Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung
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Biologie
0 Ansichten • 3:24 Min. • April 30th, 2023
- Setzen Sie die interessierenden Embryonen in Phenylthioharnstoff, PTU, Ringer-Lösung, ein, um die Pigmentbildung zu hemmen, die 24 Stunden nach der Befruchtung beginnt. Dadurch wird die sich entwickelnde Anatomie sichtbarer, was für dieses Verfahren notwendig ist. Übertragen Sie einen mit Tricain betäubten Embryo in eine Bildgebungskammer. Legen Sie einen Objektträger darauf und betrachten Sie ihn unter Ihrem Mikroskop. Fokussieren Sie sich auf das zu verletzende Axon, das unter einem 488-Nanometer-Laser sichtbar ist, weil es transgenetisch GFP exprimiert.
Nehmen Sie ein Vorher-Bild der Website auf. Als nächstes betrachten Sie das Axon mit einem 910-Nanometer-Laser, der das GFP rot fluoreszieren lässt. Erhöhen Sie die Intensität dieses Lasers, um den Zielbereich zu verletzen, ohne das umgebende Gewebe zu beeinträchtigen. Dieser Vorgang wird als Axotomie bezeichnet. Nehmen Sie mit dem ersten Laser ein neues Bild auf, um die Axotomie zu bestätigen, die als verstreute Trümmer erscheint. Im folgenden Protokoll werden wir eine Axotomie der peripheren sensorischen Axone in Zebrafischembryonen mit einem Zwei-Photonen-Laser durchführen.
- Wenn in Ihrem Labor kein speziell angefertigtes Zwei-Photonen-Oszilloskop verfügbar ist, kann das konfokale Zwei-Photonen-Mikroskop Zeiss 510 auch zum Durchtrennen von Axonen verwendet werden. Wir beginnen damit, den montierten Embryo auf den Tisch zu legen und ihn mit einem 25-fachen Wasserobjektiv in den Fokus zu bringen. Schalten Sie als Nächstes die beiden Photonen- und Argonlaser in einer Mehrspureinstellung ein, so dass es möglich ist, von einem zum anderen zu wechseln.
Obwohl beide Laser zur Detektion von GFP verwendet werden, wird die Emission von zwei Photonen mit rot und die Emission von Argon-Lasern mit grün visualisiert, um die beiden zu unterscheiden. Verwenden Sie den Argon-Laser, um ein Axon zu identifizieren, das verletzt werden soll. Markieren Sie unter Z-Einstellungen den ersten und letzten optischen Abschnitt, nehmen Sie ein konfokales Bild auf und erstellen Sie eine maximale Projektion des Z-Stapels.
Schalten Sie den Argonlaser aus und den Zwei-Photonen-Laser ein. Scannen Sie mit einer Transmissionsintensität von ca. 9%, um sicherzustellen, dass das Axon noch scharf ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, damit das Freistellungswerkzeug verfügbar ist. Verwenden Sie Zuschneiden, um den Interessenbereich zu vergrößern. Normalerweise zoomen wir auf etwa 70x. Wählen Sie die Region des Axons, die verletzt werden soll, und bringen Sie diese Region in den Fokus. Der Zoom kann unter dem Reiter Modus überprüft werden.
Ändern Sie als Nächstes auf der Registerkarte Kanäle die Intensität der beiden Photonen von etwa 9 % Transmission auf 15 % bis 30 % Transmission. Um die neuen Einstellungen zu aktivieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Schnell XY und dann auf Schnell stoppen, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Das Axon sollte als verstreuter Trümmerhaufen angesehen werden, wenn das Verfahren funktioniert hat. Um sicherzustellen, dass das Axon tatsächlich beschädigt wurde, schalten Sie schließlich wieder auf den 488-Nanometer-Argonlaser um. Nehmen Sie ein weiteres konfokales Bild auf, und erstellen Sie eine maximale Projektion der Z-Stapel.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Durchführung einer Axotomie an peripheren sensorischen Axonen in Zebrafisch-Embryonen mithilfe eines Zweiphotonen-Lasers beschrieben. Das Verfahren verbessert die Sichtbarkeit der sich entwickelnden Anatomie, indem es die Pigmentbildung hemmt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Die Axotomie ist eine Methode, die zur Untersuchung von axonalen Verletzungen und Regeneration eingesetzt wird.
- Zebrafischembryonen sind ein wertvolles Modell für Entwicklungsstudien.
- Mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie lässt sich gezielt auf Axone fokussieren.
- Die GFP-Expression hilft, Axone während der Bildgebung sichtbar zu machen.
