Immunfluoreszenz-Assay: Eine Methode zur Identifizierung von Tumorzellen, die auf einem medizinischen Draht eingefangen wurden

0 Ansichten4:32 Min. • April 30th, 2023

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- Nehmen Sie einen funktionalisierten Draht mit einem kleinen Goldanteil, der mit einem Hydrogel beschichtet ist, das mit Antikörpern von Interesse gekoppelt ist. Tauchen Sie den Goldteil des Drahtes in ein Fläschchen mit Tumorzellen. Verschließen Sie es mit einem Drahtstopfen und inkubieren Sie es in einem Röhrchenrotator. Die zirkulierenden Tumorzellen oder CTCs, die Oberflächenantigene aufweisen, binden an die Antikörper auf dem Draht. Spülen Sie den Draht, indem Sie ihn in Fläschchen tauchen, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS enthalten, und an der Luft trocknen. Tauchen Sie nun den Draht in eine Acetonlösung, um die Zellen durch Dehydrieren zu fixieren.

Führen Sie anschließend den Draht vorsichtig durch eine P200-Spitze mit dem funktionalisierten Teil darin. Füllen Sie das Band mit einem Antikörper, der mit einem Fluorochrom konjugiert ist, um den Draht einzutauchen. Diese markierten Antikörper binden an ihre jeweiligen Antigene, die auf den Zellen vorhanden sind. Verschließen Sie die Öffnung mit einer Laborfolie und inkubieren Sie sie über Nacht im Dunkeln bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend den Draht mit PBS, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Legen Sie den Draht in einen Drahthalter und betrachten Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die durch Antikörper gebundenen CTCs fluoreszieren auf dem Draht. Im folgenden Protokoll werden wir CTCs auf einem medizinischen Draht erfassen und durch Immunfluoreszenzfärbung identifizieren.

- Zu Beginn des Versuchs wird der gesamte Inhalt eines T75-Kolbens, der zu 80 % in einem 5-Milliliter-Fläschchen konfluiert, mit 4 Millilitern vollständigem Medium resuspendiert. Entfernen Sie als Nächstes den Draht aus der Glasverpackung. Tauchen Sie den funktionalisierten Goldteil des Drahtes in das Fläschchen und stellen Sie sicher, dass der Drahtstopfen wasserdicht für ein 5-Milliliter-Fläschchen passt. Versiegeln Sie den Draht mit Laborfolie. Inkubieren Sie den Draht dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Röhrenrotator. Spülen Sie den Draht nach der Drehung dreimal in einer gefalteten PBS-Lösung mit drei verschiedenen sauberen Fläschchen und warten Sie, bis der Draht getrocknet ist.

Nachdem Sie den Draht 10 Minuten lang in einer Haube an der Luft getrocknet haben, fixieren Sie die Zellen, indem Sie den Draht 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%ige Acetonlösung in ein 5-Milliliter-Röhrchen tauchen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Spuren von Aceton auf der funktionalisierten Spitze befinden. Trocknen Sie den Draht 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Waschen Sie den Draht anschließend in einer 5-Milliliter-Tube zweimal in einer Falte PBS. Inkubieren Sie den Draht in Antikörperverdünnungspuffer.

Bereiten Sie 150 Mikroliter Antikörpermischung mit einer Verdünnung aus monoklonalem Primärantikörper, konjugiert mit Fluorochrom, und Antikörperverdünnungspuffer vor, wie im Datenblatt angegeben. Ziehen Sie dann den Draht mit einer P200-Spitze aus dem Drahtstopper heraus und führen Sie den Draht vorsichtig durch das größere Loch der Spitze ein. Führe zuerst das unfunktionalisierte Ende ein und ziehe den Draht langsam durch das kleinere Loch, bis der Goldteil knapp hinter dem größeren Loch ist. Geben Sie vorsichtig 150 Mikroliter des Antikörpermixes in die Spitze.

Um die Gefahr der Blasenbildung zu vermeiden, drehen Sie den Draht vorsichtig, bis das funktionalisierte Ende vollständig eingetaucht ist. Verschließen Sie das Loch der Spitze und wickeln Sie Laborfolie um das Loch. Inkubieren Sie den Draht vertikal über Nacht im Dunkeln bei 4 Grad Celsius. Blockieren Sie am zweiten Tag die Antikörperinkubation, indem Sie den Draht zweimal in einer Falte PBS waschen. Stecken Sie den Draht wieder in den Drahtstopper.

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