Name: In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Zentrifugation von Drosophila-Embryonen zur Dichte-Trennung von Organellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für Kolokalisations-Experimente und biochemische Analysen.

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Wir bedanken uns bei Susan Gerbi, Heidi Smith und David Lambert für die Versorgung Material in-vivo-Zentrifugation auf Sciara coprophila und Ilyanassa obsoleta, verglichen. Wir danken Mitglieder der Welte-Labor für die Kommentare auf die Technik und Handschrift. Entwicklung und Verfeinerung der in-vivo-Assay wurde durch Zentrifugation NIGMS gewähren GM64687 zu MAW unterstützt. Die Bilder in Abb.. 1 und Abb.. 5E wurden F bisher 2 veröffentlicht und sind hier mit freundlicher Genehmigung abgedruckt.

<ol><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).</li>
<li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).</li>
<li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((unpublished+observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">unpublished observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).</li>
<li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport%3A+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li>
<li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+XXII%3A+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Embryology%22%5BJournal%5D)">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li>
</ol>

Kritische Schritte Stellen Sie sicher, dass der Agar-Konzentration hoch genug ist. Wenn es zu niedrig ist, wird der Agar während der Zentrifugation zerfallen, und die Embryonen platzen oder zufällig orientiert. Wenn der Agar-Konzentration ist nur etwas zu niedrig ist oder wenn der Agar ist nass (unzureichend getrocknet oder unzureichende Entfernung von überschüssigem TSS in Schritt 4,3), werden die Embryonen float aus ihren Löchern während des Laufs und werden falsch ausgerichtet. Wenn der Agar zu dünn gegossen ist, wird es auch zusammenbrechen oder Crack während der Zentrifugation. Stellen Sie sicher, dass Embryonen nicht über Zellularisierung Stadien fortgeschritten. Anderenfalls wird die Trennung von Organellen nicht funktioniert (Abb. 5C) seit Organellen wird sequestriert in Tausenden von einzelnen Zellen. In jüngeren Embryonen auf der einen Zell-Stadium sind Organellen frei, um große Strecken wandern und reichern sich entsprechend ihrer charakteristischen Dichte. Um zu vermeiden, zu analysieren Embryonen, die zu alt sind, stellen Sie sicher, (i) eine Pre-Collection, damit Frauen, alte Eier (Schritt 2,4), (ii) zu sammeln Embryonen für 3 Stunden oder weniger (Schritt 2,5), (iii) lagen visuell auswählen Embryonen vor Zellularisierung Stadien für die Einbettung in Agar (Schritt 4,2), (iv) halten die Einbettung der Zeit kurz ist, um die Entwicklung bis zum Ende des Zellularisierung (Schritt 4,6) zu verhindern, und (v) zu verwerfen Embryonen, die nicht korrekt Schicht (Schritt 5,6) . Sie sparen nicht auf die Zentrifugationszeit. Obwohl einige der Embryonen schöne Schichtung auch nach nur 10 Minuten Zentrifugation zeigen, ist die Trennung inkonsistent vom Embryo zum Embryo. 