Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

Laser-Mikrodissektion oder LCM hat sich als äußerst leistungsfähiges Werkzeug herausgestellt, das zur Isolierung spezifischer Zelltypen aus Gewebeschnitten mit hoher räumlicher Auflösung und Genauigkeit verwendet werden kann. Hier wird LCM verwendet, um periphere Neuronen aus Oph-Larven des dritten Larvenstadiums zu isolieren. Larven des dritten Larvenstadiums werden in eine Kryoschablone eingebettet, eingefroren und anschließend mit einem Kryostaten serielle Gewebeschnitte angefertigt, die auf Objektträger aufgebracht, aufgetaut und in 70 %igem Ethanol fixiert werden.

Anschließend werden die Objektträger mit Trypsin inkubiert, um restliche larvale Cuticula zu entfernen, und einer Dehydrierung mittels eines Ethanol-Gradienten sowie einer Klärung mit Xylol unterzogen. Danach wird eine LCM-Kappe auf den Gewebeschnitt aufgebracht, und gezielt fluoreszierende Neuronenzellen werden mithilfe eines gepulsten Lasers isoliert. Abschließend wird RNA aus den gewonnenen Zellen für nachgeschaltete Anwendungen wie quantitative RT-PCR- oder Microarray-Analysen extrahiert.

Hallo, ich bin Dan Cox vom Department für Molekular- und Mikrobiologie sowie vom Krasnow-Institut für fortgeschrittene Studien an der George Mason University. Hallo, ich bin Ish AER aus dem Labor von Dr. Dan Cox. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Zellisolierung und RNA-Reinigung einzelner oder mehrerer peripherer Neuronen von Drosophila mittels Laser-Mikrodissektion.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die klassenspezifische DIN-Raten-Morphogenese vermitteln. Beginnen wir also. Alle in diesem Video gezeigten Verfahren werden unter streng RNA-freien Bedingungen gemäß Standardverfahren durchgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie 30 bis 40 alte Paare von Larven des dritten Instars sammeln. Waschen Sie die Larven in zweifach destilliertem Wasser.

Spülen Sie kurz in RNAs hinein und waschen Sie anschließend ein weiteres Mal mit doppelt destilliertem Wasser. Um die RNAs zu entfernen, wischen Sie mit einem sauberen Kim-Tuch vollständig überschüssiges Wasser ab. Nehmen Sie danach eine saubere Gewebeeinbettungsschale und geben Sie eine dünne Schicht OCT hinzu.

Stellen Sie die Form auf einen Eisblock, um sie auf null Grad Celsius abzukühlen. Legen Sie mithilfe einer Pinzette die sauberen Larven und das kalte OCT ein. Die niedrige Temperatur des OCT hilft, die Bewegung der Larven zu verringern.

Während des Einbettungsprozesses die Larven parallel zueinander anordnen. Sobald die Larven angeordnet sind, die Form langsam mit OCT auffüllen, ohne sie zu stören. Danach schnell einfrieren.

Gefrieren Sie die Form, indem Sie sie auf Trockeneis stellen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Larve in einer einzigen Ebene angeordnet bleibt, was die Anzahl der pro Schnitt verfügbaren Zellen maximiert. Verwenden Sie dazu einen Kryostaten.

Schneiden Sie gefrorene Schnitte mit einer Dicke von fünf bis acht Mikrometern auf einfachen, beschrifteten, unbeladenen, RNA-freien Glasobjektträgern. Lagern Sie die Objektträger auf Trockeneis und überführen Sie sie anschließend bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Mikrodissektion bereit sind. Alle Lösungen zur Dehydrierung müssen vor jeder LCM-Sitzung frisch hergestellt werden.

Die vollständige Dehydrierung von gefrorenen Larvengewebeschnitten ist entscheidend, um eine optimale Mikrodissektions-Effizienz zu erreichen. Entnehmen Sie die Objektträger mit den gefrorenen Larvengewebeschnitten dem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis. Nehmen Sie einen einzelnen Objektträger aus der Objektträgerbox und legen Sie ihn unverzüglich für drei bis zehn Sekunden in ein 50-Milliliter-Konischglas, das mit 70 % Ethanol gefüllt ist.

