Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

Hallo, mein Name ist Marcos. Ich arbeite mit Professor Roman Stalker am MIT Civil Environmental Engineering und werde Ihnen zeigen, wie man einen Mikrokanal mithilfe der Selbstbelichtungstechnik herstellt. Als Erstes müssen wir eine Maske entwerfen.

Das ist also die Maske, die im Wesentlichen das endgültige Design des Mikrokanals darstellt, den wir herstellen möchten. Dies ist ein Design eines Injektors, mit dem wir eine dünne Nährlagenschicht erzeugen können, in der Mikroorganismen schwimmen, und wir beobachten, wie die Chemotaxis abläuft. Außerdem ist hier ein Seitenkanal für einen Hohlraum vorhanden, um innerhalb des Hohlraums einen Mikrowirbel zu erzeugen. Später wird ein Video gezeigt, das dies veranschaulicht. Nachdem wir die Maske erhalten haben, nehmen wir die Wafer mit in den Reinraum und legen sie in die Petrischale. Und jetzt begeben wir uns in den Reinraum.

Okay, nachdem unsere Maske gedruckt und bereit ist, befinden wir uns nun im Reinraum, um die eigentlichen Mikrofertigungen durchzuführen. Als Nächstes nehme ich ein sauberes Waferstück, das ich gerade erworben habe, und möchte sicherstellen, dass es mithilfe der folgenden drei Lösungsmittel besonders sauber ist. Der erste Schritt besteht darin, es zunächst mit Aceton und anschließend unmittelbar mit Methanol zu reinigen.

Und dann ist der letzte Schritt Isopropanol. Wir arbeiten auf der glänzenden Seite des Wafers, die für die Beschichtung vorbereitet ist. Und nun werde ich ihn mit Stickstoff abtrocknen.

Nach dem Trocknen des Wafers geben wir diesen nun in einen Ofen bei etwa 130 Grad Celsius und backen ihn fünf bis zehn Minuten lang. Währenddessen, während wir auf das Backen des Wafers warten, können wir die beiden Heizplatten vorbereiten, eine bei 65 Grad Celsius und die andere bei 95 Grad Celsius. Nach fünfminütigem Backen nehmen wir den Wafer aus dem Ofen und lassen ihn etwa fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.

Dann sind wir bereit für das Spin-Beschichten. Bevor wir den Fotolack auftragen, müssen wir sicherstellen, dass sich keine Staubpartikel darauf befinden; dazu verwenden wir Stickstoff, um die Oberfläche des Wafers von der Mitte nach außen abzuspritzen.

Ich werde nun den Fotolack auf diesen Wafer gießen. Wir geben eine Menge von etwa drei Millilitern auf. Versuchen Sie, die Flasche so niedrig wie möglich zu halten, um zu verhindern, dass beim Aufgießen des Fotolacks auf den Wafer Blasen entstehen.

Lassen Sie nun den Fotolack etwa eine Minute lang auf dem Wafer ruhen, bevor wir mit dem Beschichten beginnen. Wie bereits erwähnt, werde ich eine Beschichtung mit einer Dicke von hundert Mikrometern herstellen. Daher stellen wir die gesamte Spinnzeit auf 55 Sekunden ein und können nun mit dem Spinnen beginnen.

Zunächst versuchen wir, die Drehzahl innerhalb von fünf Sekunden von null auf 500 U/min zu erhöhen und etwa 10 Sekunden lang weiterlaufen zu lassen, sodass sichtbar wird, dass der Fotolack die gesamte Waferoberfläche bedeckt. Danach erhöhen wir die Drehzahl auf etwa 3000 U/min für sieben Sekunden und lassen den Wafer weitere 30 Sekunden lang rotieren. Nachdem der Wafer mit Fotolack beschichtet wurde, lege ich ihn nun auf die Heizplatte und führe eine weiche Aushärtung bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten sowie bei 95 Grad Celsius für 20 Minuten durch. Sobald die weiche Aushärtung bei 95 Grad Celsius abgeschlossen ist, kühlen wir den Wafer auf Raumtemperatur ab. Vorher kühlen wir ihn jedoch etwa zwei bis drei Minuten lang auf 65 Grad Celsius ab, um einen zu schnellen Temperaturabfall zu vermeiden.

