Präparation von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben: Ein Protokoll zur Konservierung von Gewebe- und Zytologieproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)

- Entnehmen Sie zunächst Lungentumorproben als Gewebeproben oder als zytologische Proben aus Bronchialwaschungen - einer Kochsalzlösung, die Zellen aus der Innenseite der Atemwege enthält. Um Gewebeproben vorzubereiten, übertragen Sie frisch präpariertes Lungengewebe in eine Einbettkassette. Fixieren und konservieren Sie das Gewebe mit der entsprechenden Konzentration an Formalin.

Um zytologische Proben vorzubereiten, behandeln Sie zunächst die Bronchialspülungen mit DL-Dithiothreitol zur Homogenisierung. Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Anschließend mit einer mukolytischen Lösung behandeln, um den Schleim zu verflüssigen und die Zellen zu trennen. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren und mit Formalin zu fixieren. Behandeln Sie die Zellen mit einem geeigneten Reagenz zur Zellblockvorbereitung, um die Probe zu konzentrieren, während Sie mit kleinen Pelletvolumina arbeiten.

Übertragen Sie das Pellet in eine Einbettkassette. Verarbeiten Sie beide Probentypen, indem Sie sie durch eine Reihe von abgestuften Alkoholbädern dehydrieren. Entfernen Sie den Alkohol mit einem geeigneten Reinigungsmittel, gefolgt von einer Wachsinfiltration. Betten Sie die Kassette in flüssiges Paraffinwachs ein und lassen Sie sie erstarren. Dadurch bildet sich eine Schicht um das Gewebe, die die Probe an Ort und Stelle hält.

Verwenden Sie ein Mikrotom, um dünn geschnittene Abschnitte zu erhalten. Legen Sie die Abschnitte auf positiv geladene Glasobjektträger, um die Haftung zu erleichtern. Trocknen und beizen, um Objektträger unter dem Mikroskop zu betrachten. Im folgenden Protokoll demonstrieren wir Techniken zur Probenvorbereitung aus Lungentumorgewebe und zytologischen Proben.

Zu Beginn fixieren Sie das Tumorgewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin in einer Kassette und betten Sie die Kassette in Paraffin ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Betten Sie das infiltrierte Gewebe in eine Form ein, die mit geschmolzenem Paraffin gefüllt ist. Lassen Sie das Taschentuch in der Form bleiben, bis sich das Paraffin verfestigt hat. Danach wird das in Paraffin eingebettete Gewebe mit einem Mikrotom in einer Dicke von drei Mikrometern geschnitten.

Übertragen Sie das Paraffinband auf einen positiv geladenen Objektträger aus Glas. Anschließend trocknest du den Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie zunächst die Bronchialwaschungen in einer Konservierungslösung. Übertragen Sie die Waschmittel in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie zwei Gramm DL-Dithiothreitol hinzu und wirbeln Sie die Tube 30 Minuten lang ein. Dann zentrifugieren Sie bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter einer mukolytischen Lösung hinzu. Die Probe wird 20 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit geschüttelt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 250 g zentrifugiert. Entfernen Sie danach den Überstand und geben Sie das Zellpellet in ein Sammelröhrchen, das 10 % neutral gepuffertes Formalin enthält.

Fügen Sie vier Tropfen eines Zellblockvorbereitungsmittels hinzu. Übertragen Sie das Zellpellet auf eine Kassette. Fixieren Sie das Zellpellet für die Paraffineinbettung und -sektion mit dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Vorbereitung von Tumorgewebeproben.