30 min dreht geben sehr konsistente Ergebnisse. Auch, desto länger die Zentrifugation Zeit, je länger die Schichten stabil sind nach der Zentrifugation wurde beendet. Dies ist für diejenigen Anwendungen, bei denen es braucht Zeit, um die Embryonen weiter verarbeiten vor Gebrauch wichtig (z. B., wenn sie für die Transplantation Versuche verarbeitet werden oder angebracht zum konfokalen Analyse benötigen). Mögliche Änderungen Eiersammlung und Chorion Entfernung Viele verschiedene Protokolle gibt es für die Schritte 2 und 3 1, 3, 9, und wird ebenso wie Arbeiten der hier beschriebenen, solange die Embryonen verwendet jung sind, ist Ei Ausbeute hoch, und der Anteil der mis- inszeniert Embryonen wird minimiert. Anterior-posteriore Ausrichtung Das Protokoll orientiert alle Embryonen, so dass das hintere Ende in der Agar ist begraben und am vorderen Ende ist (Abb. 3). Diese Orientierung ist gut für die Konsistenz, so dass es möglich ist, die Mikropyle als Landmarke, die am Ende während der Zentrifugation (Abb. 1, 5) wies verwenden. Doch mit der Praxis ist es einfach, wählen Sie die Ausrichtung des zentrifugiert Embryonen durch die unterschiedliche Aussehen der Lipid-Tröpfchen und Eigelb Schichten von Hellfeld-Mikroskopie. Dann wird es möglich, Embryonen mit einem Ende auffahren; diese Flexibilität beschleunigt die Montage-Prozess. Unorientierten Zentrifugation Die-zeitaufwendig und technisch anspruchsvollen Aspekt des Protokolls ist die Montage des Embryos in Agar (Schritt 4). Es erfordert berühren Embryo zweimal (einmal, um sie in das Loch und einmal, um es nach der Zentrifugation zu erholen). Als Alternative kann man Embryonen im Schritt 4.1 Transfer in Reaktionsgefäßen mit TSS gefüllt. Wenn diese Rohre in einer Mikrozentrifuge (13.000 rpm, 10-30 min) werden zentrifugiert, Embryonen wird in der Regel auch Schicht gut 10-13. Diese Variante ermöglicht es, Hunderte von Embryonen zur gleichen Zeit sehr schnell zu verarbeiten. Allerdings ist Schichtung nicht so konsequent, nur einen Bruchteil der Embryonen nicht entwickeln unterschiedliche Schichten trotz wesentlich höheren Zentrifugalkräften (~ 16.000 g) als in dem Protokoll über aufgetragen. Anspruchsvoller ist die Tatsache, dass die Ausrichtung der Embryonen Variable ist, und man kann die Trennung in verschiedenen Winkeln zu den großen Embryo Achse zu beobachten. Diese Variabilität erfordert die Versuchsleiter zu klären, nach der Zentrifugation, wie ein bestimmter Embryo im Zentrifugenglas wurde angeordnet. Mit dem Einsatz des Dotters Autofluoreszenz als Marker für die-dichte Teil des Embryos, ist dies oft möglich, obwohl es viel Übung und mehr Urteil, um es sicher zu tun erfordert. Wenn es genügend Embryonen in der Probe vorhanden sind, kann man in der Lage sein zu klären, die Fälle, in denen Embryonen geschehen, wie in Abb. arrangiert werden. 1. Zentrifugation von Embryonen in ihren Eierschalen Es ist möglich, Embryonen in Agar für Schritt 4 einzubetten, ohne den Chorion ersten 2. In diesem Ansatz werden Embryonen für die Sammlung Platte mit Halocarbonöl anstelle von 50% Bleichmittel in Schritt 3,2 (Halogenkohlenwasserstoff wird das Chorion transluzent) abgedeckt. Embryonen von geeigneten Stufen gewählt werden und auf eine neue Agarplatte mit einer Pinzette, durch Greifen nur das Ei Filamente mit der Pinzette, Schäden ander Embryo richtige ist vermieden. Die Embryonen werden wie in Schritt 4.4 durch 4,8 eingebettet, mit der vorderen Ei Filamente ragte aus dem Loch in der Agar. Die Eierschale ist um 50% Bleichmittel Behandlung entfernt werden, nachdem die Embryonen zentrifugiert wurde und aus dem Agar als in Schritt 5.4 gegraben. Zentrifugation in der Gegenwart der Eischale kann zur Verbesserung der Rate von devitellinization nach der Fixierung (Schritt 6.2), aber die Auswahl der