Und dann stellen wir es etwa fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zum Abkühlen ab. Nun werde ich es mit UV-Licht bestrahlen, sodass der belichtete Bereich aushärtet und der nicht belichtete Bereich später weggewaschen wird. Hier verwenden wir die Maske, und wie Sie sehen können, besteht die Maske aus zwei Teilen: einem transparenten Bereich und einem anderen, der vollständig lichtundurchlässig beziehungsweise schwarz ist, in dieser Einstellung.

Ich werde diese Maske nun auf den beschichteten Wafer legen. Die Maske, die Sie vom Druckunternehmen erhalten, hat zwei Seiten. Eine ist die Seite, auf der sie mit der Tinte gedruckt wurde.

Und dies ist eine Stelle, die Sie mit dem Wafer in Kontakt bringen möchten. Nun werde ich den Wafer durch die Maske hindurch mit UV-Licht belichten. Aus Sicherheitsgründen werde ich diese Schutzbrille tragen.

Die Belichtungsdauer hängt von der verwendeten SUA sowie von der angestrebten Schichtdicke ab. Nach der Belichtung lege ich den Wafer auf die 65 °C heiße Heizplatte und backe ihn erneut fünf Minuten lang ein, anschließend bei 95 °C für 20 Minuten. Ich weise darauf hin, dass die Backdauer je nach gewünschter Dicke und je nach verwendeter Methode variieren kann.

Nach diesem Punkt werden wir den Wafer entwickeln. Entwickeln bedeutet, dass wir den unerwünschten Teil des Fotolacks entfernen, sodass nur der belichtete Bereich auf dem Wafer verbleibt. Um den Wafer zu entwickeln und den unerwünschten Teil des Fotolacks wegzuspülen, verwenden wir das Entwicklermittel.

In diesem Fall verwende ich Pomonalacetat als Entwickler und werde dieses Lösungsmittel in diesen Becher geben, dann den Wafer hineinlegen und ihn etwa 10 Minuten lang eintauchen. Auch hier variiert die Zeit je nach Dicke und dem verwendeten Lösungsmittel. Zehn Minuten später sehen Sie, dass auf dem Wafer nun das gewünschte Kanal-Design verblieben ist, während alle unerwünschten Bereiche abgewaschen wurden; lediglich eine Spülung wird noch gegeben.

Wir verwenden dasselbe Lösungsmittel, ein frisches, denselben Polyvinylacetat, und spritzen es einfach auf die Oberseite des Wafers, um ihn abzuspülen. Und schließlich spülen wir das Lösungsmittel mit Isopropanol ab. Anschließend trocknen wir es mit Stickstoff ab.

Und nun haben Sie einen sauberen Wafer mit dem gewünschten Muster darauf. Dies bezeichnen wir als Master. Nun kehren wir in unser Labor zurück, um PDMS darauf zu gießen und den Rest des Verfahrens fortzusetzen.

Jetzt sind wir wieder aus dem Reinraum zurück und haben die Masterform, die im Grunde die Negativform für das darstellt, was wir als Gussform verwenden werden. Als Nächstes gießen wir PDMS, ein Polymer, das aushärten wird. Wie Sie sehen können, entstehen durch das Gießen eines Polymers auf diese Form Rillen an der Oberfläche des Polymers, und letztendlich bildet das Polymer nach der Bindung an eine Glasplatte selbst den Kanal.

Jetzt bereiten wir das PDMS vor. Dies ist das PDMS, also das Polymer, das Polydimethylsiloxan PDMS. Und dies ist ein Härter.

Was ich tun werde, ist, dieses Härter in diesen Becher zu gießen und dieses PDMS in diesen Becher zu gießen und beides im Verhältnis 1 zu 10 zu mischen. Daher möchten wir im Allgemeinen einen Spatel verwenden, um es homogen umzurühren. Während wir umrühren, entstehen viele Blasen, und die Blasen dienen gewissermaßen als Indikator dafür, ob wir gründlich gerührt haben oder nicht.

