Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Oligodendrozyten-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen über eine Reihe von Kultivierungsschritten über einen Zeitraum von 30 Tagen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryokörper aus ES-Zellen der Maus erzeugt werden, um die Zelldifferenzierung zu initiieren. In einem zweiten Schritt werden die Embryokörper mit den kleinen Molekülen Retinsäure und reinem Morphin behandelt, die die gerichtete Differenzierung der Zellen zu einer Liga den induzieren.

Cyte-Vorläufer. In einem dritten Schritt werden die Embryokörper nach weiteren 22 Tagen in einzelne Zellen zerlegt. In Kultur sind ca. 80% der Zellen OPCs.

Als nächstes werden die MESC-abgeleiteten OPCs mit Bao-Viren transduziert, die die NAV 1.2-Untereinheit tragen, um Spiking-OPCs zu erzeugen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Expression von OPC-Markern und Spike-Eigenschaften dieser MESC-abgeleiteten OBCs auf der Grundlage von Immunfluoreszenzmikroskopie und elektrophysiologischen Aufzeichnungen zeigen. Hallo, ich bin Pong Chiang aus dem Labor von Dr.Ing in der Abteilung für Zellbiologie und menschliche Anatomie an der University of California Davis. Wir sind auch mit dem Shriners Hospital for Children of Northern California verbunden.

Hallo, ich bin Fläschchen Raj, auch aus dem Deng-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Differenzierung von Emron-Stammzellen der Maus in Genozid-Vorläuferzellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Eigenschaften von embryonalen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläufern zu untersuchen, um Zellen mit besserem therapeutischem Potenzial zu erzeugen.

Also lasst uns loslegen. Heute werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus der OG-Zwei-GFP-Maus-embryonalen Stammzelllinie erzeugt. Diese embryonalen Stammzellen müssen alle drei Tage passaget werden, um sie bei optimaler Dichte gesund zu halten und eine spontane Differenzierung zu verhindern. Durchgang.

Die ESS-Zellen, wenn sie bei 70 % unter einer Laminar-Flow-Haube zusammenfließen. Entfernen Sie das Medium über der Kultur. Mit PBS und Trypsin-Augen mit zwei Millilitern Vorwärmung spülen.

Eine x Fahrt mit dem LE Express für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Reaktion und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern MES-Zellmedium. Füllen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1000 RP.

Resuspendieren Sie in einer MESL-Mediumplatte, ein Zehntel der Zellen über einer konfluenten Schicht von bestrahlten Meth-Feedern im MES-Zellmedium. Nach drei Tagen sind ES-Zellen zu etwa 70 % konfluent und bereit, passageiert oder suspendiert zu werden, um Embryokörper zu bilden, Embryokörper zu induzieren und mit der Differenzierung von Trypsin-Maus-ES-Zellkolonien wie zuvor zu beginnen und die Zellen dann in Knockout-Serumersatz oder KSR-Medium zu resuspendieren. Zählen Sie die Zellen auf einer hämografischen TER und verdünnen Sie die Suspension in KSR.

Medium bis 15.000 Zellen pro Milliliter Platte drei Milliliter in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Plattenkultur mit ultraniedriger Anhaftung. Die suspendierten Zellen bei 37 Grad Celsius für vier Tage. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage vollständig.

Ersetzen Sie ab dem vierten Tag das Medium täglich am vierten Tag Ergänzen Sie das KSR mit 0,2 mikromolaren Retinsäure am fünften Tag Ergänzen Sie es mit Retinsäure und einer mikromolaren Urhungersnot am sechsten und siebten Tag. Füttern Sie die Embryokörper in zwei Medien, ergänzt mit 0,2 mikromolare Retinsäure und eine mikromolare Urhungersnot. Nach acht Tagen in Kultur exprimiert die Mehrheit der Embryokörper GFP und ist bereit, mit Trypsinaugen disaggregiert zu werden und die Zellen wie zuvor zu zählen.

Dann reanimation suspendieren sie bei 3,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter. Im OPC-Medium werden drei Milliliter der Suspension im OPC-Medium reflatiert. Mit Hilfe von Poly-Ornithin-beschichteten 60-Millimeter-Schalen werden die Zellen etwa jede Woche konfluent und sehen so aus wie dieser Durchgang zu den Zellen wie zuvor mit einer dreiminütigen Trypsinisierung.

30 Tage nach der ursprünglichen Reanimationssuspension. Im KSR-Medium zeigen die Zellen Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, um Spiking OPCs zu erzeugen. Verwenden Sie von Maus-ESL abgeleitete OPCs, die zwischen 50 und 70 % konfluent sind.

Tauschen Sie das Medium gegen ein XPBS aus, um die Zellen zu spülen. Zum Einbringen von spannungsgesteuertem Natrium. Alpha-Untereinheit Kanal 1.2.

Wir verwenden das hintere MAM-Natriumkanal-Kit. Mischen Sie einen Milliliter der Rücken-MAM-Komponente A mit vier Millilitern eines XPBS. Entfernen Sie die PBS-Spülung und fügen Sie die verdünnte Komponente hinzu.

Eine Inkubation bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Ersetzen Sie den Back-Memory-Agent durch ein OPC-Medium, das mit den Komponenten B und C erweitert wurde, wie im Kit beschrieben. Die Anleitung inkubiert weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Ersetzen Sie nach der Inkubation das verbesserte Medium durch frisches OPC-Medium. Nach weiteren 24 Stunden Kultur können die ESL-abgeleiteten OPCs zu diesem Zeitpunkt auf Spiking getestet werden. Die EBS zeigen keine GFP-Fluoreszenz.

Die EBS zeigen eine starke GFP-Expression und sind nach der ursprünglichen Reanimationssuspension etwa 30 Tage lang bereit für die Disaggregationskultivierung. Im KSR-Medium ist die Mehrheit der Zellen immunpositiv für die NG-2-Färbung, was mit der GFP-Expression übereinstimmt. Im Gegensatz zu OPCs des Gehirns können diese von MES-Zellen abgeleiteten OPCs jedoch selbst dann keine Aktionspotentiale auslösen, wenn die Zellen auf null Millivolt depolarisiert sind.

Nach der Einführung der NAV 1.2-Untereinheit durch virale Transduktion werden diese von MES-Zellen abgeleiteten OPCs angeregt und feuern Aktionspotentiale ab. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie embryonale Stammzellen der Maus in OPCs differenzieren und durch virale Transduktion Spiking OPCs erzeugen können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, die Retinoidsäure pro Morphin und FGF zwei richtig zu lagern und immer frische Aliquots zu verwenden, entsorgen Sie alle zusätzlichen t Retinoidsäure nach Gebrauch.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.