Genomweite Analyse der Aminoacylierung (Charging) Ebenen der tRNA mittels Microarrays

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, relative Veränderungen der tRNA-Ladungsniveaus zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem RNA vor und nach der Behandlung bei niedrigem pH-Wert isoliert wird, um tRNA mit erhaltenen Ladungsniveaus zu gewinnen. Im zweiten Schritt wird die RNA einer Periodat-Oxidationsbehandlung unterzogen, die die Bestimmung der relativen Ladungsniveaus ermöglicht.

Als Nächstes werden die Proben an ein fluoreszierendes Oligonukleotid ligiert und auf einem Microarray hybridisiert, um Änderungen der Ligationsniveaus infolge der A-T-R-N-A-Ladung zu messen; die Ergebnisse werden erhalten. Die genomweiten Änderungen der tRNA-Ladung in CHO-Zellen basieren auf der tRNA-Microarray-Technologie. Hallo, ich bin John Zai aus dem Labor von DRT Pan in der Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie an der Universität Chicago.

Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Messung von beladenen tRNAs auf genomischer Ebene. Wir verwenden dies, um Änderungen in der tRNA-Beladung während Stressbedingungen in unserem Labor zu messen. Beginnen wir also.

Um die gesamte Ladung an tRNA zu isolieren, beginnen Sie mit dem Anzüchten von mindestens dem Äquivalent von 30 OD 600 Hefe-Zellen, wodurch etwa 30 Mikrogramm Gesamt-RNA erhalten werden. Pelletieren Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Lysepufferlösung. Geben Sie ein gleiches Volumen an Natriumacetat und gesättigten Phenyl-Chloroform hinzu und wirbeln Sie die Mischung 30 Sekunden lang im Vortex, gefolgt von einer Kühlung auf Eis für mindestens 30 Sekunden.

Wiederholen Sie das Vortexen und Zerkleinern noch zweimal. Zentrifugieren Sie die Probe bei 18.600 RFC für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann die wässrige Phase und führen Sie nach der zweiten Extraktion eine weitere Phenol-Chloroform-Extraktion mit gesättigter Acetatlösung durch.

Fällen Sie die RNA durch Zugabe von 2,7 Volumina Ethanol und Zentrifugation bei 18.600 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die RNA-Pellets in Pufferlösung für die Lyse und fallen Sie die RNA anschließend ein zweites Mal mit Ethanol aus. Lösen Sie die RNA schließlich in einer Lösung, die 10 Millimolar gepufferten Acetat und 1 Millimolar EDTA enthält, zur anschließenden Behandlung.

Die Probe kann etwa zwei Wochen länger stabil bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Eine Lagerung wird nicht empfohlen, da einige beladene TNA bereits vor der Markierung mit den fluoreszierenden Oligonukleotid-Tags S3 oder SCI fünf zu deacylieren beginnen. Die gesamte tRNA wird einer Paragyrodioxid-Behandlung unterzogen, die die Bestimmung der relativen Ladelevels ermöglicht. Mischen Sie die gesamte RNA mit jeweils 0,066 Mikromolar der eco-tRNA-Standardproben und 100 Millimolar gepuffertem Acetat in Gegenwart von 50 Millimolar Natrium-para-Iodbenzoat. Für die Kontroll-tRNA-Probe, die nicht oxidiert wird, verwenden Sie anstelle von Natrium-para-Iodbenzoat 50 Millimolar Natriumchlorid.

Inkubieren Sie die Reaktionen 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Glukose auf eine Endkonzentration von 100 Millimolar und Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Führen Sie nach dem Stoppen der Reaktion einen Pufferaustausch mittels einer G-25-Spinsäule durch, um verbleibendes Natriumprorat aus den Proben zu entfernen. Fällen Sie die Proben durch Zugabe von gepuffertem Acetat auf eine Endkonzentration von 133 Millimolar Natriumchlorid auf eine Endkonzentration von 66 Millimolar und 2,7 x Volumina Ethanol.