richtigen Stadien für die Zentrifugation (Schritt 4.2) ist eine größere Herausforderung. Anwendungen Embryo Zentrifugieren ist besonders nützlich für Kolokalisation Experimente, dh zu testen, ob ein bestimmtes Protein lokalisiert zu einem gewissen wichtigen Organellen. Zum Beispiel der Klar-Proteins an der frühen Embryonalentwicklung Lipidtröpfchen wird, ist noch dieser Lokalisation eine Herausforderung, in intakten Embryonen zu demonstrieren. Zum Teil ist dies, weil sowohl Klar puncta und Fetttröpfchen in den Embryo Peripherie 10 sind reichlich vorhanden, so dass störende Kolokalisation schwer auszuschließen. Allerdings konzentriert sich Zentrifugation Fetttröpfchen in eine deutliche Schicht, und somit wird Kolokalisation mit Klar-Signal auf der Hand 10. Ähnliche Analyse hat eindeutig die Lokalisierung von anderen Proteinen zu Lipidtröpfchen 8, 13-15, darunter überraschende Beispiele wie bestimmte Histone 2 und in Fällen, in denen ein Protein vorhanden ist ubiquitär nachgewiesen, sondern bereichert auf Lipidtröpfchen 8. Als Embryonen können optisch durch Entwicklungsstadium (Schritt 4,2) gewählt werden, ist es sogar möglich, entwicklungsregulierten Rekrutierung von Proteinen an Lipidtröpfchen 8, 15 zu erkennen. Testing für Kolokalisation mit Fetttröpfchen ist besonders einfach, da die Fetttröpfchen in eine optisch deutliche &quot;cap&quot; akkumulieren, so dass keine weiteren Marker oder Flecken ist erforderlich, um diese Schicht zu identifizieren. In der Tat, wegen seiner Leichtigkeit und potenziell auffälligen optischen Ergebnisse (Abb. 1, Abb.. 5 D, E), beschäftigt unser Labor diese Technik nun routinemäßig als ein erster Test, ob ein Kandidat Protein Lipidtröpfchen lokalisiert ist. Im Prinzip sollte ähnlich Kolokalisation Studien für die anderen Organellen in Abb. arbeiten. 1, und wahrscheinlich für andere (einschließlich intrazelluläre Parasiten), deren Verteilung in zentrifugiert Embryonen ist noch nicht dokumentiert werden. Da Zentrifugation konzentriert Organellen in engen Bändern, erleichtert es Isolierung einer Fraktion in dieser Organellen angereichert. Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um die Fetttröpfchen zur Transplantation in Spender Embryonen 2. Datenwiederherstellung. Es kann auch möglich sein, biochemisch analysieren die angereicherte Fraktion (zB durch Abschneiden Schichten aus Embryonen nach der Fixierung 15). Die hier beschriebene Methode hat Anwendungen jenseits Drosophila-Embryonen, wie Zentrifugation kann verwendet werden, um die Eier der vielen verschiedenen Arten (einschließlich Frösche, Nematoden, Manteltiere, Ringelwürmer, Seeigel, Muscheln und Nesseltiere) 16 schichten werden. In unserem eigenen Labor haben wir das Protokoll oben für Embryonen von der Stubenfliege Musca domestica 2 verwendet und eingesetzt unorientierten Zentrifugation in der Analyse von Embryonen aus der Trauermücke Sciara coprophila 17 und die Schnecke Ilyanassa obsoleta 17. Schließlich ist diese Methode nicht für Embryonen beschränkt: Die Zentrifugation kann auch sinnvoll sein, andere große Zellen, wie Oozyten (zB in Drosophila 2, 18 und die milkweed bug Oncopeltus fasciatus 17) schichten. Für verschiedene Muster, müssen die genauen Zentrifugation Bedingungen optimiert werden: Zum Beispiel ist 10 Minuten bei 3000 g ausreichend ist, um effizient zu schichten Embryonen von Musca domestica 2, und wenn zentrifugiert viel länger, neigen die Embryonen auseinander zu brechen während der Fixierung und Immunfärbung.