Anschließend die Objektträger in einem 50-Milliliter-Konischkolben mit RNAsefreiem zweifach destilliertem Wasser fünf bis zehn Sekunden lang spülen, um die Cuticula von den Gewebeschnitten zu entfernen, die die LCM-Aufnahme stören könnte. Vorsichtig 50 Mikroliter 2,5 % Trypsin direkt auf den Gewebeschnitt pipettieren und fünf bis 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die Schnitte kurz in einem 50-Milliliter-Konischkolben mit RNAsefreiem zweifach destilliertem Wasser spülen, um das Trypsin und lose anhaftende Cuticula-Fragmente zu entfernen. Den Dehydrierungsprozess abschließen, indem die Objektträger nacheinander in die folgenden Lösungen getaucht werden.

70 % Ethanol, 95 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Xylol. Und schließlich noch einmal in 100 % Xylol. Nach der Dehydrierung die Objektträger unter einem schwachen Luftstrom 60 bis 120 Sekunden bei Raumtemperatur vollständig trocknen.

Führen Sie die Mikrodissektion nach Möglichkeit in einem feuchtigkeitsgeregelten Raum durch, um eine Verringerung der Effizienz aufgrund erhöhter Luftfeuchtigkeit zu vermeiden. Schalten Sie zunächst die Stromversorgung für das Mikroskop und die Lasersteuerbox ein. Laden Sie die Kappehalter-Vorrichtung mit H-S-L-C-M-Kappen.

Jede Kappe kann zahlreiche Zellkörper erfassen. Öffnen Sie als Nächstes die Software für molekulare Geräte und geben Sie die Versuchsdetails ein, einschließlich Objektträgernummer und Chargennummer der Kappen. Platzieren Sie den Objektträger mit den Larvengewebeschnitten auf dem Mikroskopständer für die Mikrodissektion.

Laden Sie eine neue HS-LCM-Kappe aus der Patrone auf das P-Zelle-zwei-ELCM-Gerät auf und positionieren Sie sie korrekt in Bezug auf den Joystick, um eine ordnungsgemäße Platzierung der Kappe in Relation zum Erfassungsbereich sicherzustellen. Lokalisieren Sie die fluoreszenzmarkierten Zellen in den transgenen Reporterreihen PPK GAL vier U-A-S-M-C-D acht GFP oder 21 7 G vier UASM CD acht GFP. Die dendritischen Arborisierungs- oder DA-Neuronen des peripheren Nervensystems können leicht anhand der GFP-Fluoreszenz identifiziert werden. Um die Spezifität zu maximieren, wählen Sie Zellen mit einem starken Fluoreszenzsignal und minimaler Zellüberlappung aus.

Als Nächstes passen Sie die Leistung und Dauer der Laserimpulsparameter an, um einen präzisen geschmolzenen Polymerfleck zu erzeugen, dessen Größe der gewählten Laserfleckgröße für die Mikrodissektion einzelner DA-Neuronen der Klasse entspricht. Die folgenden Einstellungen werden empfohlen: Fleckdurchmesser 7,5 Mikrometer, Laserleistung 30 bis 50 Milliwatt, Laserdauer zwei bis vier Millisekunden und ein bis zwei Impulse pro Zelle.

Die Laser-Einstellungen können je nach Gewebetyp, Gewebedicke und verwendeter LCM-Kapillartyp variieren. Letztendlich erfordern die Laser-Einstellungen empirische Tests, um optimale Erfassungsergebnisse zu erzielen. Anschließend wird das Gewebe der LCM unterzogen.

Während der LCM wird die Kappe über den interessierenden Bereich und einen Infrarotlaser mit geringer Leistung platziert. Ein Puls wird durch die Kappe hindurch auf einen dünnen Thermo-Lab-Polymerfilm über der oder den Zelle(n) des Interesses gelenkt. Wenn der Laser gepulst wird, erweicht sich der Film, haftet an den Zielzellen und erstarrt erneut, wobei die Zellen des Interesses daran befestigt bleiben.