Als Nächstes isolieren Sie die tRNA-Proben durch Resuspendierung in 50 Millimolar Tris-HCl und inkubieren sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten neutralisieren Sie die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens 50 Millimolar gepuffertes Acetat und 100 Millimolar Natriumchlorid, gefolgt von Präzipitation mit 2,7 x Volumina Ethanol. Resuspendieren Sie das RNA-Pellet in Wasser auf etwa ein Mikrogramm pro Mikroliter.

Nachdem die Kontroll- und oxidierten Proben auf RNA-Qualität mittels Agarosegelelektrophorese überprüft wurden, kann mit der fluoreszenzmarkierten Markierung begonnen werden, um fluoreszierende Oligo-Tags an die tRNA anzubinden. Kombinieren Sie 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter der RNA mit vier Mikromolar SI3- oder SI5-haltigen Oligonukleotiden, Ligasepuffer, 15 % DMSO, 0,5 Einheiten pro Mikroliter T4-DNA-Ligase und Hefe-Exophosphatase und inkubieren Sie bei 16 °C über 16 Stunden. Nach der Ligierung mischen Sie die Proben mit dem Vierfachen Volumen Kaliumacetat und Kaliumchlorid und extrahieren anschließend mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform. Nach der Extraktion der wässrigen Phase fälligen Sie die RNA-Präparationen mit Ethanol. Schließlich resuspendieren Sie die RNA-Pellets in Wasser auf etwa 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter, bevor Sie die Microarray-Slides mit Öl und destilliertem Wasser ein- bis zweimalig für ein bis zwei Minuten behandeln, um ungebundene Oligonukleotide zu entfernen.

Anschließend werden die fünf markierten Proben von S3 oder SCI mit 140 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, der Salmonensperma-DNA auf eine Endkonzentration von 140 Mikrogramm pro Milliliter und Poly-A auf eine Endkonzentration von sieben D-Mikrogramm pro Milliliter enthält, gemischt und ein Hybridisierungsprogramm in einem automatischen Array-Hybridisierer durchgeführt. Die Verwendung einer automatischen Hybridisierungsmaschine für tRNA-Arbeiten wird dringend empfohlen, da manuelle Hybridisierung einen hohen Hintergrund erzeugt. Sobald das Hybridisierungsprogramm abgeschlossen ist, werden die Objektträger manuell mit der Waschlösung 3 durch vorsichtiges Schütteln in einem 50-Milliliter-Kegelrohr für drei bis fünf Minuten gewaschen.

Die Objektträger mindestens zweimal in mit Aluminiumfolie vorab umwickelte Röhrchen waschen. Die Objektträger durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit für fünf bis 10 Minuten trocknen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Objektträger sollten unmittelbar nach dem Trocknen gescannt werden.

Präparate können zwei bis drei Mal gescannt werden, ohne dass eine merkliche Verschlechterung der Bildqualität auftritt. Hier werden repräsentative Ergebnisse einer korrekt isolierten Gesamt-RNA-Probe und deren Analyse gezeigt. Diese Probe weist ein sehr sauberes Spektrum mit einem OD260/OD280-Verhältnis nahe zwei auf und zeigt bei Lauf auf 1 % Agarosegelen keine nachweisbare Protein- oder Phenolkontamination. Sowohl oxidierte als auch Kontrollproben sollten ein starkes TNA-Band zeigen, wobei andere mögliche Nukleinsäurebänder je nach Organismus variieren können.

Wenn eine Probe deutlich schwächer ist als andere Proben oder wenn ein Verschmieren beobachtet wird, sollten die Proben nicht für Microarrays verwendet werden. Microarrays sollten eine sehr geringe Hintergrundfärbung aufweisen, die um eine Größenordnung niedriger liegt als die schwächste tRNA-Sonde. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man die tRNA isoliert und die relativen Ladezustände der tRNA bestimmt, wenn man dieses Verfahren durchführt.

Es ist wichtig, daran zu denken, Ihre Reagenzien, insbesondere während der Oxidations- und Dilatationsschritte, nukleasefrei zu halten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.