Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

- Setzen Sie die interessierenden Embryonen in Phenylthioharnstoff, PTU, Ringer-Lösung, ein, um die Pigmentbildung zu hemmen, die 24 Stunden nach der Befruchtung beginnt. Dadurch wird die sich entwickelnde Anatomie sichtbarer, was für dieses Verfahren notwendig ist. Übertragen Sie einen mit Tricain betäubten Embryo in eine Bildgebungskammer. Legen Sie einen Objektträger darauf und betrachten Sie ihn unter Ihrem Mikroskop. Fokussieren Sie sich auf das zu verletzende Axon, das unter einem 488-Nanometer-Laser sichtbar ist, weil es transgenetisch GFP exprimiert.

Nehmen Sie ein Vorher-Bild der Website auf. Als nächstes betrachten Sie das Axon mit einem 910-Nanometer-Laser, der das GFP rot fluoreszieren lässt. Erhöhen Sie die Intensität dieses Lasers, um den Zielbereich zu verletzen, ohne das umgebende Gewebe zu beeinträchtigen. Dieser Vorgang wird als Axotomie bezeichnet. Nehmen Sie mit dem ersten Laser ein neues Bild auf, um die Axotomie zu bestätigen, die als verstreute Trümmer erscheint. Im folgenden Protokoll werden wir eine Axotomie der peripheren sensorischen Axone in Zebrafischembryonen mit einem Zwei-Photonen-Laser durchführen.

- Wenn in Ihrem Labor kein speziell angefertigtes Zwei-Photonen-Oszilloskop verfügbar ist, kann das konfokale Zwei-Photonen-Mikroskop Zeiss 510 auch zum Durchtrennen von Axonen verwendet werden. Wir beginnen damit, den montierten Embryo auf den Tisch zu legen und ihn mit einem 25-fachen Wasserobjektiv in den Fokus zu bringen. Schalten Sie als Nächstes die beiden Photonen- und Argonlaser in einer Mehrspureinstellung ein, so dass es möglich ist, von einem zum anderen zu wechseln.

Obwohl beide Laser zur Detektion von GFP verwendet werden, wird die Emission von zwei Photonen mit rot und die Emission von Argon-Lasern mit grün visualisiert, um die beiden zu unterscheiden. Verwenden Sie den Argon-Laser, um ein Axon zu identifizieren, das verletzt werden soll. Markieren Sie unter Z-Einstellungen den ersten und letzten optischen Abschnitt, nehmen Sie ein konfokales Bild auf und erstellen Sie eine maximale Projektion des Z-Stapels.

Schalten Sie den Argonlaser aus und den Zwei-Photonen-Laser ein. Scannen Sie mit einer Transmissionsintensität von ca. 9%, um sicherzustellen, dass das Axon noch scharf ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, damit das Freistellungswerkzeug verfügbar ist. Verwenden Sie Zuschneiden, um den Interessenbereich zu vergrößern. Normalerweise zoomen wir auf etwa 70x. Wählen Sie die Region des Axons, die verletzt werden soll, und bringen Sie diese Region in den Fokus. Der Zoom kann unter dem Reiter Modus überprüft werden.

Ändern Sie als Nächstes auf der Registerkarte Kanäle die Intensität der beiden Photonen von etwa 9 % Transmission auf 15 % bis 30 % Transmission. Um die neuen Einstellungen zu aktivieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Schnell XY und dann auf Schnell stoppen, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Das Axon sollte als verstreuter Trümmerhaufen angesehen werden, wenn das Verfahren funktioniert hat. Um sicherzustellen, dass das Axon tatsächlich beschädigt wurde, schalten Sie schließlich wieder auf den 488-Nanometer-Argonlaser um. Nehmen Sie ein weiteres konfokales Bild auf, und erstellen Sie eine maximale Projektion der Z-Stapel.