Name: Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die Beladung von Nanosphären auf Mikrotubuli für nanoskalige Transportsysteme mit Kinesin-Motorproteinen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Forschung in Biophysik und Nanotechnologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind hoch verschuldet, um Jonathon Howard, dessen Gruppe entwickelte das grundlegende Protokoll für eine gleitende Beweglichkeit Assay, der anschließend von uns angepasst wurde. Finanzielle Unterstützung von NSF gewähren DMR0645023 gedankt.

1). Puffer und Reagenzien Diese Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden und in handliche Portionen. Ein Aliquot sollte genügend Lösung für ein typisches Experiment und ein frisches Aliquot sollte für jede Motilität Assay verwendet werden. Die Lagerbedingungen und die typischen aliquoten Größen sind auch in den folgenden Protokollen erwähnt. 1. BRB80 Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionisiertem destilliert (dd) Wasser, pH-Wert eingestellt auf 6,9 von KOH) <ul><li> Überlegen Sie sich einen 100-ml-Stammlösung von 0,5 M EGTA in dd Wasser. Der pH-Wert auf 7,0 mit 2 M NaOH-Lösung. </li><li> Überlegen Sie sich einen 100-ml-Stammlösung von 1 M MgCl 2 in dd Wasser. Autoclave die Lösung. </li><li> Add 24,2 g von Rohren und 3,1 g KOH-Pellets in ca. 800 ml dd Wasser und rühren sich aufzulösen. Der pH-Wert auf 6,9 mit 1 M KOH-Lösung. Add 2 mL 0,5 M EGTA Stammlösung und 1 ml 1 M MgCl 2-Stammlösung. Bringen Sie auf ein Volumen von 1000 ml mit dd Wasser. </li><li> Aliquot in 50 mL Falcon-Röhrchen und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. Die BRB80 Rohr derzeit verwendet werden können bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur gelagert werden. </li></ul> 2. Magnesiumchlorid, MgCl 2 (100 mM in dd Wasser) <ul><li> Verdünnen Sie in dd Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zu erreichen. </li><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung </li></ul> 3. Guanosin-5'-Triphosphat, Dinatriumsalz, GTP (25 mM in dd Wasser, pH-Wert auf 7 mit NaOH) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in dd Wasser und den pH-Wert auf 7 mit 2 M NaOH-Lösung. </li><li> Überprüfen Sie durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm. (Verwenden Sie ein Extinktionskoeffizient von 11,7 x 103 M -1 cm -1). </li><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 4. Dimethylsulfoxid, DMSO <ul><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 5. Taxol (1 mM in DMSO) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in DMSO unter Abzug bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 6. D-(+)-Glucose, (2 M in dd Wasser) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in dd Wasser bis zu einer Endkonzentration von 2 M erreicht </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 7. Glucose-Oxidase, (2 mg / mL in BRB80) <ul><li> Man löst in BRB80 bis zu einer Endkonzentration von 2 mg / mL zu erreichen. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M in dd Wasser) <ul><li> Man löst in dd Wasser unter Abzug bis zu einer Endkonzentration von 1 M. zu erreichen </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 9. Catalase, (0,8 mg / mL in BRB80) <ul><li> Man löst in BRB80 in mindestens 2 Stufen bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mg / mL zu erreichen. Bestimmen Sie die Konzentration in jeder Phase durch Messung der UV-Absorption bei 276 nm und 406 nm (Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 3,1 x 10 5 M -1 cm -1 bei 276 nm und 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 bei 406 nm und der Gleichung A = cL). </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 10. Adenosin-5'-Triphosphat, ATP (100 mM in 100 mM MgCl 2) <ul><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM MgCl 2 in dd Wasser. Abwiegen Trockenpulver und lösen sich in dieser Stammlösung zu einer Endkonzentration von 100 mM zu erreichen. </li><li> Überprüfen Sie durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm. (Verwenden Sie ein Extinktionskoeffizient von 15,4 x 10 3 M -1 cm -1). </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 11. Casein-Lösung (20 mg / ml Casein in BRB80) <ul><li> Fügen Sie etwa 3 g Casein zu 30 mL dd Wasser in einem 50 ml Falcon-Röhrchen. Vortex für ca. 1 Stunde, bis die Lösung entwickelt dicke Konsistenz. </li><li> Zentrifugation bei ca. 15000 g für 30 Minuten. Den Überstand bis 0,5 m und 0,2 &amp;mgr; Spritzenfilter. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der Überstand durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm (Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,67 ml mg -1 cm -1). Verdünnen auf 20 mg / mL in BRB80. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) inbis 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 2.) Standard-Lösungen Diese basieren auf den Tag des Experiments vorbereitet und sollte verworfen, nachdem das Experiment vorbei ist. Bereiten Sie 1 mL jeder. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Verdünnen Casein-Lösung in BRB80 zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 mg / mL und speichert mehr als Eis. Diese Lösung wird in die Messzelle vor Kinesin eingeführt und halten die Kinesin-Aktivität nach Oberflächenadsorption. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Bereiten 0,2 mg / ml Casein und 1 mM ATP in BRB80 und speichert mehr als Eis. Kinesin ist weiter verdünnt mit dieser Lösung vor dem Einleiten in die Durchflusszelle. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Verdünnen Taxollösung in BRB80 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM und bei Raumtemperatur lagern. Diese Lösung wird verwendet, um Mikrotubuli zu stabilisieren. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> Bereiten 10 uM Taxol und 0,2 mg / ml Casein in BRB80 und bei Raumtemperatur lagern. Dies dient der weiteren Vorbereitung der Antifade und Mikrotubuli-Lösungen. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Bereiten 20 mM D-Glucose, 20 ug / mL Glucose-Oxidase, 8 pg / mL Katalase, 10 mM DTT und 20 uM ATP in BRB80CT und bei Raumtemperatur lagern. Diese Lösung wird verwendet, um Streptavidin und Nanokügelchen verdünnen und "wash out" das überschüssige Streptavidin in der Durchflusszelle. Die Kinesin-Geschwindigkeit kann durch Anpassung der ATP-Konzentration in dieser Lösung gesteuert werden. </li></ul> 3). Kinesin Vorbereitung <ul><li> Express ein Kinesin-Konstrukt, bestehend aus dem Wildtyp und in voller Länge Drosophila melanogaster Kinesin heavy chain und eine C-terminale His-tag in Escherichia coli und Reinigung mit einem Ni-NTA-Säule wie in 6 beschrieben. </li><li> Machen Aliquots (10 l pro Stück) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. Die Konzentration der aktiven Kinesin in diesen Aliquots beträgt ca. 200 nM. 7 </li><li> Für ein typisches Experiment, verdünnen das Kinesin-Lösung 20-fach in BRB80CA. Beschriften Sie die Lösung KIN20 und speichert mehr als Eis. </li></ul> 4). Mikrotubuli Vorbereitung <ul><li> In einem 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten 25 ul des Wachstums Lösung: 4 mM MgCl 2, 1 mM GTP und 5% DMSO (v / v) in BRB80 Puffer. </li><li> Add 6,25 ul dieser Lösung zu einem 20 ug Aliquot lyophilisierte biotinylierte Tubulin. </li><li> Vortex, dann in einem Wärmebad bei 37 ° C für 30 Minuten zur Polymerisation. Verdünnen Sie 100-fach in BRB80T und vortexen. Beschriften Sie die Lösung MT100 und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Machen Sie eine 10-fache Verdünnung von MT100 in BRB80AF. Beschriften Sie die Lösung MT1000. </li></ul> 5). Streptavidin und Nanosphere Lösung Bereiten AlexaFluor568-markiertem Streptavidin in einer Konzentration von 100 nM in BRB80AF. Bezeichne STV100 und speichert mehr als Eis. Auch verdünnter Nanokügelchen 5000 fold in BRB80AF Lösung. Bezeichne NS5000 und speichert mehr als Eis. 6). Flow Cell Construction Konstruieren Sie eine Durchflusszelle mit zwei Deckgläser durch doppelseitiges Klebeband getrennt. Diese Messzelle beträgt ca. 2 cm lang, 1 cm breit und 100 pm hoch und hat ein Volumen von etwa 20 ul. Die Lösungen sind in die Messzelle von einer Seite mit einer Pipette und böse von den anderen mit Filterpapier eingeführt. 7). Inverted Assay Assembly Glass Oberfläche wird zuerst mit Kasein die Kinesin, um seine Funktionalität bei der Adsorption behalten können beschichtet. Nach Kinesin adsorbiert wird, sind Mikrotubuli eingeführt, die von Kinesin statt. Mikrotubuli sind dann mit fluoreszierenden Streptavidin beschichtet. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Streptavidin, biotinyliert Polystyrol Fluorescein Nanokügelchen (40 nm Durchmesser) eingeführt. Adsorbiert stationären Nanokügelchen mit dem bewegten Mikrotubuli kollidieren und auf sie (Abbildung 1) geladen werden. Die Reihenfolge der Fluss von Lösungen und die Zeit vor der Einführung der nächsten Lösung erlaubt sind unten aufgeführt. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 Minuten </li><li> KIN20, 5 Minuten </li><li> MT1000, 5 Minuten </li><li> STV100, 5 Minuten </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8). Microscopy Montieren Sie die Messzelle auf dem Mikroskoptisch unmittelbar nach Nanokugel Einführung. In diesem Experiment ein Eclipse TE2000-U Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Melville, NY) mit einem 100X Öl-Objektiv (NA 1,45), ein X-Cite 120 Lampe (EXFO, Ontario, Kanada) und eine iXon EMCCD Kamera (Andor, ausgestattet South Windsor, CT) verwendet wurde. A FITC-Filter cube (# 48001) und einem TRITC-Filter cube (# 48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) wurden image Nanokügelchen und Mikrotubuli respecti verwendetVely auf der unteren Fläche der Messzellen. Die Belichtungszeit betrug 0,2 s, während die Zeit zwischen den Aufnahmen war 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des molekularen Shuttles.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

