22 Tage (D30), erreichte der Anteil der GFP + Zellen 80,3 ± 0,6% nach unseren Durchflusszytometrie Ergebnisse. Wie in Abb.. 1C, GFP +-Zellen mit NG2 Färbung konsequent (96,4 ± 1,3% der GFP-positive Zellen wurden NG2 positiv, und 94,8 ± 1,5% vom NG2 positive Zellen wurden GFP positive) überlagert. So exprimieren diese Zellen GFP/Olig2 und NG2, definieren sie als OPC. Die MESC-derived OPCs (76 Zellen) nicht Aktionspotentiale auf Depolarisation (Abb. 2A) Feuer. Nach Transduktion mit einem Baculovirus Durchführung der Na v 1.2-Untereinheit, könnten diese MESC-derived OPCs (94,1%, 16 von 17 Zellen) als Spike (Abb. 2B) eingestuft werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Differenzierung von GOlig-MESC in OPCs. (A) Schematische Darstellung des Protokolls der Embryoidkörper (EB)-basierte und Small Molecule-driven Differenzierung. Bei D8 wurden die EBs aufgeschlüsselt und vergoldet. Die Zellen wurden einmal pro Woche passagiert, wenn sie konfluent geworden. (B) D8, aber nicht D4 EBs, zeigte die GFP-Expression. (C) Immunfärbung von NG2 (rot) stand im Einklang mit GFP (grün) Expression auf D30. DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu identifizieren. Maßstab: 20 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Generierung von spiking OPCs aus nonspiking MESC-derived OPCs durch Virus-vermittelten Na v-Kanal Ausdruck. (A) Die Membranpotential wurde auf -60 mV und MESC-derived OPCs hielt nicht Aktionspotentiale Feuer, auch wenn die Zelle depolarisiert auf 0 mV. (B) Ein Beispiel für MESC-derived OPCBrennen Aktionspotential (rot markiert) nach der viralen Transduktion.

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), aus einer Blastozyste Embryo isoliert, kann in allen Zelllinien des Organismus 3, 4 zu unterscheiden, bietet ein in vitro Modell für die Erforschung von frühen Entwicklung von Säugetieren, einschließlich Oligodendrozyten-Spezifikation. mESCs haben gezeigt, dass in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) mit der Behandlung von Sonic Hedgehog (SHH) 5 zu unterscheiden. Darüber hinaus behält sich das Shh-induzierten OPC Differenzierung von mESCs das richtige Timing bei der Embryonalentwicklung 6 beobachtet. Daher ist die Art der In-vitro-Differenzierung von OPC mESCs als im Einklang mit dem, was von in vivo Entwicklung gelernt. Hier mit dem kleinen Molekülen RA und die Shh-Agonisten Pur, haben wir erfolgreich die G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad unterschieden. OPCs, durch den Ausdruck der Proteoglykan NG2 7 und die Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor Olig2 8 gekennzeichnet, erzeugen Oligodendrozyten in den Entwicklungsländern und reifen ZNS, wo sie einen bedeutenden Prozentsatz (~ 5%) der gesamten Zellen und enthalten, sind die Haupt-proliferierenden Zelltyp 9. Seit fast zwei Jahrzehnten haben Forscher Na V-Kanäle gezeigt werden in einer Subpopulation von OPCs zum Ausdruck und kann auf Depolarisation 10, 11 aktiviert werden. Darüber hinaus wurde kürzlich bemerkenswerte Beobachtung 9, die in in situ Ratte CNS weißen Substanz, OPCs (~ 50%) Aktionspotenziale erzeugt, wenn depolarisiert abhängig von der Expression von spannungsabhängigen Natrium (Na V) Kanäle, und so konnte in spiking unterteilt werden und nonspiking Subpopulationen. Allerdings sind die Funktionen dieser spiking Eigenschaften noch weitgehend unbekannt. Wir fanden, dass, elektrophysiologisch, die MESC-derived OPCs mit dem Shh-abhängigen Protokoll differenzierte, nicht die gleiche wie die in situ Gehirn OPCs. Nach der Einführung Untereinheit Na V 1.2 wurden diese stille MESC-derived OPCs in der Lage spiking. So kann das Aufstocken / nonspiking MESC-derived OPCs und Differenzierung hier beschriebene Protokoll (1) Untersuchung der funktionellen Unterschiede zwischen Spike und nonspiking OPCs, (2) Screening neuer Faktoren, die Natrium-Kanal Ausdruck in der MESC-derived OPCs, fördern könnte zu erleichtern ( 3) Entwicklung und Optimierung der Differenzierung Protokoll der OPCs aus menschlichem ESC oder induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs).