Wenn die Kappe von dem Gewebeschnitt angehoben wird, werden die Zelle oder die Zellen vom umgebenden Gewebe mikrodisseziert, um weitere Zellen in einem neuen Bereich zu erfassen und den Vorgang zu wiederholen. Sobald die gewünschten Zellen erfasst wurden, heben Sie die LCM-Kappe an und platzieren Sie sie auf einem sauberen Objektträger, um das Vorhandensein der erfassten Zellen sowie das Fehlen unerwünschter Zellen oder Ablagerungen zu bestätigen. Bildgebungsanalyse der HS-LCM-Kappe mittels Fluoreszenz- und Durchlichtbeleuchtung.

Befestigen Sie die Kappe mit den mikrodissezierten Zellen an einem Extraktionsgerät. Geben Sie anschließend 12 µL RNA-Extraktionspuffer auf die Oberfläche der Kappe und verbinden Sie ein invertiertes dünnwandiges Reaktionsröhrchen, wie hier gezeigt. Stellen Sie die Montage auf ein Ausrichtungs-Tablett und bedecken Sie sie mit einem vorgewärmten Inkubationsblock.

Stellen Sie dann das Tablett nach der Inkubationszentrifugation 30 Minuten lang in einen 42 Grad Celsius warmen Inkubator. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Extrakten bei 800 × g für zwei Minuten. Nach dem Entnehmen der Röhrchen aus der Zentrifuge verschließen Sie diese und lagern Sie die Zellextrakte bei minus 80 Grad Celsius, bis die Zeit zum Reinigen des RNA-Extrakts gekommen ist, und reinigen Sie die RNA mittels Säulenchromatographie.

Entsprechend der Anleitung des Pico Pure RNA-Extraktionskits ist die DNA-Behandlung optional und kann bei Bedarf während der RNA-Reinigung an der Säule durchgeführt werden. Nach der Reinigung sollte die RNA bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Mittels Laser-Kapture-Mikrodissektion wurden einzelne klassenspezifische oder mehrere Drosophila-DA-Neurone aus Larven im dritten Larvenstadium isoliert.

LCM ermöglicht ein hohes Maß an Präzision und Spezifität bei der Isolierung der Zellkörper von Drosophila-D-Neuronen. Gezeigt ist ein repräsentatives Bild eines acht Mikrometer dicken Gewebeschnitts, der dehydriert und mit Trypsin behandelt wurde. Vor der Durchführung der LCM sind zwei DA-Neuronen der Klasse vier mit GFP markiert.

Der Pfeil zeigt das Neuron an, das zur Erfassung hervorgehoben ist. Der Zellkörper des hervorgehobenen Neurons wird mit hoher Spezifität sauber mikrodisseziert aus dem Gewebeschnitt. Das Insekt zeigt eine Endon-Ansicht eines einzelnen DA-Neurons der Klasse vier, das auf der LCM-Kapazität erfasst wurde.

Die aus den isolierten DA-Neuronen gewonnene Gesamt-RNA wies eine ausgezeichnete Qualität auf, wie durch scharfe 5,8S- und 28S-Ribosomen-RNA-Peaks auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer nachgewiesen wurde. Eine echtzeitquantitative reversstrangtranskriptions-PCR für den neuronenspezifischen Genmarker Lev wurde durchgeführt, um die neuronenspezifische Anreicherung der isolierten Zellen mittels der ΔΔCT-Methode zu bewerten. Dabei zeigte sich eine mehr als 2,5-fache Anreicherung der Lev-Spiegel in den mittels LCM gewonnenen DA-Neuronen im Vergleich zum gesamten Organismus.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man RNA aus Joss- oder peripheren Neuronen mittels Laser-Mikrodissektion isoliert und reinigt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Trypsinkonzentration und die Verdauungszeit entsprechend dem zu mikrodissezierenden Gewebe und der Schnittdicke zu optimieren. Längere Inkubationszeiten können zum Verlust der Zielzellen aus den Gewebeschnitten führen, während eine zu kurze Inkubationszeit möglicherweise nicht ausreicht, um die Larvenhaut vollständig zu entfernen, was eine ineffiziente LCM zur Folge hat.

Wichtig ist, dass alle Gewebedehydrationslösungen frisch zubereitet werden müssen. Außerdem muss Xylol vollständig verdunstet werden, bevor die LCM durchgeführt wird, um Schäden am Polymer der LCM-Kappe zu vermeiden. Schließlich ist es zur Erhaltung der RNA-Integrität der gereinigten Zellen unerlässlich, während des gesamten Verfahrens RNAse-freie Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.