Nun, nachdem wir das PDMS mit dem Härter gemischt haben, können wir diese Mischung auf das Master, einen Wafer, gießen. Um sicherzustellen, dass der Wafer während des Gießens nicht verrutscht, haben wir ihn mit einem Klebeband fixiert. Bevor die PDMS-Mischung auf den Wafer gegossen wird, sollte der Wafer so sauber wie möglich von Staub, der möglicherweise darauf gelandet ist, befreit werden.

Wir schalten nun den Kompressor ein, um das Wafer zu entstauben. Wie Sie sehen, enthält das PDMS viele Blasen. Wir werden die Blasen entfernen, indem wir es in eine Vakuumkammer geben.

Das Evakuieren dauert also etwa 30 Minuten, um alle Blasen zu entfernen. Sobald die Blasen vollständig entfernt sind, nehmen wir die Probe heraus und geben sie in einen Ofen bei 65 Grad Celsius, wo sie mindestens 12 Stunden lang ausgehärtet wird. Nach Ablauf dieser 12 Stunden ist der Wafer bereit zum Schneiden.

Ich werde dieses Messer verwenden, um das PDMS zu schneiden und das PDMS vom Wafer zu lösen, und dann diesen Lochstecher verwenden, um die Öffnungen für die Ein- und Auslässe der Schläuche zu stanzen. Wenn Sie schneiden, sollten Sie das Messer so ansetzen, dass es den Wafer berührt, aber nicht zu viel Druck ausüben, damit Sie den Wafer nicht beschädigen, und entlang Ihres Kanals ausschneiden. Heben Sie es nun vorsichtig ab.

Haben Sie, jetzt können Sie sehen, dass dies der Kanal ist, der das Muster vom Wafer zeigt. Sie können also erkennen, dass sie identisch sind. Und nun wurde dieses Muster in dieses Polymer, in dieses PDMS, eingraviert.

Und sobald sie dies auf einem Glaslicht verbinden, wird dies der Kanal für unser Experiment sein. Der nächste Schritt, der wichtig ist, besteht darin, daran zu denken, Löcher zu stanzen, damit wir nach dem Stanzen der Löcher in die Mikrokanäle in das PDMS Ein- und Auslässe in die Mikrokanäle einfügen können. Daher haben wir Klebeband verwendet, um es auf der Kanalseite, also dort, wo die Nut ist, festzukleben.

Der Grund, warum wir diesen Kanal mit Klebeband abkleben, besteht darin, alle Staubpartikel zu entfernen. Der nächste Schritt ist die Plasma-Bindung. Vor der Plasma-Bindung, die wir im anderen Labor durchführen werden, nehmen wir das Klebeband ab und legen die Oberfläche frei, die wir verbinden möchten – also diese Oberfläche und den Objektträger – und setzen sie anschließend dem Sauerstoff-Plasma aus. Danach bringen wir beide Teile zusammen, wodurch sie miteinander binden.

Hallo, mein Name ist Justin Seymour und ich bin Postdoktorand in Romans Stockers Labor am MIT. Meine Forschung konzentriert sich auf die Mikrobielle Ökologie, genauer gesagt darauf, wie marine Mikroben Nahrungsansammlungen im Ozean finden können. Dazu nutzen wir Mikrofluidik-Techniken, um solche Muster zu untersuchen.

Wir werden also den Kanal verwenden, dessen Herstellung Marcus zuvor demonstriert hat, und zwar nach der Plasma-Bindung. Danach können wir ihn in einem mikrofluidischen Experiment frei verwenden. Vor diesem Experiment müssen wir die Substrate, die wir verwenden werden, vorbereiten.

Und in dem heutigen Experiment werden wir untersuchen, wie das marine Phytoplankton *Dinoflagellate tur* elektro in der Lage ist, mikroskalige Nahrungsinseln zu finden. In diesem Fall handelt es sich um Ammonium, das wir in einer Konzentration von hundert Mikromolar bereitstellen werden. In diesen Experimenten können wir die Nahrungsinseln sichtbar machen, indem wir einen fluoreszierenden Farbstoff zu den Nährstoffen hinzufügen, die wir den Organismen zur Verfügung stellen.