<table><tbody><tr><td>60x15 mm Petrischalen</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Von Falcon</td></tr><tr><td>Drahtgitter</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>Edelstahl Typ 304; Maschenweite #150 x150, Drahtdurchmesser: 0,0026 Zoll</td></tr><tr><td>Wolfram-Nadeln</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0,25 mm</td></tr><tr><td>Moria vernickelter Nadelschaft/Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenkäfige</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 oder 59-101</td><td>Für Petrischalen mit 65 mm bzw. 100 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Halocarbon-Öl 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo-zentrifugation von drosophila embryonen

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Eine wichtige Strategie zur Reinigung und Isolierung verschiedener intrazellulären Organellen ist, sie voneinander zu trennen basierend auf Unterschieden in Schwebedichte. Allerdings, wenn die Zellen vor der Zentrifugation, Proteinen und Organellen in dieser nicht-native Umgebung gestört werden oft fälschlicherweise aneinander kleben. Hier beschreiben wir eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in intakten, lebenden Drosophila-Embryos. Frühe Embryonen vor Zellularisierung sind aus Käfigen Bevölkerung geerntet, und ihre äußeren Eierschalen werden durch Behandlung mit 50% Bleichmittel entfernt. Die Embryonen werden dann zu einem kleinen Agarplatte und eingefügt, hinteren Ende zuerst, in kleinen vertikalen Löcher in den Agar übertragen. Die Platten mit eingebetteten Embryonen werden für 30 min bei 3000g zentrifugiert. Der Agar unterstützt die Embryonen und hält sie in einer definierten Orientierung. Anschließend werden die Embryonen aus dem Agar mit einer stumpfen Nadel gegraben. Zentrifugation trennt wichtigsten Organellen in verschiedene Schichten, eine Schichtung gut sichtbar von Hellfeld-Mikroskopie. Eine Reihe von fluoreszierenden Markern zur Verfügung stehen erfolgreiche Schichtung in lebenden Embryonen zu bestätigen. Proteine ​​mit bestimmten Organellen assoziiert wird in einer bestimmten Schicht angereichert werden, zeigt Kolokalisation. Einzelne Schichten können zur biochemischen Analyse oder Transplantation in gespendeten Eizellen gewonnen werden. Diese Technik ist für Organelle Trennung in anderen großen Zellen, einschließlich der Eier und Eizellen von verschiedenen Arten.

Wir beschreiben eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in lebenden<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen. Die Embryonen werden in Agar eingebettet und zentrifugiert. Diese Technik liefert reproduzierbare Trennung von wichtigen Organellen entlang der anterior-posterior Embryo-Achse. Diese Methode erleichtert die Kolokalisation Experimente und liefert Organelle Fraktionen für die biochemische Analytik und Transplantation Experimente.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

Eine wesentliche Strategie zur Reinigung und Isolierung verschiedener Arten intrazellulärer Organellen besteht darin, diese aufgrund von Unterschieden in ... voneinander zu trennen.

