3-dimensionale Kultur von Lungenkarzinomzellen: Eine Methode zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen

- Tauen Sie zunächst Fläschchen mit Basalmembranmatrix über Nacht bei 4 Grad Celsius auf. Die Basalmembranmatrix besteht aus Proteinen, die in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind und dazu beitragen, die Eigenschaften von Krebszellen in vitro zu erhalten. Stellen Sie am nächsten Tag das Basalmembran-Matrix-Fläschchen auf Eis, um die Matrix im flüssigen Zustand zu halten. Nehmen Sie Lungenkrebszellen in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 4 Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand an und klopfen Sie vorsichtig darauf, um das Pellet zu lösen und auf Eis zu legen. Geben Sie als nächstes ein geeignetes Volumen Basalmembranmischung in dieses Röhrchen und mischen Sie, um eine gleichmäßige Zellsuspension herzustellen. Führen Sie alle Schritte bei niedriger Temperatur durch, um ein Gelieren der Basalmembran zu verhindern.

Übertragen Sie ein geeignetes Volumen der Zellmatrixsuspension in die Mitte jedes Wells in einer vorgekühlten Well-Platte, wobei das gesamte Well abgedeckt wird. Inkubieren Sie die Well-Platte, damit sich die Matrix verfestigen kann. Untersuchen Sie unter einem Mikroskop, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Matrix sicherzustellen. Geben Sie vollständiges 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Dieses Medium erleichtert die Interaktion mit der Zellmatrix. So bilden die Zellen Organoide mit azinusähnlichen Strukturen. Im folgenden Protokoll werden wir die 3D-Kultur von TUM622-Lungenkarzinomzellen durchführen.

Tauen Sie zunächst Fläschchen mit Basalmembranmatrix über Nacht in einem 4 Grad Celsius Kühlschrank auf. Zwei Milliliter Plastikpipetten und -spitzen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius abkühlen lassen. Erwärmen Sie am nächsten Tag die Reagenzien, die zur Dissoziation der TUM622-Zellen verwendet werden, HEPES-Puffer, Trypsin-EDTA und Trypsin-Neutralisationspuffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Nehmen Sie die aufgetaute Basalmembranmatrix aus dem Kühlschrank und stellen Sie das Fläschchen auf Eis. Kühlen Sie die Gewebekulturplatten auf einer Metallplattform ab, die auf Eis steht. Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Kühlgestell aus Metall auf Eis. Berechnen Sie die Menge der Zellen, die benötigt werden, basierend auf der Anzahl der Wells und der Konzentration der Zellen in jeder Vertiefung, die vorbereitet werden sollen. Die TUM622-Zellsuspension wird in ein gekühltes Zentrifugenröhrchen überführt und in einer hängenden Eimerzentrifuge bei 4 Grad Celsius fünf Minuten lang mit 300 g abgesenkt

Mit einer Aspirationspipette, die an einer ungefilterten Spitze befestigt ist, den Überstand vorsichtig ansaugen, wobei etwa 100 Mikroliter des Mediums im Röhrchen verbleiben. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Rohrs, um das Pellet zu lösen und zu verbinden, und legen Sie es dann wieder in das Kühlgitter. Mischen Sie die Matrix mit den zwei Millilitern vorgekühlten Pipetten vorsichtig auf Eis, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie mit einer gleichmäßigen und moderaten Geschwindigkeit, so dass bei diesem Vorgang keine Blasen in die Matrize eingebracht werden.

Übertragen Sie 1,1 Milliliter der Matrix in jedes Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie die Matrix in jedem Röhrchen mit vorgekühlten Spitzen etwa 10 Mal auf und ab, um eine gleichmäßige Zellsuspension herzustellen. Übertragen Sie 310 Mikroliter der Zellmatrixsuspension in jede Vertiefung einer vorgekühlten 24-Well-Platte. Platzieren Sie die Pipette in einem 90-Grad-Winkel zur Plattenoberfläche und geben Sie die Suspension in die Mitte der Vertiefung. Die Suspension spreizt und bedeckt den gesamten Brunnen. Um die nachgelagerte Immunfluoreszenzanalyse zu erleichtern, übertragen Sie 60 Mikroliter Zell-Matrix-Suspension in die Well-Mitte eines 2-Well-Kammerobjektträgers. Dadurch kann die Matrix eine kuppelartige Struktur mit viel kleinerem Volumen bilden.

Setzen Sie die Platte und die Kammer wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, damit sich die Matrix verfestigen kann. Untersuchen Sie danach die Platte und den Objektträger unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die einzelnen Zellen gleichmäßig in der Matrix verteilt sind. Geben Sie 1 Milliliter vorgewärmtes 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung der Platte und 1,5 Milliliter 3D-Kulturmedium in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers. Legen Sie sie dann wieder in den Inkubator.