ex vivo T-Zell-Stimulation im Pankreastumor: Eine Methode zur Steigerung der Zytokinproduktion in T-Zellen

- Aktivierte T-Zellen bewegen sich in die Mikroumgebung des Pankreastumors, wo sie Zytokine wie Interferon-gamma oder IFN gamma und Tumornekrosefaktor-alpha oder TNF alpha freisetzen, die eine wirksame Antitumorantwort vermitteln. Da sich Zytokine schnell aus der T-Zelle entfernen, können die intrazellulären Spiegel nicht nachweisbar sein. Daher benötigt die T-Zelle eine Stimulation, um die Produktion von basalen Zytokinen zu erhöhen, um ihre therapeutische Rolle im Tumor zu untersuchen.

Beginnen Sie mit der Entnahme einer Suspension von Tumorzellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus. Behandeln Sie nun die in Zellsuspension vorhandenen T-Zellen mit einem Zytokin-Stimulationscocktail und inkubieren Sie die Mischung für die gewünschte Zeit. Dieser Cocktail erleichtert die Freisetzung von Kalziumionen aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytoplasma. Ein hoher Kalziumspiegel aktiviert wiederum bestimmte nukleäre Transkriptionsfaktoren, was zu einer Erhöhung der Zytokinproduktion in den T-Zellen führt.

Behandeln Sie anschließend die Zellen mit einem Proteintransporthemmer-Cocktail und inkubieren Sie das Röhrchen. Dieser Cocktail blockiert den Transport von Zytokinen vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Komplex, was zu einer Akkumulation von Zytokinen innerhalb der Zelle führt. Färben Sie die Zellen schließlich mit geeigneten intrazellulären Markern für die Durchflusszytometrie-Analyse. Im folgenden Protokoll werden wir eine T-Zell-Stimulation durchführen, um die intrazelluläre Konzentration von Zytokinen zu erhöhen.

- Übertragen Sie den Tumor zunächst mit einer Pinzette auf eine Petrischale. Lagern Sie 5 Milliliter Aufschlussmedium in einem 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis, um den Beginn der Enzymaktivität zu verhindern. Nehmen Sie ein kleines Aliquot dieser Lösung, um den Tumor auf der Petrischale zu bedecken. Schneide den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette in kleine Stücke von etwa weniger als 3 Millimetern Länge. Kratzen Sie die Tumorstücke in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, bis alle Stücke in Aufschlussmedium eingetaucht sind. Übertragen Sie das Röhrchen für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auf ein Schüttelgerät, um es zu verdauen. Stellen Sie sicher, dass alle Tumorstücke untergetaucht sind und nicht am Rand der Röhre kleben.

Stellen Sie das Röhrchen unmittelbar nach dem Verdauungsschritt auf Eis, um die Enzymaktivität zu verlangsamen. Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen, und wirbeln Sie die Probe kurz vortexen, um sie zu mischen, um die Enzymaktivität weiter zu verlangsamen. Öffnen Sie das Röhrchen und spülen Sie den Deckel des Röhrchens mit frischem RPMI-Medium ab. Bereiten Sie dann ein 70-Mikron-Sieb vor. Lege es auf ein offenes 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Befeuchten Sie den Filter mit Medium. Resuspendieren Sie die verdauten Zellen und waschen Sie die Seiten des Röhrchens mit einem 25-Milliliter-Streifen oder größer. Durch die breitere Öffnung der Stripette kann der dicke Aufschluss leicht passieren

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Übertragen Sie den gesamten Aufschluss mit dem 25-Milliliter-Stripette auf das Sieb. Zerdrücken Sie den Tumor auf dem Filter mit einem 1-Milliliter-Spritzenkolben auf und ab. Waschen Sie die Zellen kontinuierlich mit RPMI durch das Sieb. Achten Sie darauf, mit genügend Kraft zu waschen, um die Zellen hindurchzudrücken. Fahren Sie mit dem Waschen fort, bis alle Zellen das Sieb passiert haben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 mal g und 4 Grad Celsius.

Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig und vervollständigen Sie das RPMI und passieren Sie es direkt durch einen anderen Filter, um extrazelluläre Matrix oder große Zellklumpen zu entfernen, die nicht ausreichend resuspendiert werden können. Wenn keine Stimulation erforderlich ist, färben Sie die isolierten Zellen sofort für die Durchflusszytometrie-Analyse oder resuspendieren Sie sie in einem Gefriermedium von 10 % DMSO in FBS und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Um eine Stimulation durchzuführen, zählen Sie zunächst die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen in vollständigem Medium, um eine Konzentration von 2 mal 10 bis 6 pro 100 Mikroliter zu erreichen. Platte 100 Mikroliter Zellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit U-Boden. Fügen Sie 100 Mikroliter vollständiges Medium hinzu, das ein 2X-Präparat aus PMA und Ionomycin enthält. Stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator. Fügen Sie dann 20 Mikroliter eines 10-fachen Präparats aus Brefeldin-A und Monensin und dem vollständigen Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 1,06 Mikromolar bzw. 2,0 Mikromolar zu erreichen. Legen Sie die Platte für weitere vier Stunden wieder in den Inkubator.