Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

- Setzen Sie die interessierenden Embryonen in Phenylthioharnstoff, PTU, Ringer-Lösung, ein, um die Pigmentbildung zu hemmen, die 24 Stunden nach der Befruchtung beginnt. Dadurch wird die sich entwickelnde Anatomie sichtbarer, was für dieses Verfahren notwendig ist. Übertragen Sie einen mit Tricain betäubten Embryo in eine Bildgebungskammer. Legen Sie einen Objektträger darauf und betrachten Sie ihn unter Ihrem Mikroskop. Fokussieren Sie sich auf das zu verletzende Axon, das unter einem 488-Nanometer-Laser sichtbar ist, weil es transgenetisch GFP exprimiert.

Nehmen Sie ein Vorher-Bild der Website auf. Als nächstes betrachten Sie das Axon mit einem 910-Nanometer-Laser, der das GFP rot fluoreszieren lässt. Erhöhen Sie die Intensität dieses Lasers, um den Zielbereich zu verletzen, ohne das umgebende Gewebe zu beeinträchtigen. Dieser Vorgang wird als Axotomie bezeichnet. Nehmen Sie mit dem ersten Laser ein neues Bild auf, um die Axotomie zu bestätigen, die als verstreute Trümmer erscheint. Im folgenden Protokoll werden wir eine Axotomie der peripheren sensorischen Axone in Zebrafischembryonen mit einem Zwei-Photonen-Laser durchführen.

- Wenn in Ihrem Labor kein speziell angefertigtes Z