Daher verwenden wir den Farbstoff Fluorescein. Hier pipettiere ich Fluorescein in einer Endkonzentration von 100 Mikromolar zum Ammonium, das wir als Nährstoff nutzen. Anschließend können wir diesen Nährstoff mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen, was es uns ermöglicht, die Ausbreitung eines Nährstoffflecks zu verfolgen und die Reaktion von Organismen auf diesen Nährstofffleck zu untersuchen.

Bei den Mikrofluidik-Experimenten verwenden wir Glasspritzen. Als Erstes müssen wir daher unsere Substrate und Organismen in die Spritzen einfüllen, die wir verwenden werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Schläuche in die mikrofluidische Apparatur einzuführen.

Und dies tun wir am Mikroskopständer. Wir platzieren unseren mikrofluidischen Kanal auf dem Mikroskopständer und führen anschließend Schläuche in die Ein- und Ausgänge ein. Danach fügen wir ein Abfallreservoir hinzu und stellen sicher, dass das Reservoir zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt ist, sodass die Schläuche im Abfallreservoir vollständig untergetaucht sind.

Dadurch können wir einen konstanten Druck innerhalb des Kanals aufrechterhalten. Anschließend befestigen wir Spritzen an der Schlauchleitung, die den mikrofluidischen Kanal versorgt, in dem sich die Organismen befinden – in diesem Fall donella, lector – sowie das Nährsubstrat, hier Ammonium. Danach richten wir das Mikroskop ein und betrachten den mikrofluidischen Kanal in der geeigneten Position, bevor wir mit den Experimenten beginnen.

Wenn sich der Kanal in Position befindet, wechseln wir zur Ansicht des Kanals mit der Kamera und können ihn am Computer visualisieren. Nun können wir feinere Einstellungen an der Fokussierung vornehmen und den Injektor, über den wir Nährstoffe injizieren, sichtbar machen. Dieser besteht aus einer 100 Mikrometer durchmessenden Nadelspitze, die in den mikrofluidischen Kanal integriert ist.

Und wir können einen Nährstoffgradienten erzeugen, indem wir diese injizieren. Ab diesem Zeitpunkt, vor Beginn der Experimente, müssen wir alle Blasen entfernen, die möglicherweise in das Mikrofluidiksystem gelangt sind. Dies tun wir, indem wir in diesem Fall eine Spritze verwenden, die mit künstlichem Meerwasser gefüllt ist und über ein Ventil mit dem Mikrofluidikkanal verbunden werden kann.

Und dann drücken wir diese Spritze, um Blasen aus dem Kanal zu entfernen. Blasen können auf zwei Arten entfernt werden: entweder indem man sie durch den von der Spritze erzeugten Druck über den Auslass herauspresst, oder indem man sie durch die Wände des PDMS-Materials zwingt, das für Gase durchlässig ist. Sobald die Blasen entfernt sind und wir bereit sind, das Experiment zu beginnen, stellen wir mithilfe einer Spritzenpumpe die geeigneten Flussraten für die Injektion und die Zufuhr der Materialien in den Kanal ein.

In diesem Fall verwenden wir eine Flussrate von zwei Mikrolitern pro Minute, was einer Flussgeschwindigkeit im Kanal von 266 Mikrometern pro Sekunde entspricht. Sobald wir die geeignete Flussrate eingestellt haben, können wir das Experiment starten, indem wir den Fluss beginnen, wodurch ein dünnes Nährstoffband entsteht. Wir können die Nährstoffe sichtbar machen, während sie vom Injektionspunkt aus in den Kanal injiziert werden, indem wir Fluoresceinfarbstoff zu den Nährstoffen hinzufügen und sie mittels APF-Fluoreszenzmikroskopie visualisieren. Anschließend können wir die Dynamik der Nährstoffflecken untersuchen, indem wir den Fluss im Mikrofluidikkanal stoppen und das seitliche Diffundieren des Nährstoffbands von seiner ursprünglichen Position aus beobachten.

Anschließend wechseln wir zur Phasenkontrastmikroskopie, um die im Kanal schwimmenden Organismen zu visualisieren und ihre Positionen in Bezug auf die Nährstoffinsel zu untersuchen. Dies ermöglichen wir uns, indem wir eine Abfolge von Einzelbildern mit einer Bildrate von 10 pro Sekunde aufnehmen, wodurch ein Film entsteht, in dem wir diese Organismen beobachten können. Die schwimmenden Organismen können wir anschließend visualisieren, indem wir Zeitdifferenzen zwischen zwei einzelnen Bildern ermitteln, bei denen ein Bild vom vorherigen subtrahiert wird, sodass nur die sich bewegenden Objekte sichtbar werden.