<table><tbody><tr><td>MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung von embryonalen stammzellen in oligodendrozyten precursors

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des zentralen Nervensystems. Für regenerative Zelltherapie in demyelinisierenden Erkrankungen, gibt es großes Interesse bei der Ableitung eines reinen Population von Lineage-committed Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) für die Transplantation. OPCs werden durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors Olig2 und Oberfläche Ausdruck eines Proteoglykan NG2 aus. Mit der GFP-Olig2 (G-Olig2) Maus embryonalen Stammzellen (MESC) Reporter Linie, optimierten wir die Bedingungen für die Differenzierung von mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In unserem Protokoll, beschreiben wir zunächst die Generierung von Embryoidkörpern (EVG) aus mESCs. Zweitens beschreiben wir die Behandlung von MESC-derived EBs mit kleinen Molekülen: (1) Retinsäure (RA) und (2) ein Sonic Hedgehog (SHH)-Agonist purmorphamine (Pur) unter definierten Kulturbedingungen zu EB Differenzierung in die oligodendroglialen Linie zu lenken. Mit diesem Ansatz kann OPCs mit hohem Wirkungsgrad (&gt; 80%) in einem Zeitraum von 30 Tagen erreicht werden. Zellen aus mESCs in diesem Protokoll ergeben, sind phänotypisch ähnlich OPCs aus primärem Gewebe Kultur abgeleitet. Die MESC-derived OPCs zeigen nicht die Spikes-Eigenschaft für eine Subpopulation von Gehirn OPCs in situ beschrieben. Um dies zu untersuchen elektrophysiologische Eigenschaft beschreiben wir die Erzeugung von spiking MESC-derived OPCs von ektopisch auszudrücken Na<sub&gt; V</sub&gt; 1,2-Untereinheit. Der Spick und nonspiking Zellen aus diesem Protokoll erhalten wird vorab funktionelle Untersuchungen an den beiden Subpopulationen von OPCs zu helfen.