Mit geringfügigen Änderungen wurde das Protokoll erfolgreich von einer Vielzahl von Gruppen verwendet werden, um Kinesin-Mikrotubuli-basierte Motilität Assays zu montieren. 10 mM DTT in den letzten Motilität Lösung kann mit 0,5% β-Mercaptoethanol ersetzt werden. Standard-Lösungen (BRB80AF, KIN20 und MT1000) mehr als 2 Stunden alt sollte nicht verwendet werden. Jede Lösung enthält Taxol und insbesondere Mikrotubuli sollte niemals auf Eis gelegt werden. Übermäßige Exposition der Messzelle gegen UV-Anregungslicht Ergebniss...

<table><tbody><tr><td>Adenosin-5&amp;rsquo;-triphosphat (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Tubulin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglycol-bis(2-amino&amp;#8211;thylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres biotinylierte Mikrokügelchen, 40 nm, gelb-grün fluoreszierend (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin-5&amp;rsquo;-triphosphat (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazindiethansulfonsäure, Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure), Piperazin-N,N&amp;#8242;-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa-Fluor-568-Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

frachtladesysteme auf kinesin powered molekulare shuttles

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Zellen verfügen über ausgefeilte molekulare Maschinerie entwickelt, wie Kinesin Motorproteine ​​und Mikrotubuli, zu aktiven intrazellulären Transport von Gütern zu unterstützen. Während Kinesine Schwanz Domäne bindet an eine Vielzahl von Ladungen, nutzen Kinesine Kopfdomänen die chemische Energie in ATP-Molekülen gespeichert, um entlang der Mikrotubuli Gitter Schritt. Die langen, steifen Mikrotubuli dienen als Schienen für den Fernverkehr intrazellulären Transport. Diese Motoren und Filamente können auch in mikrofabrizierten synthetischer Umgebungen als Komponenten der molekularen Shuttles 1 eingesetzt werden. In einer häufig verwendeten Design sind Kinesin-Motoren auf die Fahrbahn durch ihre Schwänze verankert, und funktionalisierte Mikrotubuli dienen als Fracht tragenden Elemente, die von diesen Motoren angetrieben werden. Diese Shuttles können mit Ladung durch die Nutzung der starke und selektive Bindung zwischen Biotin und Streptavidin geladen werden. Die wichtigsten Komponenten (biotinylierten Tubulin, Streptavidin und biotinylierten Ladung) sind kommerziell erhältlich. Aufbauend auf den klassischen invertierten Motilität Test 2 ist der Aufbau von molekularen Shuttles detaillierte hier. Kinesin Motorproteine ​​sind an einer Oberfläche mit Kasein vorbeschichtet adsorbiert; Mikrotubuli sind aus biotinylierten Tubulin polymerisiert, haftete an der Kinesin und anschließend mit Rhodamin-markiertem Streptavidin beschichtet. Die ATP-Konzentration ist bei subsaturating Konzentration aufrechterhalten, um ein Mikrotubulus Gleiten Geschwindigkeit optimal für Beladen 3 zu erreichen. Schließlich biotinylierten fluoresceinmarkierten Nanokügelchen als Fracht aufgenommen. Nanospheres an Mikrotubuli legen als Resultat von Kollisionen zwischen Gleiten Mikrotubuli und Nanokügelchen an der Oberfläche haften. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um eine Vielzahl von Ladungen wie biotinylierten DNA 4, Quantenpunkte 5 oder eine Vielzahl von Antigenen über biotinylierte Antikörper 4-6 laden.

Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Zellen haben hochentwickelte molekulare Mechanismen entwickelt, wie beispielsweise Kinesin-Motorproteine und Mikrotubuli-Filamente, um den aktiven intrazellulären Transport zu unterstützen ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Nanosphären auf Mikrotubuli aufzuladen, die auf einer Oberfläche gleiten, die mit Kinasen in Motoren beschichtet ist. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche einer Glas-Flusszelle mit einer Casein-Lösung beschichtet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Kinesin-Motorproteine auf der Oberfläche der Flusszelle zu adsorbieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikrotubuli hinzuzufügen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Hinzufügen der Streptavidin-Moleküle, die an die Mikrotubuli binden, gefolgt vom Hinzufügen der Nanosphären. Die Nanosphären binden an die Oberfläche der Durchflusszelle, wo sie von den Mikrotubuli aufgenommen werden können.Schließlich kann man beobachten, wie Nanosphären von Mikrotubuli aufgenommen und mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie über die Oberfläche transportiert werden. Hallo, ich bin Elaine Jen Smith aus dem Labor von Dr. Henry Hess am Department für Werkstoffwissenschaft und -technik der University of Florida. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den inversen Motilitätsassay.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das Beladen von Fracht auf Mikrotubuli und die Bewegung molekularer Transportvehikel zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens alle Stammlösungen frisch gemäß dem schriftlichen Teil dieses Videos vor.Nachdem die Stammlösungen hergestellt wurden, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikrotubuli, indem Sie 25 Mikroliter Wachstumslösung in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Anschließend geben Sie 6,25 Mikroliter der Wachstumslösung zu 20 Mikrogramm lyophilisiertem biotinyliertem Tubulin hinzu. Vortexen Sie die Lösung und geben Sie sie für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Polymerisation nach der Inkubation zu ermöglichen. Verdünnen Sie die Lösung danach 100-fach in Taxol-Puffer und vortexen Sie vorsichtig.Diese Lösung dient der Stabilisierung der Mikrotubuli. Beschriften Sie die Lösung als leere 100 und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Stellen Sie anschließend eine zehnfache Verdünnung von MT 100 in Anti-Fade-Puffer her und beschriften Sie diese Lösung als MT 1000.Bereiten Sie dann die Kinesin-Motoren vor, indem Sie die Kinesin-Lösung im Verhältnis 1:20 in TP-Puffer verdünnen. Kennzeichnen Sie die Lösung als Kinase in 20 und lagern Sie sie auf Eis. Stellen Sie abschließend die Streptavidin- und Nanosphären-Lösungen her.Fügen Sie zunächst Alexa Fluor 568-markiertes Streptavidin in einer Konzentration von 100 Nanomolar in Antifa-Puffer hinzu. Bezeichnen Sie die Lösung als STV 100, verdünnen Sie die Nanosphären dann 5.000-fach in Antifa-Puffer und kennzeichnen Sie dieses Gemisch als NS 5.000. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis.Nach der Lösungsherstellung für den Frachtbeladungs-Assay wird eine Flusszelle unter Verwendung einer Deckplatte und eines Deckgläschens, die durch doppelseitiges Klebeband getrennt sind, konstruiert. Zunächst werden zwei Streifen doppelseitigen Klebebands an den Rändern der Deckplatte befestigt, wobei ein Abstand von etwa einem Zentimeter zwischen den Streifen verbleibt. Danach wird das Deckglas über das Klebeband gelegt.Üben Sie mit der flachen Kante einer Pinzette Druck auf die Deckglasplatte aus, um eine Dichtung zu erzeugen. Die hergestellte Flusszelle ist etwa zwei Zentimeter lang, einen Zentimeter breit und 100 Mikrometer hoch und hat ein Volumen von etwa 20 Mikrolitern. Um die Montage des Invertierten Assays zu beginnen.Platzieren Sie die Pipettenspitze zwischen Deckglas und Objektträger. Injizieren Sie dann eine Casein-Lösung mit 0,5 Milligramm pro Milliliter in die Flusszelle. Diese Beschichtung der Flusszelle ermöglicht es Kinesin, nach der Adsorption seine Funktionalität beizubehalten.Warten Sie fünf Minuten, damit die Casein-Lösung beschichten kann. Danach adsorbieren Sie Kinesin auf der Flusszelle, indem Sie die Kinase in 20 Lösungen in die Flusszellen einführen, wobei die Lösungen eingeführt werden, indem die Pipettenspitze zwischen Deckglas und Objektträger platziert wird. Dann wird die Lösung von einer Seite in die Flusszelle injiziert, während sie gleichzeitig von der anderen Seite abgezogen wird.Mit Filterpapier