Konservierung von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE): Eine Methode zur Untersuchung der Gewebemorphologie

- Legen Sie zunächst eine Gewebescheibe auf ein mit PBS getränktes Filterpapier, um ein Schrumpfen oder Anschwellen der Zellen zu verhindern, indem Sie die Osmolarität ausgleichen. Übertragen Sie das Gewebe auf eine Histo-Kassette. Schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in neutral gepuffertes Formalin, NBF-Lösung. NBF enthält Formaldehyd, das an Aminogruppen von Aminosäuren bindet und die Bildung von Ameisensäure verhindert, die das Gewebe pigmentiert. Lassen Sie die Kassette über Nacht bei niedriger Temperatur, was den Abbau der Nukleinsäuren verhindert und das Gewebe fixiert. Dehydrieren Sie das Gewebe mit mehreren Waschgängen mit Alkohol.

Lege es in flüssiges Paraffin und drücke es bis zum Boden der Form. Entfernen Sie das Gewicht und legen Sie die Unterseite der Histo-Kassette auf das Taschentuch. Gießen Sie flüssiges Paraffin auf die Baugruppe. Lassen Sie das Setup auf einer kalten Platte erstarren. Paraffin ist wasserunlöslich und härtet nach dem Eindringen in das dehydrierte Gewebe aus und hilft beim Schneiden. Übertragen Sie den Gewebeblock auf ein Mikrotom. Schneiden und sammeln Sie dünne Schnitte des Gewebes auf einem Objektträger. Wenn der Abschnitt zu dick ist, können Sauerstoff und andere Nährstoffe nicht über die Scheibe diffundieren, wodurch ein falscher Nekrosegradient entsteht. Ist die Partie zu dünn, dann neigt sie dazu, sich zu kräuseln. Das Protokollvideo untersucht die Expression von Biomarkern und die Zellviabilität aus FFPE-Geweben von Lungenkrebs.

- Um mit dem Fixieren der gewünschten Scheibe zu beginnen, geben Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette in eine 10 Zentimeter große Platte, die ein getränktes Filterpapier enthält, das mit 2 bis 3 Millilitern PBS gefüllt ist, und lassen Sie es schwimmen. Heben Sie dann das Filterpapier mit einer Pinzette heraus und legen Sie es in eine Histo-Kassette. Übertragen Sie das Filterpapier in eine Histo-Kassette. Geben Sie einen Tropfen verdünntes Hämatoxylin auf die Gewebescheibe, um die Position der Scheibe für die nachfolgenden Schritte zu markieren. Schließen Sie die Kassette und geben Sie sie in eine 4%ige neutrale gepufferte Formalinlösung und lassen Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius stehen. Öffnen Sie nach dem Waschen und der Verarbeitung der Kassette, wie im Protokoll beschrieben, die Histo-Kassette und heben Sie die feste Scheibe vorsichtig mit einem Skalpell vom Filterpapier ab. Entsorgen Sie das Filterpapier und geben Sie die Scheibe in eine Form mit flüssigem Paraffin.

Verwenden Sie ein flaches Gewicht, um das Gewebe gegen den Boden der Einbettungsform zu drücken, um eine gleichmäßige Schnittbildung zu gewährleisten. Legen Sie den unteren Teil der Histo-Kassette auf die Form, fügen Sie flüssiges Paraffin hinzu und lassen Sie die Form 30 Minuten lang auf einer kalten Platte abkühlen. Trennen Sie danach die abgekühlte Form vom Paraffinblock. Verwenden Sie ein Mikrotom, um 4 Mikrometer dünne Schnitte der FFPE-Gewebeschnittblöcke herzustellen. Schneiden Sie den Überschuss an Paraffin ab, der das Gewebe umgibt. Um gleichmäßige Schnitte im gesamten Gewebe zu erhalten, stellen Sie den Winkel des Blocks so ein, dass die Oberfläche des Blocks horizontal in Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist. Entnehmen Sie mit einem dünnen Pinsel sequenzielle Gewebeschnitte der in Paraffin eingebetteten Gewebescheibe, beginnend im oberen Teil der Objektträger. Sammeln Sie die Abschnitte der tieferen Gewebeschichten weiter zur Mitte, gefolgt vom unteren Teil der Objektträger.

- Die Entnahme von Schnitten aus verschiedenen Schichten jeder Gewebescheibe zu den Objektträgern erfolgt, um die Erfassung potenzieller kulturinduzierter Gradienten in Bezug auf Lebensfähigkeit, Zellmigration oder Biomarkerexpression zu ermöglichen.

- Nachdem Sie die Abschnitte gesammelt haben, fahren Sie mit ihrer Verarbeitung und weiteren Analyse fort, wie im Protokoll beschrieben.