Die Trennung der wichtigsten Organellen in Fruchtfliegen-Eiern nach Dichte beginnt mit der Gewinnung von Embryonen, die weniger als drei Stunden alt sind. Die Eischalen werden anschließend durch Inkubation in 50 % Bleiche nach der Dekontamination entfernt. Embryonen mit definierten Entwicklungsstadien werden in Agar montiert.Im letzten Schritt werden die Embryonen zentrifugiert und gewonnen, wobei die gewonnenen Embryonen mit hellem Licht und Fluoreszenz untersucht werden. Die Mikroskopie zeigt die Lokalisation spezifischer Proteine in bestimmten Organellen. Eine wichtige Strategie zur Reinigung und Isolierung intrazellulärer Organellen besteht darin, sie nach Dichte von allen anderen zellulären Bestandteilen zu trennen, doch hierbei besteht eine Herausforderung: Vor der Zentrifugation werden die Zellen disruptiert, wodurch Proteine und Organellen, die normalerweise getrennt sind, miteinander in Kontakt kommen.Mayas verklumpen unter diesen nicht nativen in-vitro-Bedingungen. Umgekehrt könnten einige Proteine von Strukturen abfallen, an die sie normalerweise binden. Der Hauptvorteil der Technik, die wir beschreiben werden, liegt darin, dass sie eine Trennung nach Dichte in vivo ermöglicht.Dadurch wird vermieden, dass Zellen aufgebrochen werden, und den damit verbundenen Artefakten. Diese Methode kann helfen, zentrale zellbiologische Fragestellungen zu beantworten. Sie vereinfacht Kolokalisationsexperimente erheblich und ermöglicht die Isolierung spezifischer Organellfraktionen für Transplantationsversuche sowie für biochemische Analysen.Bei diesem Verfahren wird ein Agar-Medium mit hohem Anteil an Apfelsaft hergestellt und gemäß der beigefügten schriftlichen Anleitung in Petrischalen ausgegossen. Die Platten werden sowohl für den Eiablage-Schritt als auch für das anschließende Einbetten und Zentrifugieren der Embryonen verwendet. Dieses Verfahren beginnt mit der Sammlung der Eier.Zunächst bereiten Sie eine Hefepaste zu, indem Sie Trockenhefe mit Wasser zu einer beschichtungsähnlichen Konsistenz verrühren. Anschließend bedecken Sie einen Teil einer frischen Agarplatte mit Apfelsaft vollständig mit der Hefepaste. Adulte Fliegen werden in Käfigen gehalten, an deren Boden die Agarplatten befestigt sind.Um die aktuelle Platte zu entfernen, stülpen Sie den Fliegenkäfig um und schlagen Sie ihn mehrmals auf die Laborbank. Dadurch fallen die Fliegen nach unten und sind für einen kurzen Moment desorientiert. Ersetzen Sie die alte Agarplatte schnell durch eine frische Platte, die mit der Hefepaste überzogen ist.Die Hefe liefert die Nährstoffe für die Eiablage und induziert zusammen mit dem Apfelsaft im Agar die Schichtung der Eier. Verwerfen Sie die Eiersammlung der ersten 30 bis 60 Minuten. Sie ergibt einen hohen Anteil falsch gestagter Embryonen, da sie nach der Befruchtung von den Weibchen zurückgehalten wurden.Spätere Eiersammlungen bestehen in der Regel hauptsächlich aus Eiern, die kurz nach der Befruchtung abgelegt wurden. Sammeln Sie die Eier bis zu drei Stunden lang, da die gleichmäßigste Schichtung in jungen Embryonen erreicht wird. Kürzere Sammelzeiten von einer Stunde oder weniger sind vorzuziehen.Verwenden Sie für Routineexperimente eine Pinzette, um Fliegen zu entfernen, die am Hefeansatz oder an der Oberfläche der Agarplatte haften. Nach dem Sammeln der Eier fahren Sie fort, indem Sie das Ei und die Eihülle entfernen, die Agarplatte unter ein Stereomikroskop stellen und die Embryonen mittels Durchlichtbeleuchtung beobachten. Stellen Sie sicher, dass Sie die Eifilamente identifizieren, um die Eihülle von den Embryonen zu entfernen.Spritzen Sie 50 %ige Bleichlösung unter die Agarplatte, sodass die Embryonen bedeckt sind, und inkubieren Sie mehrere Minuten lang. Schwenken Sie