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf &quot;Aufstocken&quot; OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des Zentralnervensystems. Für die regenerative Zelltherapie bei demyelinisierenden Erkrankungen besteht ein erhebliches ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen über eine Reihe von Kultivierungsschritten innerhalb von 30 Tagen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryoidkörper aus murinen ES-Zellen generiert werden, um die Differenzierung der Zellen einzuleiten. Im zweiten Schritt werden die Embryoidkörper mit den kleinen Molekülen Retinsäure und Pure Morphine behandelt, welche die gezielte Differenzierung der Zellen in eine liga den induzieren.Vorläuferzellen. Als dritter Schritt werden Embryoidkörper nach weiteren 22 Tagen in Einzelzellen zerlegt. In der Kultur sind etwa 80 % der Zellen OPCs.Anschließend werden die aus MESCs gewonnenen OPCs mit bao-Viren, die die NAV-1.2-Untereinheit tragen, transduziert, um spikende OPCs zu erzeugen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Expression von OPC-Markern und die Spik-Eigenschaften dieser aus MESCs abgeleiteten OBCs, basierend auf immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen und elektrophysiologischen Ableitungen. Hallo, ich bin Pong Chiang aus dem Labor von Dr. Ing in der Abteilung für Zellbiologie und humane Anatomie an der University of California, Davis. Wir sind außerdem mit dem Shriners Hospital for Children im Norden Kaliforniens verbunden.Hallo, ich bin Vial Raj, ebenfalls aus dem Deng-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Eigenschaften von aus embryonalen Stammzellen stammenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu untersuchen, um Zellen mit einem besseren therapeutischen Potenzial zu erzeugen.Beginnen wir also. Heute werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs aus der OG-zwei-GFP-Maus-embryonalen Stammzelllinie generiert. Diese embryonalen Stammzellen müssen alle drei Tage weitergeimpft werden, um sie gesund zu halten, eine optimale Dichte aufrechtzuerhalten und eine spontane Differenzierung zu verhindern. Weiterimpfung.Die ESS-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, unter einem laminaren Luftstromgehäuse entnehmen. Das Kulturmedium entfernen. Mit PBS spülen und die Zellen mit zwei Milliliter vorgewärmtem Trypsin versetzen.Eine mal Trip-Lyse-Extraktion für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion und resuspendieren Sie die Zellen in vier Milliliter MES-Zellmedium. Überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas und pelletieren Sie sie bei 1000 U/min fünf Minuten lang.In MESL-Mediumplatte resuspendieren, dabei ein Zehntel der Zellen über eine konfluente Schicht bestrahlter Meth-Feeder-Zellen in MES-Zellmedium geben. Nach drei Tagen sind die ES-Zellen etwa zu 70 % konfluent und können zum Passagieren oder zur Embryoidkörperbildung resuspendiert werden, um die Differenzierung einzuleiten. Die Maus-ES-Zellkolonien wie zuvor mit Trypsin ablösen und anschließend die Zellen in Knockout-Serumersatz- oder KSR-Medium resuspendieren. Die Zellen mit einem Hemo TER zählen, die Suspension in KSR verdünnen.Mittel bis 15.000 Zellen pro Milliliter, jeweils drei Milliliter in jede Vertiefung einer ultraniedrig bindenden 6-Well-Kulturplatte geben. Die suspendierten Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Das Kulturmedium alle zwei Tage vollständig erneuern.Ab dem vierten Tag täglich das Medium wechseln. Am fünften Tag das KSR mit 0,2 Mikromolar Retinsäure supplementieren. Am sechsten und siebten Tag zusätzlich mit Retinsäure und einem Mikromolar Primor Famine supplementieren. Die Embryoidkörper mit zwei Medien versorgen, die mit 0,2 Mikromolar Retinsäure und einem Mikromolar Primor Famine ergänzt sind. Nach acht Tagen Kultivierung exprimieren die meisten Embryoidkörper GFP und sind bereit, mit Trypsin aufgelöst, disaggregiert und die Zellen wie zuvor gezählt zu werden.Dann resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 3,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in OPC-Medium und geben 3 Milliliter der Suspension in OPC-Medium. Unter Verwendung von mit Poly-Ornithin beschichteten 60-Millimeter-Kulturgeschirren werden die Zellen etwa alle Woche konfluent und sehen wie zuvor beschrieben aus. Passagieren Sie die Zellen erneut mit dreiminütiger Trypsinisierung.30 Tage nach der ursprünglichen Resuspendierung. In KSR-Medium zeigen die Zellen Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, um spikende OPCs zu erzeugen. Verwenden Sie aus murinen ESL abgeleitete OPCs, die einen Konfluenzgrad zwischen 50 und 70 % aufweisen.Das Medium durch ein XPBS ersetzen, um die Zellen zu waschen. Um spannungsabhängige Natriumkanal-1.2-Alpha-Untereinheiten einzuführen.Wir verwenden das Back-MAM-Natriumkanal-Kit. Mischen Sie ein Milliliter Back-MAM-Komponente A mit vier Milliliter 1× PBS. Entfernen Sie die PBS-Spülung und geben Sie die verdünnte Komponente hinzu.Bei 37 Grad Celsius zwei Stunden inkubieren. Ersetzen Sie das Back-Memory-Medium durch OPC-Medium, das mit den Komponenten B und C wie in der Anleitung beschrieben angereichert ist. Anschließend weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation das verbesserte Medium durch frisches OPC-Medium ersetzen. Nach weiteren 24 Stunden Kultur können die aus ESL stammenden OPCs zu diesem Zeitpunkt auf Aktionspotentiale getestet werden. Die EBS zeigen keine GFP-Fluoreszenz.Die EBS zeigen eine starke GFP-Expression und sind etwa 30 Tage nach der ursprünglichen Resus-Suspension zur Disaggregationskultur bereit. In KSR-Medium sind die meisten Zellen immunpositiv für NG2-Färbung, was mit der GFP-Expression übereinstimmt. Im Gegensatz zu zerebralen OPCs sind diese aus MES-Zellen abgeleiteten OPCs jedoch nicht in der Lage, Aktionspotentiale auszulösen, selbst wenn die Zellen bis auf null Millivolt depolarisiert werden.Nach der Einführung der NAV 1.2-Untereinheit mittels viraler Transduktion erregen sich diese aus MES-Zellen stammenden OPCs und feuern Aktionspotentiale. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man embryonale Stammzellen der Maus zu OPCs differenziert und mittels viraler Transduktion OPCs mit Aktionspotentialbildung erzeugt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Retinsäure sowie FGF 2 ordnungsgemäß aufzubewahren und stets frische Aliquote zu verwenden; verbleibende Mengen an Retinsäure sollten nach Gebrauch entsorgt werden.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

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Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus menschlichen embryonalen Stammzellen, gefolgt von der Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten. Dieser Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten eröffnet zahlreiche Möglichkeiten, die Erforschung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, zu verbessern.

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Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

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