So können wir das Hintergrundrauschen aus den Bildern entfernen. Anschließend nehmen wir Filme in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von 10 bis 20 Minuten nach der anfänglichen Freisetzung des Nährstoffflecks auf. Mithilfe einer Bildanalyse-Software, mit der wir die Positionen der Organismen von einem Bild zum nächsten überlagern, können wir die Positionsänderungen dieser Organismen verfolgen, um Informationen über ihre Schwimmtrajektorien zu erhalten, aus denen wir anschließend detailliertere Angaben zu ihren Schwimmstatistiken – einschließlich Geschwindigkeiten und Richtungsänderungen – ableiten können.

Diese Experimente haben es uns erstmals ermöglicht, direkt zu untersuchen, wie marine Mikroben in der Lage sind, nährstoffreiche mikroskalige Flecken zu finden und zu nutzen. Dies könnte wichtige Auswirkungen auf trophische Dynamiken und den Nährstoffkreislauf im Ozean haben. Wie Justin bereits erwähnte, kann die Art und Weise, wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, mit ihrer Nahrung im Ozean interagieren, zahlreiche Auswirkungen auf biochemische Kreisläufe haben.

Dennoch ist der Ozean im Hinblick auf Strömungsbedingungen wie Turbulenzen, die durch Wind oder an der Oberfläche entstehen, sehr komplex, und diese Aspekte werden bisher kaum berücksichtigt. Auf der Skala von Mikroorganismen ist das, was sie wahrnehmen und erleben, nicht die große Turbulenz, sondern vielmehr die Scherkräfte und die kleinsten Überreste der Turbulenz, die als Kolmogorow-Wirbel bekannt sind. Was wir hier untersuchen möchten, ist die Wirkung dieser Wirbel auf das Annahmeverhalten von Mikroorganismen.

Und um dies zu erreichen, erstellen wir einen weiteren Kanal unter Verwendung dieser Masse, die ich Ihnen zuvor gezeigt habe. In der Mitte befindet sich ein Hohlraum. Ich werde das Diagramm nun vergrößert darstellen.

So sehen die Kanäle aus: Wir haben hier die Ansicht von oben, und wir leiten den Fluss von links nach rechts ein. Aufgrund der Scherkräfte entsteht ein Rezirkulationsbereich innerhalb dieses Hohlraums. Dieser Hohlraum stellt eine Darstellung eines Graphen Addis dar. Wir können denselben Versuchsaufbau verwenden, den Justin bereits zuvor erklärt hat. Wenn die Spritzenpumpe ausgeschaltet ist und ich keinen Fluss aktiviert habe, sehen Sie, dass die Bakterien ziemlich zufällig und ungehindert innerhalb dieses Hohlraums schwimmen.

Und es gibt keine bevorzugte Orientierung. Der Film, den Sie sehen, ist ein Differenzzeitfilm, bei dem genau dieselbe Technik verwendet wird, die Justin anwendet. Wenn die Strömung sehr schnell ist, wie Sie sehen können, werden die Bakterien durch den Wirbel abtransportiert.

Und die Bahn der Bakterien selbst folgt der Stromlinie des Wirbels. Doch eigentlich noch interessanter ist das Folgende, wenn wir die Spritzenpumpe einschalten. Allerdings ist die Geschwindigkeit nicht sehr hoch.

Es ist nicht zu schnell, dass die Bakterien dagegen ankämpfen könnten. Doch in gewisser Weise kann man im Film immer noch eine Wirbelstruktur erkennen. Aus diesem Experiment haben wir gelernt, dass die Bakterien in Gegenwart einer sehr starken Turbulenz der Strömung ausgeliefert sind und nicht in der Lage sind, der Strömung entgegenzuwirken.

Jedoch sind sie in einem Bereich mit leichter Turbulenz weiterhin in der Lage, sich nach eigenem Ermessen fortzubewegen.