die Agarplatte gelegentlich, um die Embryonen in der Bleichlösung zu bewegen. Untersuchen Sie die Eier erneut unter dem Mikroskop. Sobald die Eifäden nicht mehr sichtbar sind, wurde der Corian erfolgreich entfernt. Dies erfordert typischerweise drei bis fünf Minuten der Inkubation mit der Bleichlösung. Anschließend verwenden Sie einen Drahtsiebbehälter als Sieb, um die Embryonen von der Bleichlösung zu trennen.Der Korb wird aus einem zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großen Quadrat einer Drahtgitter-Flachfolie hergestellt, das in der Mitte eingedellt ist. Greifen Sie den Drahtkorb mit einer Pinzette und halten Sie ihn über den umgedrehten Deckel der Agarplatte. Gießen Sie die Bleichmittel-Embryo-Suspension von der Agarplatte durch das Drahtgitter, wobei die Flüssigkeit in den Deckel der Agarplatte abläuft.Wenn Embryonen auf der Agarplatte verbleiben, spritzen Sie destilliertes Wasser auf die Platte, um sie zu lösen, und gießen Sie die Suspension aus destilliertem Wasser und Embryonen durch das Drahtsieb. Berühren Sie die Unterseite des Drahtsiebs mit einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit abzusaugen. Spritzen Sie anschließend destilliertes Wasser entlang des Randes des Drahtkorbs, um die restlichen Bleichmittelrückstände abzuwaschen und gleichzeitig den Verlust von Embryonen zu minimieren.Überschüssige Flüssigkeit häufig abtupfen. Den Waschschritt fünf bis zehn Mal wiederholen, bis sämtliches Bleichmittel entfernt ist. Wenn der Drahtkorb noch nach Bleichmittel riecht, die Embryonen weiterhin waschen.Nachdem die Embryonen ausreichend gewaschen wurden, können sie in Agar eingebettet werden. Spülen Sie die Embryonen aus dem Drahtkörbchen mit TSS in eine leere Petrischale, wobei der Embryo auf den Boden sinken sollte.Unter einem Stereomikroskop die Embryonen durch Durchlichtbeleuchtung beobachten. Bestimmte Stadien können leicht visuell erkannt werden. Mit einer P-200-Pipette Embryonen der gewünschten Stadien auswählen und auf eine kleine Agarplatte übertragen.Arbeiten Sie schnell, da die Embryonen altern und eine längere Eintauchzeit von mehr als 30 Minuten in TSS die Entwicklung beeinträchtigen kann, wenn ein Pipettiergerät verwendet wird. Unter Kim-Wisch entfernen. Entfernen Sie den größten Teil des TSS.Die Oberfläche des Agars sollte leicht feucht sein, was das Verschieben der Embryonen erleichtert. Es dürfen jedoch keine Flüssigkeitslachen auf der Platte verbleiben, da überschüssige Flüssigkeit während der Zentrifugation dazu führen kann, dass die Embryonen aus den Löchern rutschen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist das Einbetten der Embryonen und des Bohrers.Dies ist besonders herausfordernd, da die Embryonen empfindlich sind und leicht beschädigt oder zu grob behandelt werden können. Um dies zu vermeiden, muss die Nadel langsam, gezielt und in kleinen Schritten bewegt werden. Die beste Methode, um herauszufinden, wie viel Druck und Berührung der Embryo aushalten kann, ist Übung. Montieren Sie die Zange und die Nadel rückwärts in einen Nadelhalter, sodass das stumpfe Ende herausragt, während Sie beobachten.Unter dem Mikroskop mit der Nadel vertikale Löcher in das Agar in der Nähe jedes Embryos stechen, um gleichzeitig unter dem Mikroskop beobachten zu können, wie das Loch in das Agar gestochen wird. Die Nadel wird dabei schräg gehalten. Daher ist es schwierig, die Löcher perfekt vertikal zu stechen. Allerdings erzeugt die leichte Neigung der Nadel eine geringfügige Vertiefung oder Rille auf einer Seite des Lochs, sodass der Embryo leicht entlang dieser Rille gleitet und in das Loch hineinrutscht.Als Nächstes identifizieren Sie die vordere und hintere Seite der länglichen Embryonen, da der Embryo in konsistenter