Extrazellulärer Flux-Assay in 3D-Sphäroiden: Eine Methode zur Messung der metabolischen Aktivität von Pankreastumor-Sphäroiden

- Bauchspeicheldrüsenkrebszellen interagieren mit krebsassoziierten Fibroblasten in der Tumormikroumgebung (TME). Diese Wechselwirkungen modulieren die Stoffwechselaktivität der Krebszellen und beeinflussen das Fortschreiten der Krebserkrankung.

Sphäroide sind die zellulären Aggregate, die das TME in vitro rekapitulieren. Daher können wir diese Sphäroide verwenden, um die Veränderungen in den Stoffwechselfunktionen des Tumors mit Hilfe eines extrazellulären Flux-Assays zu testen. Dieser Assay misst die extrazelluläre Konzentration von Sauerstoff und Protonen, um den aeroben bzw. glykolytischen Stoffwechsel zu bestimmen.

Beginnen Sie mit der Einnahme von 3D-Sphäroiden in geeigneter Größe, die durch Co-Kultivierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen mit Bauchspeicheldrüsenfibroblasten hergestellt wurden. Übertragen Sie nun die Sphäroide in eine Flussmittelanalyseplatte und bedecken Sie diese mit einer Sensorkartusche, die Testmedikamente enthält. Führen Sie den Assay in einem extrazellulären Flussanalysator durch.

Der Flussmittelanalysator injiziert Testmedikamente pneumatisch zu bestimmten Zeitpunkten aus der Sensorkartusche auf die Analyseplatte. Als Reaktion auf die Testmedikamente geben die Zellen Protonen und Sauerstoff in die Mikrokammer der Platte ab, und die in der Sensorsonde vorhandenen Fluorophore messen diese Werte. Analysieren Sie abschließend mit entsprechender Software die Funktionalität der Sphäroide.

Im folgenden Protokoll werden wir eine Methode zur Messung der metabolischen Funktion der in 3D-Sphäroiden vorhandenen Pankreastumorzellen mit Hilfe des extrazellulären Flux-Assays demonstrieren.

Hydratisieren Sie die Sondenkartusche am Tag vor dem Stoffwechsel-Assay mit 200 Mikrolitern Assay-Kalibrant pro Vertiefung in der mitgelieferten Utility-Platte und inkubieren Sie die Utility-Platte über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Nicht-CO2-Inkubator.

Beobachten Sie am nächsten Morgen die Sphäroide in der Wachstumsfuge unter einem Lichtmikroskop, um ihre Morphologie und Gesamtgleichmäßigkeit zu überprüfen. Übertragen Sie die Wachstumsfuge auf einen magnetischen Halteantrieb und saugen Sie vorsichtig ca. 120 Mikroliter Wachstumsmedium pro Vertiefung an.

Waschen Sie die Sphäroide dreimal vorsichtig mit 120 Mikrolitern erwärmtem Untersuchungsmedium. Nach dem letzten Waschen untersuchen Sie die Sphäroide erneut unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht weggespült wurden, und geben Sie 180 Mikroliter warmes Assay-Medium in jede Vertiefung

.

Verwenden Sie eine breite gebohrte Spitze, um vorsichtig ein einzelnes vorgewaschenes Sphäroid aus der zellabweisenden Wachstumsplatte zu aspirieren, und übertragen Sie das Sphäroid vorsichtig direkt in die Mitte einer Vertiefung einer Sphäroid-Assay-Platte, so dass das Sphäroid durch die Schwerkraft in die zentrale Mikrokammer der Vertiefung fallen kann.

Wenn alle Sphäroide übertragen wurden, legen Sie die Testplatte für eine Stunde in den CO2-freien Inkubator mit 37 Grad Celsius befeuchteter Luft. Richten Sie die Sensorpatrone während der Inkubation so aus, dass sich die Reihen A bis H auf der linken Seite befinden, und platzieren Sie eine Ladeführung so auf der Kartusche, dass sich der Buchstabe des zu ladenden Anschlusses in der oberen linken Ecke befindet.

Wenn die Platte gleichmäßig belastet wurde, öffnen Sie die Analysesoftware, und klicken Sie auf Vorlagen. Doppelklicken Sie auf Leere Vorlage und klicken Sie auf Gruppen generieren. Weisen Sie auf der Registerkarte Plate Map der Assay-Platte Gruppen zu, die dem Versuchsplan entsprechen, und wählen Sie die vier Eck-Wells als Hintergrund-Wells aus.

Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Instrument Protocol" die Optionen "Kalibrieren", "Äquilibrieren" und "Baseline-Messzyklus". Klicken Sie auf Injektionen und definieren Sie die Verbindung für jeden Port. Ändern Sie die Messzyklen auf 6. Überprüfen Sie die Protokoll- und Gruppenzusammenfassung und speichern Sie dann die Assay-Designvorlage.

Verwenden Sie basierend auf dem Assay-Design als Richtschnur eine Mehrkanalpipette, um jedes Reagenz direkt in die Injektionsöffnungen zu dispensieren, wobei Sie die Ladeschablonen mit den Fingerspitzen an Ort und Stelle halten. Wenn alle Reagenzien geladen sind, entfernen Sie die Ladeführung und halten Sie die Patrone auf Augenhöhe, um die Injektionsöffnungen visuell auf eine gleichmäßige Beladung zu überprüfen.

Übertragen Sie die Kartusche und die Utility-Platte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie die Kalibrierung vor dem Assay. Ersetzen Sie nach der Kalibrierung die Versorgungsplatte durch die vorgewärmte Assay-Platte, die die 3D-Sphäroide enthält, und beginnen Sie mit dem Assay. Wenn der Assay abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten in die entsprechende Datenanalysesoftware.