fünf Minuten warten, damit das Kinase-In-Markierungsmittel absorbiert werden kann. Danach die Mikrotubuli mittels Pipettieren der MT-1000-Lösung in die Flusszelle einführen. Fünf Minuten warten, damit sich die Mikrotubuli absetzen und an die Kinase-In-Motoren binden können, nachdem die Mikrotubuli an die Kinase-In-Motoren angeheftet wurden.Beschichten Sie die Mikrotubuli mit fluoreszierendem Strep-TTR, indem Sie die STV-100-Lösung in die Durchflusszelle einbringen. Lassen Sie die Strep-TTR-Moleküle fünf Minuten lang an die Mikrotubuli binden. Spülen Sie das überschüssige Strep-TTR aus, indem Sie dreimal je 30 Mikroliter Antifa-Lösung in die Durchflusszelle einbringen.Schließlich werden die biotinylierten Polystyrol-Fluorescein-Nanosphären eingeführt, indem die NS 5.000-Lösung in die Durchflusszelle pipettiert wird. Die Oberfläche absorbiert stationär. Die Nanosphären kollidieren mit den sich bewegenden Mikrotubuli und lagern sich an diese an.In diesem Experiment wird ein Eclipse-TE-2000-U-Fluoreszenzmikroskop mit einem 100×-Ölimmersionsobjektiv, X-Site, einer 20-Lampe und einer Exon-E-M-C-C-D-Kamera verwendet. Tragen Sie zunächst einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv auf. Bringen Sie dann die Durchflusszelle mit Hilfe des Trixy-Filterwürfels auf dem Mikroskoptisch an.Bringen Sie die Mikrotubuli in den Fokus, dann wechseln Sie zum Fitzy-Filterwürfel, um die Nanosphären zu betrachten. Öffnen Sie anschließend das And-or-I-Exon-Programm und stellen Sie den Aufnahmemodus auf kinetisch ein. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, eine Länge der kinetischen Serie von 20 und eine kinetische Zykluszeit von sechs Sekunden.Schalten Sie das Mikroskop vom Okular auf die Kamera um und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Verwenden Sie für die ersten vier Bilder den Trixi-Filterwürfel, um die Mikrotubuli abzubilden. Wechseln Sie für die nächsten 12 Bilder zum Fitz-Filterwürfel, um Aufnahmen der Nanosphären anzufertigen.Danach wieder zum Trixi-Filterwürfel wechseln. Für die letzten vier Bilder zur Abbildung der Mikrotubuli werden die Mikrotubuli mithilfe des Trissy-Filterwürfels beobachtet, der Filterwürfel wird gewechselt zu Fite, um hier die Nanosphären sichtbar zu machen. Mit Pfeilen sind Nanosphären markiert, die von Mikrotubuli transportiert werden. Nicht alle Nanosphären wurden von Mikrotubuli aufgenommen.Nun wird die Position der Nanosphären 36 Sekunden später gezeigt, wobei sich herausstellt, dass sich die Nanosphären verschoben haben. Wenn die Mikrotubuli erneut abgebildet werden, wird deutlich, dass sich auch die Mikrotubuli über das Sichtfeld hinweg bewegt haben. Diese Bilder zeigen, dass die Nanosphären aufgrund des Mikrotubuli-Transports versetzt wurden.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man den invertierten Motilitätstest durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Filterwürfel während der Bildaufnahme zu wechseln, damit sowohl die Mikrotubuli als auch die Nanokügelchen sichtbar sind. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Intrazellulärer Transport von Frachten, wie Vesikeln oder Organellen, wird von molekularen Motorproteinen durchgeführt, die auf polarisierten Mikrotubuli verfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Korrelation der Transportrichtung einzelner Frachtpartikel, die sich innerhalb von Neuronen bewegen, mit der relativen Menge und Art der assoziierten Motorproteine.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Ein neues in vitro-System für die gleichzeitige Laden vier Sehnen in der Kultur beschrieben wird.

Ex vivo mechanische Belastung der Sehnen

Calcium ist ein allgegenwärtiges Botenstoff im Nervensystem, wichtig für die Auslösung die Freisetzung von Neurotransmittern und Veränderungen der synaptischen Stärke. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Ca 2 +-Indikatoren in Drosophila Nervenendigungen. Wir zeigen auch die Herstellung der erforderlichen Geräte und betonen Punkte von entscheidender Bedeutung für die Technik für den Erfolg.

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen. Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der molekularen Chirurgie und Molekulare Medizin dienen.

Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Erfahren Sie die Beladung von Nanosphären auf Mikrotubuli für nanoskalige Transportsysteme mit Kinesin-Motorproteinen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Forschung in Biophysik und Nanotechnologie.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Weitere Videos entdecken