Orientierung in die Löcher geschoben werden sollte. Typischerweise mit dem vorderen Ende nach oben wird die ign-Membran am vorderen Ende durch eine spezialisierte Struktur charakterisiert. Der Mikropfahl, unter Verwendung des stumpfen Endes der Nadel, schiebt den Embryo, um ihn entlang des Agars zu bewegen und sein hinteres Ende in Richtung eines durchstochenen Lochs auszurichten und zu manövrieren.Dann drücken Sie das vordere Ende in Richtung der Öffnung. Das Embryo sollte leicht entlang der leichten Vertiefung, die beim Durchstechen entstanden ist, in die Öffnung gleiten. Während das Embryo nach oben kippt, schieben Sie es weiter in die Öffnung hinein.Das Agar ist weich genug, sodass, sobald ein Embryo teilweise in ein gestochenes Loch eingeführt wurde, er weiter hineingedrückt werden kann, ohne Schaden zu nehmen. Wenn er vollständig eingedrückt ist, steht der Embryo gewöhnlich bereits ziemlich senkrecht. Falls nicht, richten Sie den eingeführten Embryo senkrechter aus, indem Sie seitlich gegen ihn drücken.Falls das Loch nicht zu groß ist, wird die Embryonenposition während der Zentrifugation durch das Agarosegel stabil gehalten. Mit etwas Übung ist es möglich, 100 bis 250 Embryonen pro Platte einzubetten. Die benötigte Anzahl an Embryonen hängt von der nachfolgenden Anwendung ab.Halten Sie die Montagezeit kurz. Wenn ein enger Entwicklungszustand gewünscht ist, da sich die Embryonen während der Montage weiterentwickeln, entfernen Sie überschüssige, nicht verwendete Embryonen mit einer feuchten Bürste. Danach werden die in Agar montierten Embryonen in eine Zentrifuge gegeben.Überführen Sie die Platten mit den Fliegenembryonen in die Schwinggefäße des Zentrifugenrotors, wobei die Agarseite nach unten zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge ausgewogen ist, und zentrifugieren Sie die Platten bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei vier bis 10 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation stellen Sie die Agarplatte unter das Stereomikroskop und bedecken sie mit einer Schicht von TSS, wobei Sie das stumpfe Ende der Nadel verwenden.Heben Sie die Embryonen aus ihren Vertiefungen aus. Die Embryonen schwimmen in der TSS, bleiben aber untergetaucht. Die Embryonen zeigen deutlich erkennbare Schichten mit einer braunen Kappe am vorderen Ende, einem klaren mittleren Bereich und einem dunkelgrauen Bereich am hinteren Ende.Verwerfen Sie Embryonen, die keine deutliche Schichtung für die direkte Beobachtung mittels Hellfeld- oder Epi-Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um gut geschichtete Embryonen in TSS in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Übertragen Sie die Embryonen dann in Puffer auf einen Objektträger und montieren Sie sie wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben.Wenn die Embryonen fixiert werden sollen, überführen Sie mit einer P-200-Pipette gleichmäßig geschichtete Embryonen in TSS in ein Szintillationsfläschchen. Fixieren Sie die Embryonen mithilfe standardmäßiger Fixierungstechniken. Da bei Zentrifugation die Effizienz der Devitalisierung gering ist.Verwenden Sie so viele Embryonen, wie praktikabel ist. Falls die Embryonen in Transplantationsversuchen eingesetzt werden sollen, überführen Sie die Embryonen auf Agarplatten und montieren Sie sie auf Deckgläsern. Unter Anwendung standardisierter Verfahren zum Umgang mit Embryonen, auf die in der schriftlichen Anleitung verwiesen werden kann.Die durch Zentrifugation hervorgerufene Schichtung ist mehrere Minuten lang stabil. Hier sind Aufnahmen im Hellenlicht von lebenden Oph-Embryonen vor der Zentrifugation, wobei das vordere Ende links und das hintere Ende rechts dargestellt ist, mit der dorsalen Seite oben und der ventralen Seite