Zweck der Studie
- Die Axotomie-Technik an Zebrafischembryonen demonstrieren.
- Forschern auf dem Gebiet eine detaillierte Anleitung bereitstellen.
- Den Einsatz der Zwei-Photonen-Laser-Technologie in der neurowissenschaftlichen Forschung hervorheben.
Verwendete Methoden
- Embryonen werden mit Phenylthioharnstoff behandelt, um die Pigmentbildung zu hemmen.
- Zwei-Photonen- und Argonlaser werden zur Bildgebung und zur Axonschädigung verwendet.
- Die konfokale Bildgebung wird durchgeführt, um axonale Schäden zu bestätigen.
- Die Intensitätseinstellungen der Laser werden angepasst, um Schäden am umgebenden Gewebe zu minimieren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Axotomie zeigt sich durch das Auftreten von verstreutem Zelltrümmern.
- Bilder bestätigen die Verletzungsstelle vor und nach dem Eingriff.
- Das Protokoll ist mit sowohl individuellen als auch Standard-Mikroskopieaufbauten reproduzierbar.
- Die visuelle Unterscheidung zwischen Laseremissionen unterstützt eine präzise Zielgenauigkeit.
Schlussfolgerungen
- Das Axotomieverfahren eignet sich zur Untersuchung von axonalen Verletzungen bei Zebrafischen.
- Die Zweiphotonenmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug für die Neurowissenschaftsforschung.
- Dieses Protokoll kann für verschiedene Abbildungssysteme angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine gezielte axonale Verletzung in einem lebenden Wirbeltiermodell und unterstützt damit mechanistische Untersuchungen von Neurodegeneration und Reparaturwegen. Sie bietet eine reproduzierbare Plattform zur Bewertung neuroprotektiver Substanzen und Regenerationsphänotypen in der frühen Forschung. Der Ansatz verbessert die Zielvalidierung, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit funktionellen axonalen Ergebnissen verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Axonintegrität und Regenerationsmechanismen in einem krankheitsrelevanten Wirbeltiersystem.
- Operativer Wert: Bietet ein quantifizierbares Verletzungsmodell, um die Zielinteraktion von neuroprotektiven oder pro-regenerativen Substanzen zu bewerten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Messgrößen für axonale Verletzungen, die für bildbasierte Hochdurchsatz-Screenings geeignet sind.
- Operativer Wert: Unterstützt die Reproduzierbarkeit des Assays durch kontrollierte Laserparameter und die auf GFP basierende Visualisierung von Axonen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem molekulare Zielstrukturen mit Phänotypen der axonalen Reparatur verknüpft werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die langfristige Verfolgung der Erholung im selben Organismus und verringert so die Variabilität bei der präklinischen Wirksamkeitsbewertung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für die frühe Entdeckungsphase, um die Zielmodulation der axonalen Resilienz zu bewerten, und unterstützt so die Auswahl von Leitverbindungen, bevor präklinische Investitionen getätigt werden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Genen oder Verbindungen, die die axonale Degeneration und Regeneration beeinflussen.
- Screening: Liefert quantitative, bildbasierte Messgrößen zur axonalen Integrität für die Profilierung von Substanzbibliotheken.
- Analysen: Ermöglicht den Vergleich der axonalen Struktur vor und nach Verletzung mittels konfokaler Mikroskopie und Fluoreszenzintensität.
- Translationale Forschung: Baut auf zebrabasierten Krankheitsmodellen auf, um die Erhaltung von Mechanismen der axonalen Reparatur zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für axonale Verletzungen, die in mehreren neurotherapeutischen Programmen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem der Mechanismus mit dem axonalen Phänotyp verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Induktion axonaler Verletzungen und erhöht dadurch die Reproduzierbarkeit zwischen Teams und Standorten.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in Programmen zur Neurodegeneration durch frühzeitige phänotypische Entlastung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf Daten zur axonalen Regeneration aus einem Wirbeltiermodell.
Durchführungsüberlegungen
- Es sind Fachkenntnisse in der Lasermikroskopie und im Umgang mit Zebrafischembryonen erforderlich.
- Die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie mit GFP-exprimierenden Linien ist unerlässlich.
- Die Standardisierung der Laserintensität und Belichtungsparameter gewährleistet eine konsistente Verletzung über alle Experimente hinweg.
- Die Anpassung an verschiedene Axontypen erfordert möglicherweise die Auswahl transgener Linien und eine Anpassung der Bildtiefe.
- Die Pigmenthemmung mittels PTU ist für eine optimale Visualisierung in pigmentierten Embryonen notwendig.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026