Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

- Setzen Sie zunächst fünf Larven in jede Bahn einer sechsbahnigen Agaroseplatte. Zusätzliches Eiwasser hinzufügen, aber die Bahnen nicht überfüllen. Eiwasser enthält Methylenblau, das Schimmelbildung verhindert. Lassen Sie die Larven mindestens 10 Minuten akklimatisieren, um ihren Stress zu reduzieren.

Platzieren Sie nun die Well-Platte in einer Bildgebungskammer über einem Laptop-Bildschirm. Fokussieren Sie die Kamera auf die Well-Platte. Füllen Sie die Bahn vollständig mit Eiwasser.

Zeichnen Sie als Nächstes das Verhalten der Larven auf, die auf dem leeren Hintergrund platziert sind, indem Sie Zeitrafferbilder aufnehmen. Zeigen Sie einen sich bewegenden roten Balken auf dem Laptop-Bildschirm an und machen Sie Zeitrafferbilder der Larven als Reaktion auf den sich bewegenden roten Balken.

Die rote Form wird als Bedrohung, als aversiver Reiz empfunden und verursacht bei den Larven Stress. Als Reaktion darauf meiden sie die Stange und zeigen eine positive Thigmotaxis. Positive Thigmotaxis ist die Reaktion des Fisches auf den Reiz, sucht den Kontakt mit der Wand und schwimmt am Rand der Bahn.

Im Beispielprotokoll werden wir die Vermeidungs- und thigmotaktischen Reaktionen von Zebrafischlarven analysieren, die mit pharmazeutischen Wirkstoffen oder Umweltgiften behandelt wurden.

- Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, bewegen Sie die Larven vorsichtig von der Petrischale in die Agarosebahn, um den Stress der Larven zu reduzieren. Bis zu 20 Larven können in jeder Bahn platziert werden, aber in der Regel werden fünf Larven pro Bahn verwendet, um die genaueste Verfolgung der Schwimmgeschwindigkeit zu erleichtern und die Anzahl der Larven zu reduzieren, die pro Experiment benötigt werden.

Füllen Sie die Bahnen mit Eiwasser mit oder ohne Arzneimittel oder Giftstoffe, je nach Experiment. Füllen Sie die Bahnen nicht vollständig aus, bis sie in die Bildschränke gelegt werden, um ein Überlaufen zu vermeiden. Warten Sie 10 Minuten, bis sich die Larven akklimatisiert haben. Nach der Eingewöhnungsphase positionieren Sie vier Platten von Hand direkt auf dem Laptop-Bildschirm.

Zu diesem Zeitpunkt können die Fahrspuren mit Eiwasser oder chemischer Behandlung aufgefüllt werden, so dass sie auf gleicher Höhe mit dem oberen Rand der Fahrspur sind, um Schatten an den Rändern der Fahrspuren in den Bildern zu vermeiden.

Programmieren Sie den Computer für die Zeitrafferfotografie, indem Sie alle sechs Sekunden Bilder aufnehmen, also insgesamt 300 Bilder pro Experiment. Stellen Sie die Kamera auf eine niedrigere Auflösung ein, um die Bildgebung mit Videogeschwindigkeit zu ermöglichen. Während die niedrigere Auflösung die Aufzeichnungen auf eine einzige Multi-Well-Platte beschränkt, eignen sich die Videoaufzeichnungen für die Abbildung von Schnellschwimmveranstaltungen.

Nutzen Sie eine PowerPoint-Präsentation als aversiven Reiz für die Larven. In dieser Demonstration beginnt die PowerPoint-Präsentation 15 Minuten lang mit einem leeren weißen Hintergrund, gefolgt von 15 Minuten mit einem sich bewegenden roten Balken in der oberen Hälfte der Platte. Um eine Verdunstung der Flüssigkeit innerhalb der Agarosebahnen zu vermeiden, halten Sie die maximale Bildgebungszeit auf unter einer Stunde.