unten. Embryonen im Furchungsstadium erscheinen gleichmäßig. Braune Stadien wie dieses sind ideal für die In-vivo-Zentrifugation. Blaster-Derm-Embryonen weisen einen klaren Rand auf, der auf allen Seiten ähnlich aussieht. Dieser klare Randbereich erweitert sich bis nahe zum Ende der Ionalisierung.Embryonen können durch Zentrifugation erfolgreich stratifiziert werden, bis zum Ende der ization. Die Schichtung von Dottersack und Kernen ist nicht so konsistent wie in den Furchungsstadien. Nachdem zelluläre Embryonen asymmetrisch erscheinen, werden die dorsalen und ventralen Ventrale deutlich und verschiedene Falten entwickeln sich.Das gezeigte Embryo befindet sich in einem frühen Stadium der Keimbahnverlängerung. In diesen Entwicklungsstadien ist die Zentrifugation nicht mehr wirksam bei der Schichtung der wichtigsten Organellen. Die Embryogenese ist ein Kontinuum.Daher sind diese Stadien keine diskreten Entitäten, sondern gehen während der Entwicklung ineinander über. Dieser Zeitraffervideo zeigt vier Stunden Embryogenese, beginnend ab den Furchungsstadien. Die Ausdehnung der Keimbahn ist um das 720-fache beschleunigt.Hier sind Bilder von Zentrifugen-Embryonen, die mit Durchlichtaufnahme aufgenommen wurden. Der Embryo links hat sich gut geschichtet. Die Lipidtröpfchen mit geringer Dichte bilden eine Lipidschicht an der vordersten Spitze.Die Yolk-Vehikel mit hoher Dichte sammeln sich als dunkelgraue Zone am hinteren Ende an. Diese beiden Schichten sind durch einen breiten klaren Bereich getrennt, der andere Organellen und Zytoplasma darstellt. Der Embryo rechts wurde nach der IZATION zentrifugiert.Die Schichtung ist minimal, wenn ein Epi-Fluoreszenzmikroskop verfügbar ist. Diese lebenden, zentrifugierten Embryonen können unter UV-Anregung untersucht werden, wobei das Eiweiß intensive blaue Wasserfluoreszenz zeigt. Eine kompakte Schicht aus autofluoreszierendem Material am hinteren Pol weist auf eine erfolgreiche Zentrifugation hin und dient als Marker für das hintere Ende.Das Erscheinungsbild der Schichten verändert sich drastisch, wenn die Embryonen fixiert werden. Die Lipidtröpfchen werden durchscheinend, und die Lipidschicht erscheint im hellen Lichtmikroskop weißlich und flaumig statt dunkelbraun. Die Yolk-Farbstoff-Fluoreszenz wird durch die Fixierung teilweise oder vollständig zerstört und wird dadurch viel schwächer oder sogar nicht mehr nachweisbar.In diesem Bild sind Organellen mit fluoreszierenden Markern gekennzeichnet, und die Marker sammeln sich charakteristisch entlang der anterioren-posterioren Achse an. Bestimmte Histon-Fusionsproteine lokalisierten sich sowohl in Lipidtröpfchen als auch in Kernen und können daher verwendet werden, um diese zellulären Kompartimente zu markieren sowie den Entwicklungsstadium des Embryos anhand der Anzahl der markierten Kerne zu überwachen. Wie Sie gerade gesehen haben, gehört das Einbetten der Embryonen in die Schnecke zu den schwierigsten Aspekten dieses Verfahrens.Doch mit etwas Übung werden Sie dies schnell und effizient durchführen können. Sobald die Technik beherrscht ist, werden ansonsten mühsame Kollokalisationsexperimente sehr einfach.Beispielsweise verwendet unser Labor diese Technik routinemäßig, um mittels Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen, ob ein Protein des Interesses in einem bestimmten großen Organell lokalisiert. Außerdem können einzelne Schichten aus den zentrifugierten Embryonen für biochemische Analysen oder Transplantationsversuche gewonnen werden. Diese Technik ist nicht nur für Fruchtfliegenembryonen nützlich.Die Zentrifugation trennt auch bei anderen Arten die Organellen nach Dichte in den Eiern sowie in anderen großen Zelltypen wie Zytos.

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